[논문]H1299 인체폐암세포주에서 활성산소종 생성에 의한 황기와 사삼의 항암 시너지 작용

민태린; 박현지; 박신형

doi:10.15188/kjopp.2018.06.32.3.157

H1299 인체폐암세포주에서 활성산소종 생성에 의한 황기와 사삼의 항암 시너지 작용
Reactive Oxygen Species (ROS) Generation Contributes to the Synergistic Anticancer Effect of Astragalus Membranaceus and Adenophora Triphylla Var. Japonica in H1299 Human Lung Carcinoma Cells 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.32 no.3, 2018년, pp.157 - 164

민태린 (동의대학교 한의과대학 병리학교실 & 동의대학교 한의학연구소) , 박현지 (동의대학교 한의과대학 병리학교실 & 동의대학교 한의학연구소) , 박신형 (동의대학교 한의과대학 병리학교실 & 동의대학교 한의학연구소)

Abstract ▼ AI-Helper

This study was designed to investigate the mechanism of the synergistic anticancer effect of Astragalus membranaceus (AM) and Adenophora triphylla var. japonica (AT) in H1299 human lung carcinoma cells. A combined treatment of ethanol extract of AM (EAM) and AT (EAT) explosively increased the reactive oxygen species (ROS) generation in H1299 cells compared to the single treatment of each of them. Co-treatment of N-acetyl-L-cysteine (NAC) with EAM and EAT markedly enhanced the cell viability and suppressed apoptosis in H1299 cells, suggesting that ROS generation contributed to the anticancer effect of EAM and EAT. Interestingly, the combined treatment of EAM and EAT down-regulated p-AKT in H1299 cells, which was abrogated by NAC treatment. These results clearly indicated that ROS generation mediated the inactivation of AKT. Co-treatment of LY294002 with EAM and EAT significantly reduced the cell viability at a concentration which EAM and EAT didn't show any cytotoxicity. In addition, the recovery of cell viability by co-treatment of NAC with EAM and EAT was quite reversed by LY294002 treatment, which confirmed that the inactivation of AKT played a pivotal role in ROS-mediated apoptosis. Taken together, our results demonstrated that the synergistic anticancer effect of EAM and EAT was mediated by ROS generation and inactivation of AKT. We provide a valuable preclinical data for the development of more effective combination of AM and AT to treat lung cancer.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

H1299 인체폐암세포주에서 EAM과 EAT의 항암 시너지 효과가 나타나는 기전을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. EAM과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 H1299 세포의 활성산소종 생성이 현저히 증가하였다.
는 영향 다음으로 활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 apoptosis 유발에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 annexin V/PI double staining 후 flow cytometry로 annexin V-positive cell을 분석 하였다.
본 연구는 H1299 인체 폐암세포주에서 황기와 사삼의 항암 시너지작용을 보고한 기존 연구¹⁶⁾를 토대로 그 기전을 분석한 결과 활성산소종에 의한 AKT의 인산화 감소 및 apoptosis 유발로 인한 것임을 밝혔다. 이러한 결과는 향후 폐암 치료제로서 황기와 사삼을 보다 효과적으로 활용할 수 있는 전략을 세우는데 유용한 자료가 될 것으로 사료되어 이에 보고하는 바이다.
본 연구는 저자들이 앞서 보고한 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용이 나타나는 기전을 밝히는데 주안점을 두었다. 그 결과 EAM 과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 시 활성산소종 생성이 현저히 증가함을 관찰하였고(Fig.
본 연구는 황기와 사삼의 항암 시너지 작용의 기전을 밝힘으로써 향후 폐암을 치료하기 위해 황기와 사삼을 응용할 때 유용한 전 임상 근거를 제공하며, AKT 저해제와 같은 항암제를 함께 투여했을 때 보다 탁월한 효과를 거둘 수 있을 것임을 제안한다. 그러나 활성산소종이 AKT의 인산화를 억제하는 기전은 추후 더욱 연구되어야 할 부분으로 사료된다.
를 토대로 그 기전을 분석한 결과 활성산소종에 의한 AKT의 인산화 감소 및 apoptosis 유발로 인한 것임을 밝혔다. 이러한 결과는 향후 폐암 치료제로서 황기와 사삼을 보다 효과적으로 활용할 수 있는 전략을 세우는데 유용한 자료가 될 것으로 사료되어 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

