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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 NGS 기법을 이용하여 저어새의 토사물을 분석한 후, 저어새의 먹이생물을 파악하였다. 또한 토사물의 형태학적 분석을 함께 실시하여, 토사물을 이용한 조류의 식이물 연구에 NGS 기법의 적합성을 파악하고자 한다.
제안 방법
- 2016). 따라서 본 연구에서는 NGS 기법을 이용하여 저어새의 토사물을 분석한 후, 저어새의 먹이생물을 파악하였다. 또한 토사물의 형태학적 분석을 함께 실시하여, 토사물을 이용한 조류의 식이물 연구에 NGS 기법의 적합성을 파악하고자 한다.
- 채집된 시료는 즉시 100% ethanol (Merck, product number: 1009831011)로 고정하여 냉장 보관 후 실험실로 운반하여 형태학적인 관찰과 NGS 분석을 실시하였다. 이때 토사물 시료의 채집 과정에서 저어새의 서식지에 머무는 시간을 최소화하기 위하여, 남동유수지의 인공섬 외부에서 쌍안경 (8 ×32,Wholesee)과 망원경(20~60×, Swarovski)을 이용한 모니터링을 실시하였다. 모니터링을 통해 저어새가 먹이활동을 위해 남동유수지에 없는 시간에 주변 식생 및 저어새 서식 환경으로 최대한 영향이 미치지 않도록 주의를 기울이며 토사물 시료를 채취하였다.
- 저어새의 토사물 채집은 저어새가 남동유수지에서 서식하는 6~8월을 중심으로, 2010~2014년 동안 6회에 걸쳐 총 12개의 저어새의 토사물 시료를 채집하였다(Table 1). 채집된 시료는 즉시 100% ethanol (Merck, product number: 1009831011)로 고정하여 냉장 보관 후 실험실로 운반하여 형태학적인 관찰과 NGS 분석을 실시하였다. 이때 토사물 시료의 채집 과정에서 저어새의 서식지에 머무는 시간을 최소화하기 위하여, 남동유수지의 인공섬 외부에서 쌍안경 (8 ×32,Wholesee)과 망원경(20~60×, Swarovski)을 이용한 모니터링을 실시하였다.
- 형태학적 동정을 위한 시료는 토사물의 일부를 증류수로세척한 후, 해부 현미경(SteREO Discovery V12, Carl-Zeiss,Germany)과 광학현미경 (Axio Imager A2, Carl-Zeiss,Germany)으로 분석하였다. 이때 분해되어 형태가 불분명한 먹이생물들은 부속지 등과 같은 분류학적 특징을 이용하여 동정하였으며, 종 특이적 특징이 소실된 생물들은 미동정 생물 조직으로 구분하였다.
대상 데이터
- 이때 토사물 시료의 채집 과정에서 저어새의 서식지에 머무는 시간을 최소화하기 위하여, 남동유수지의 인공섬 외부에서 쌍안경 (8 ×32,Wholesee)과 망원경(20~60×, Swarovski)을 이용한 모니터링을 실시하였다. 모니터링을 통해 저어새가 먹이활동을 위해 남동유수지에 없는 시간에 주변 식생 및 저어새 서식 환경으로 최대한 영향이 미치지 않도록 주의를 기울이며 토사물 시료를 채취하였다. 토사물 채집을 위한 일련의 조사는 인천광역시 연수구의 허가를 득한 후 시행하였다.
- 연구 지역인 남동유수지는 승기천 (인천 남구)의 하류에 위치하며, 과거 갯벌을 매립하여 조성된 남동공단 내의 홍수방지와 하천수의 방류를 목적으로 설치된 인공 저류지이다. 유수지 내에 위치한 원형의 인공섬은 바위와 토사로 이루어져 있으며, 2009년에 저어새의 번식이 확인된 이후 저어새섬으로 불리고 있다.
- 저어새의 토사물 채집은 저어새가 남동유수지에서 서식하는 6~8월을 중심으로, 2010~2014년 동안 6회에 걸쳐 총 12개의 저어새의 토사물 시료를 채집하였다(Table 1). 채집된 시료는 즉시 100% ethanol (Merck, product number: 1009831011)로 고정하여 냉장 보관 후 실험실로 운반하여 형태학적인 관찰과 NGS 분석을 실시하였다.
데이터처리
- 반응이 완료된 유전자 산물은 Qiaquick PCR purification Kit(No. 28104, Qiagen Inc.)로 정제하였으며, 각각의 정제된 PCR 산물은 Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)을 이용하여 QC test를 실시하였다. QC test를 통과한 PCR 산물에서 동량의 DNA를 취한 후 혼합하여Illumina Mi-Seq platform으로 분석하였으며, MiSeq platform에서 생산된 염기서열은 MiSeq Control Software (MCS, ver.
- 2012). 또한 Mothur program을 통해 alpha-diversity (Shannon diversity, Simpson evenness)를 계산하였다(Schloss 2009).
성능/효과
- NGS 분석과 현미경 관찰 결과를 비교하면, 갑각류와 어류가 대부분을 차지하는 것은 비슷하지만 종 수준의 일부 우점생물에서 차이를 보였다. 현미경 분석을 통한 토사물 내 우점종은 칠게와 밀새우로 나타난 반면, NGS 분석에서는 풀망둑과 길게로 확인되었다.
- NGS 분석을 실시한 저어새의 토사물은 형태학적 동정의결과와 유사하게 어류, 갑각류, 다모류 그리고 곤충류의 분류군으로 구성되어 있었다(Table 2, Fig. 2).
- NGS 분석을 통해 획득한 염기서열은 1,810,309~13,709,417 (7,430,327±3,661,479)이며, reads는 2,840~21,498 (11,715±5,709)로 나타났다. 최종적으로 먹이생물의 분석에 이용된 reads는 1,533~15,079 (7,218±4,357)이며,97% 수준의 cut-off을 실시하여 획득하였다(Table 1).
- 곤충류에서는 장수깔따구류 (Chironomus cf. plumosus), 짠물깔따구(Chironomus salinarius), 구름무늬깔따구(Polypedilumnubifer)가 관찰되었으며, 이들 종은 전체 먹이생물에서 1% 미만의 낮은 비율을 차지하였다.
- 어류에서는 숭어류(Mugilidae)와 망둥어류(Gobiidae)가 각각 1회 확인되었고, 미동정어류(Unidentified bony fishes)는 모든 토사물 시료에서 관찰되었다. 갑각류에서 칠게 (Macrophthalmus japonicus)는갑각류 중 가장 빈번하게 관찰되었고, 각시흰새우(Exopalaemon modestus)와 붉은줄참새우 (Palaemon macrodactylus)는 3회, 밀새우 (Exopalaemon carinicauda), 징거미새우류(Palaemon sp.), 미동정게류(Unidentified Brachyura)는 모두 1회 출현하였다. 다모류인 참갯지렁이류(Nereididae sp.
- 78%를 차지하였으며, 다모류는 5개, 곤충류는 4개의 토사물 시료에서 관찰되었다. 갑각류에서는 길게(Macrophthalmus abbreviates)가 가장 높은 빈도로 출현하며 평균 64.71%를 차지하였고, 징거미새우류(Macrobrachium sp.)는 34.35%로 나타났다. 이 두 먹이생물은 토사물 내 먹이생물 중 갑각류의 99.
- 06%를 차지하였다. 그리고 밀새우(Exopalaemon carinicauda), 풀게(Hemigrapsus penicillatus), 딱총새우(Alpheus brevicristatus)는 1% 미만의 구성비를 보였다.