72 시간 후 H1299 세포들을 모아 Annexin V‑FITC apoptosis detection kit (PharMingen, San Diego, California)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 염색하였다. 15분간 암실에서 세포를 염색한 후 DNA flow cytometer 와 CellQuest software를 사용하여 형광을 분석하였다. Annexin V‑positive cell을 apoptotic cell로 해석하여 수치를 분석하였다.
60Φ dish에 H1299 세포를 1×105개 seeding한 후 overnight 으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), NAC (5 mM)을 동시 처리하였다.
개 seeding한 후 overnight으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), NAC (5 mM)을 동시 처리하였다. 72 시간 후 H1299 세포들을 모아 Annexin V‑FITC apoptosis detection kit (PharMingen, San Diego, California)를 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 염색하였다. 15분간 암실에서 세포를 염색한 후 DNA flow cytometer 와 CellQuest software를 사용하여 형광을 분석하였다.
AKT 인산화 억제만으로도 H1299 세포주에 세포증식억제와 apoptosis가 유발되는지 확인하기 위하여 LY294002를 농도별로 처리한 후 cell cycle 분석을 시행하였다. 그 결과 농도의존적으로 H1299 세포주의 sub-G1 phase cell population이 증가하는 것을 확인함으로써 AKT 인산화 억제가 apoptosis를 유발하여 세포증식을 억제함을 알 수 있었다(Fig.
15분간 암실에서 세포를 염색한 후 DNA flow cytometer 와 CellQuest software를 사용하여 형광을 분석하였다. Annexin V‑positive cell을 apoptotic cell로 해석하여 수치를 분석하였다.
EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 저하에 활성산소종이 미치는 영향을 조사하기 위해 EAM-EAT와 함께 항산화제인 NAC 을 처리하였다. 먼저 현미경으로 cell density를 관찰한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소했던 세포밀집도가 NAC 처리에 의해 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
EAM과 EAT의 항암시너지 효과가 활성산소종 발생과 관련있는지 알아보기 위해 항암시너지 효과가 나타나는 농도¹⁶⁾인 500 ㎍ /㎖에서 EAM과 EAT를 단독 혹은 병용처리한 후 활성산소종 생성량을 flow cytometry로 조사하였다. 그 결과 EAM과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 시 활성산소종 생성이 급격히 증가하였으며, 시간의존적으로 활성산소종이 증가하여 EAM과 EAT 병용처리 2 h 후보다 6 h 후에 더욱 증가하는 경향을 보였다(Fig.
H1299 세포에 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), NAC (5 mM)을 48 시간 처리한 후 세포를 모아 냉장된 lysis buffer [RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) + 1X protease inhibitor cocktail (Thermo) + phosphatase inhibitors (1 mM Na3VO4, 100 mM NaF, and 10 mM NaPP)] 에 1 시간 용해시킨 후 Bio-rad 단백질 정량 시약을 이용하여 정량하였다. 그 후 20 ㎍의 총단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 loading하여 전기영동시키고, PVDF membrane (Millipore Corporation, Bedford, MA)에 transfer하였다.
5×10³ cells/well이 되도록 96 well plate에 seeding한 후 overnight으로 안정화시킨 다음 EAM과 EAT를 제시된 농도로 처리하였다. Inhibitor 실험으로서 NAC과 LY294002 를 처리할 경우 전처리나 후처리하지 않고 EAM, EAT와 동시에 처리하였다. 72 시간 배양 후 tetrazolium bromide salt (MTT)를 0.
AKT 인산화 억제만으로도 H1299 세포주에 세포증식억제와 apoptosis가 유발되는지 확인하기 위하여 LY294002를 농도별로 처리한 후 cell cycle 분석을 시행하였다. 그 결과 농도의존적으로 H1299 세포주의 sub-G1 phase cell population이 증가하는 것을 확인함으로써 AKT 인산화 억제가 apoptosis를 유발하여 세포증식을 억제함을 알 수 있었다(Fig. 5A) 다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의해 억제된 AKT의 인산화가 항암 시너지 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 AKT 저해제인 LY294002를 처리한 후 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 항암 시너지 작용이 유의하게 나타나지 않았던 농도인 EAM과 EAT 각 100 ㎍/㎖과 250 ㎍/㎖ 처리군에서 LY294002를 함께 처리하자 세포생존율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
cells/well 농도로 12 well plate에 seeding한 후 overnight으로 안정화시키고 EAM (500 ㎍/㎖), EAT (500 ㎍/㎖), NAC (10 mM)을 동시 처리하여 72 시간 배양하였다. 그 후 세포를 모아 0.1%로 희석된 trypan blue 용액에 부유하여 hematocytometer로 세포수를 측정하였다. 푸른색으로 염색된 세포는 dead cell로 판단하여 측정에서 제외하였고, 염색되지 않은 세포만 live cell로 판단하여 측정하였다.
5 ㎕ 10 ㎎/㎖ RNase A)에 부유하여 30분간 핵을 염색하였다. 그 후 원심분리시켜 상층액을 제거한 후 500 ㎕ PBS (pH 6.9)에 부유하여 DNA flow cytometer와 CellQuest software를 사용하여 cell cycle을 histogram으로 분석하였다.
다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT의 인산화 억제가 활성산소종 생성 및 세포사멸과 관련 있는지 다시 한 번 확인하기 위해 NAC과 LY294002를 함께 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소한 세포생존율이 NAC 처리에 의해 회복되고, 이는 다시 LY294002 처리에 의해 EAM-EAT 병용처리군 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
는 영향 다음으로 활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 apoptosis 유발에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저 annexin V/PI double staining 후 flow cytometry로 annexin V-positive cell을 분석 하였다. Apoptosis 초기에는 세포막 내부에 위치하는 phosphatidylserine (PS)이 세포막 외부로 이동하여 annexin V와 결합하므로 annexin V+/PI- 상태의 세포가 증가하고, apoptosis 후기에는 세포막에 pore가 형성되면서 PI에 의해 핵이 염색되므로 annexin V+/PI+ 상태의 세포가 증가한다.
조건에서 배양시켰다. 염색된 세포들을 모아 PBS (pH 6.9) 500 ㎕에 부유하여 DNA flow cytometer (BD FACSCalibur)와 CellQuest software를 사용하여 상대적인 활성산소종 생성 변화를 관찰하였다.
1%로 희석된 trypan blue 용액에 부유하여 hematocytometer로 세포수를 측정하였다. 푸른색으로 염색된 세포는 dead cell로 판단하여 측정에서 제외하였고, 염색되지 않은 세포만 live cell로 판단하여 측정하였다.