- 석도에서 어미저어새가 어린저어새에게 건네준 먹이생물의 대부분은 민물과 논에서 서식하는 어류와 곤충이었으며, 강화도에서 발견된 저어새는 주로 담수성 어종인 미꾸리를 섭이하는 것으로 보고된 바 있다(Kim 2006). 따라서, 본 연구에서 저어새는 주로 해수성 및 기수성 먹이생물을 섭이하고 있었으나, 담수성 어류 또한 섭이하는 것으로 파악된다. 이를 통해 저어새는 갯벌에 대한 먹이활동 의존도가 매우 높은 것으로 판단되나 일부 담수습지를 채식지로 이용함을 추정할 수 있었다.
- 01%를 차지하여, 저어새의 주요 먹이생물로 확인되었다. 또한 전어 (Konosirus punctatus), 황줄망둑 (Tridentigernudicervicus), 좀구굴치(Micropercops swinhonis), 문절망둑류(Acanthogobius sp.)와 함께 민물 어류인 붕어(Carassiusgibelio) 및 미꾸리(Misgurnus bipartitus)가 1% 미만으로 분석되었다. 다모류에서는 참갯지렁이(Neanthes japonica)가 5회 관찰되었으며, 다모류의 평균 96.
- 남동유수지 내 저어새 섬은 주변 인간의 주거지역으로부터 불과 250 m 가량 떨어져 있어 인간의 생활권 내에 위치하고 면적에 비해 번식 밀도가 매우 높아, 저어새의 번식을 위한 지속적이 관심이 필요한 곳이다. 본 연구에서 밝혀진 저어새의 먹이생물의 섭이 특성은 주로 송도 갯벌 및 시화호 외측과 같은 조간대 생물들을 섭이하며, 일부는 담수성으로, 서식지 인근의 하천 및 논 뿐만 아니라 시화호의 담수습지,경기만 일대의 갈대숲 등지에서 채식활동의 가능성이 높다. 따라서 본 연구는 저어새의 번식지 및 채식지 보호를 위한 중요 자료로 이용될 수 있으며, 향후 지속적인 모니터링을 통해 저어새의 주요 급이장을 확인하고 보전하는 데 기여할수 있을 것으로 판단된다.
- 본 연구에서 저어새의 토사물을 대상으로 먹이생물을 분석한 결과, 저어새는 주로 갑각류와 어류를 섭이하는 것으로 나타났다. 기존의 연구결과에 의하면 저어새의 먹이생물은 주로 어류와 새우류로 구성되며, 일부 게, 조개, 곤충 및 양서류와 수생식물도 섭이하는 것으로 알려져 있다(Hsueh et al.
- 따라서 정확도가 높은 표준화된 분석방법을 이용하여 토사물 내 먹이생물을 종 수준까지 분류할 수 있다는 면에서 NGS 분석법은 먹이생물의 연구를 위한 효과적인 분석방법으로 판단된다. 본 연구에서도 NGS를 이용하여 깔따구류 등의 곤충류 및 형태학적으로 구분이 어려운 어류와 게류의 분석이 가능하였고, 현미경 분석 시에는 거의 관찰되지 않은 참갯지렁이와 같은 다모류가 NGS에서 높은 우점율을 보여 NGS 분석이 기존의 현미경 분석보다 새롭고 다양한 먹이생물들을 파악할 수 있었다. 그러나, 유전자 분석방법을 이용하여 보다 명확한 먹이생물의 규명하기 위해서는 다양한 생물의 유전자 database가 확보되어야 하기 때문에, 형태학적 분류와 병행하여 연구 결과에 대한 정확도를 향상시켜야 한다.
- 어류에서 풀망둑(Acanthogobius hasta)은 모든 토사물 시료에서 관찰되었고, 어류의 평균 71.02%를 구성하였다(Table 2, Fig. 2).
- 2). 이 중 갑각류(평균 42.58%)와 어류 (40.75%)는 모든 시료에서 관찰되었으며, 두 분류군은 토사물 내 먹이생물의 대부분을 구성하고 있었다. 그 외 다모류는 12.