대상 데이터

세포 배양에 사용된 RPMI 1640, fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate-buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA는 WelGENE (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 단백질 분석을 위한 phospho-AKT 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, 나머지 1차 항체와 2차 항체는 모두 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 별도 표기 하지 않은 모든 시약은 Sigma (St.
(Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다. 별도 표기 하지 않은 모든 시약은 Sigma (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
본 실험에 사용된 황기 에탄올 추출물(ethanol extract of Astragali membranaceus, EAM) 과 사삼 에탄올 추출물(ethanol extract of Adenophora triphilla var. japonica, EAT)은 Lee의 연구¹⁶⁾에 기재된 방식으로 제조하였다. 세포 배양에 사용된 RPMI 1640, fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate-buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA는 WelGENE (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
본 연구에 사용된 H1299 인체 폐암세포주는 서울대학교 약학 대학 이호영교수님으로부터 분양받았다. 세포 배양 시 RPMI 1640 을 90%, FBS를 10%, PS를 1%가 되도록 혼합하여 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.
본 연구에 사용된 H1299 인체 폐암세포주는 서울대학교 약학 대학 이호영교수님으로부터 분양받았다. 세포 배양 시 RPMI 1640 을 90%, FBS를 10%, PS를 1%가 되도록 혼합하여 사용하였으며, 세포는 37℃, 5% CO₂ 조건 하에서 배양하였다.
japonica, EAT)은 Lee의 연구¹⁶⁾에 기재된 방식으로 제조하였다. 세포 배양에 사용된 RPMI 1640, fatal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS), phosphate-buffered saline (PBS), Trypsin-EDTA는 WelGENE (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 단백질 분석을 위한 phospho-AKT 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였고, 나머지 1차 항체와 2차 항체는 모두 Santa Cruz Biotechnology Inc.

데이터처리

Significance was determined by the Student's t-test (** P < 0.01, *** P < 0.001 vs. respective control).
Significance was determined by the Student's t-test (*** P < 0.001 vs. respective control).
모든 실험 결과는 mean±SD로 표시하였으며, 통계적 유의성 검증은 Student’s t-test를 이용하여 P < 0.05인 것을 유의성 있다고 판단하였다.

성능/효과

따라서 AKT의 ATP-binding site나 regulatory domain을 조절함으로써 kinase 활성을 억제할 수 있는 약물들이 개발되고 있다³³⁾. EAM-EAT 병용처리에 의한 항암 시너지작용이 AKT signaling pathway 조절과 관련되어 있는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 시행한 결과 EAM과 EAT 단독처리 시보다 병용처리 시 AKT의 인산화가 현저히 줄어드는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 흥미롭게도 EAM-EAT 병용처리에 의해 감소한 AKT의 인산화는 NAC으로 활성산소종 생성을 차단하자 다시 증가하였다(Fig.
H1299 인체폐암세포주에서 EAM과 EAT의 항암 시너지 효과가 나타나는 기전을 조사하여 다음과 같은 결론을 얻었다. EAM과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 H1299 세포의 활성산소종 생성이 현저히 증가하였다. 활성산소종은 AKT의 인산화를 저해하여 H1299 세포의 apoptosis를 유발하였으므로 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용은 활성산소종 생성과 AKT 활성 억제에 의해 매개되는 것으로 판단된다.
본 연구는 저자들이 앞서 보고한 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용이 나타나는 기전을 밝히는데 주안점을 두었다. 그 결과 EAM 과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 시 활성산소종 생성이 현저히 증가함을 관찰하였고(Fig. 1), NAC으로 활성산소종 생성을 차단하자 EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 감소 및 apoptosis 유발이 저해되는 것을 확인함으로써 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용이 활성산소종 생성에 의한 것임을 알 수 있었다(Fig. 2 and 3). 흥미롭게도 EAM-EAT 병용처리는 AKT의 인산화를 억제하였고, NAC 처리에 의해 p-AKT의 발현이 다시 증가되었으므로 활성산소종 생성이 AKT의 인산화를 저해함을 알 수 있었다(Fig.
다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT의 인산화 억제가 활성산소종 생성 및 세포사멸과 관련 있는지 다시 한 번 확인하기 위해 NAC과 LY294002를 함께 처리한 후 MTT assay를 시행하였다. 그 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소한 세포생존율이 NAC 처리에 의해 회복되고, 이는 다시 LY294002 처리에 의해 EAM-EAT 병용처리군 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 활성산소종 생성 억제에 의해 상승한 세포생존율이 AKT 활성 저해에 의해 다시 감소하는 것은 결국 활성산소종 생성에 의한 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용이 AKT의 활성 억제에 의해 매개됨을 의미하는 것이다.
인 500 ㎍ /㎖에서 EAM과 EAT를 단독 혹은 병용처리한 후 활성산소종 생성량을 flow cytometry로 조사하였다. 그 결과 EAM과 EAT 단독처리에 비해 병용처리 시 활성산소종 생성이 급격히 증가하였으며, 시간의존적으로 활성산소종이 증가하여 EAM과 EAT 병용처리 2 h 후보다 6 h 후에 더욱 증가하는 경향을 보였다(Fig. 1A). 이러한 결과는 Lee의 연구¹⁶⁾에서 EAM과 EAT 단독처리에 비해 병합처리 시 apoptosis가 현저히 증가하는 결과와 연관되어 EAM과 EAT의 항암시너지 작용이 활성산소종 발생과 관련있을 가능성을 보여주었다.