- 따라서, 본 연구에서 저어새는 주로 해수성 및 기수성 먹이생물을 섭이하고 있었으나, 담수성 어류 또한 섭이하는 것으로 파악된다. 이를 통해 저어새는 갯벌에 대한 먹이활동 의존도가 매우 높은 것으로 판단되나 일부 담수습지를 채식지로 이용함을 추정할 수 있었다.
- 1992). 저어새의 중요 먹이생물은 갑각류로, 토사물 내에서 높은 빈도로 확인되었다. NGS 분석에서 저어새의 먹이생물 중 높은 구성비율을 보인 길게는 조간대내만에 주로 분포하는 종으로, 송도의 척전갯벌, 대부도, 시화갯벌에서 주로 서식하고 있는 것으로 보고되어 있다(Choi et al.
- 토사물 시료를 현미경으로 관찰한 결과, 3~7종의 먹이생물이 확인되었으며, 저어새는 주로 어류, 갑각류 그리고 다모류를 섭식하는 것으로 나타났다(Table 1). 갑각류와 어류는 모든 토사물 시료에서 관찰된 반면, 다모류는 1회 발견되었다.
- NGS 분석과 현미경 관찰 결과를 비교하면, 갑각류와 어류가 대부분을 차지하는 것은 비슷하지만 종 수준의 일부 우점생물에서 차이를 보였다. 현미경 분석을 통한 토사물 내 우점종은 칠게와 밀새우로 나타난 반면, NGS 분석에서는 풀망둑과 길게로 확인되었다. 현미경 분석법은 숙련된 분류지식을 필요로 하나, 저어새의 토사물과 같이 다양한 분류군에 속하는 먹이생물을 분석할 경우 형태적으로 온전한 상태가 아니고, 다양한 분류군이 포함되어 있기 때문에 정확한 동정이 어렵다.
후속연구
- 본 연구에서도 NGS를 이용하여 깔따구류 등의 곤충류 및 형태학적으로 구분이 어려운 어류와 게류의 분석이 가능하였고, 현미경 분석 시에는 거의 관찰되지 않은 참갯지렁이와 같은 다모류가 NGS에서 높은 우점율을 보여 NGS 분석이 기존의 현미경 분석보다 새롭고 다양한 먹이생물들을 파악할 수 있었다. 그러나, 유전자 분석방법을 이용하여 보다 명확한 먹이생물의 규명하기 위해서는 다양한 생물의 유전자 database가 확보되어야 하기 때문에, 형태학적 분류와 병행하여 연구 결과에 대한 정확도를 향상시켜야 한다.
- 본 연구에서 밝혀진 저어새의 먹이생물의 섭이 특성은 주로 송도 갯벌 및 시화호 외측과 같은 조간대 생물들을 섭이하며, 일부는 담수성으로, 서식지 인근의 하천 및 논 뿐만 아니라 시화호의 담수습지,경기만 일대의 갈대숲 등지에서 채식활동의 가능성이 높다. 따라서 본 연구는 저어새의 번식지 및 채식지 보호를 위한 중요 자료로 이용될 수 있으며, 향후 지속적인 모니터링을 통해 저어새의 주요 급이장을 확인하고 보전하는 데 기여할수 있을 것으로 판단된다. 이와 더불어, 향후 서해안 일대에 서식하는 저어새의 개체수를 보존 관리하기 위한 방안이 수립되어야 한다.
- 따라서 본 연구는 저어새의 번식지 및 채식지 보호를 위한 중요 자료로 이용될 수 있으며, 향후 지속적인 모니터링을 통해 저어새의 주요 급이장을 확인하고 보전하는 데 기여할수 있을 것으로 판단된다. 이와 더불어, 향후 서해안 일대에 서식하는 저어새의 개체수를 보존 관리하기 위한 방안이 수립되어야 한다.
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