5A) 다음으로 EAM-EAT 병용처리에 의해 억제된 AKT의 인산화가 항암 시너지 작용에 미치는 영향을 조사하기 위해 AKT 저해제인 LY294002를 처리한 후 MTT assay로 세포생존율을 측정하였다. 그 결과 항암 시너지 작용이 유의하게 나타나지 않았던 농도인 EAM과 EAT 각 100 ㎍/㎖과 250 ㎍/㎖ 처리군에서 LY294002를 함께 처리하자 세포생존율이 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5B). 이러한 세포증식억제가 apoptosis 유발에 의한 것인지 확인하기 위하여 cell cycle 분석을 시행한 결과 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 sub-G1 phase cell population이 대폭 증가하였으며(Fig.
5E). 따라서 EAM-EAT 병용처리가 apoptosis 유발을 통해 항암 시너지 작용을 나타내는 데 AKT의 인산화 억제가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
사삼은 항산화작용이 보고⁴⁸⁾되어 있을 뿐 암세포에서 활성산소종을 발생시키는지 여부는 아직까지 연구된 바가 없다. 따라서 기존 연구를 종합해보면 황기와 사삼 단독으로는 활성산소종을 발생시킬 것으로 기대하기 어려우며, 본 연 구의 실험결과 역시 EAM과 EAT 단독처리만으로는 활성산소종 생성이 미미한 수준으로 관찰되었다. 그러나 EAM-EAT 병용처리에 의해 활성산소종 발생량이 현저히 증가했으며, 이는 apoptosis 유발로 이어져 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용에 기여한 것으로 판단된다.
이러한 결과는 Lee의 연구¹⁶⁾에서 EAM과 EAT 단독처리에 비해 병합처리 시 apoptosis가 현저히 증가하는 결과와 연관되어 EAM과 EAT의 항암시너지 작용이 활성산소종 발생과 관련있을 가능성을 보여주었다. 또한 EAM과 EAT를 시간별로 병용처리했을 때 활성산소종은 6 h 후부터 48 h 후까지 지속적으로 발생되어 활성산소종에 의한 signaling pathway가 장시간동안 활성화되었을 것임을 예측할 수 있었다(Fig. 1B).
4). 또한 LY294002를 통한 AKT의 활성 억제는 세포생존율을 감소시켰으므로 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용은 활성산소종 생성을 통한 AKT 인산화 억제와 관련 있음을 확인하였다(Fig. 5).
2A). 또한 MTT assay와 trypan blue exclusion assay로 세포생존율을 측정한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 급격히 감소한 세포생존율이 NAC으로 활성산소종 생성을 억제하자 상당 부분 다시 회복되는 것을 관찰하였다(Fig. 2B and 2C). 이러한 결과는 활성산소종이 EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 감소에 핵심적인 역할을 담당함을 의미한다.
EAM-EAT 병용처리에 의한 세포생존율 저하에 활성산소종이 미치는 영향을 조사하기 위해 EAM-EAT와 함께 항산화제인 NAC 을 처리하였다. 먼저 현미경으로 cell density를 관찰한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 현저히 감소했던 세포밀집도가 NAC 처리에 의해 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2A). 또한 MTT assay와 trypan blue exclusion assay로 세포생존율을 측정한 결과 EAM-EAT 병용처리에 의해 급격히 감소한 세포생존율이 NAC으로 활성산소종 생성을 억제하자 상당 부분 다시 회복되는 것을 관찰하였다(Fig.
따라서 암 치료전략을 세울 때 활성산소종의 대조적인 작용을 매개하는 signaling pathway를 파악하는 것이 중요하다. 본 연구에서는 EAM과 EAT의 병용처리에 의해 발생한 활성산소종이 H1299 인체 폐암세포주에 apoptosis를 일으켜 암을 억제하는 작용을 했음을 알 수 있으며, 이 과정을 매개하는 신호전달경로가 AKT pathway임을 밝혔다. 기존 연구에 따르면 다양한 drug가 활성산소종 생성을 통해 AKT 활성을 저해한다고 보고되어 있다.
5D). 이러한 결과는 LY294002 단독 처리에 의해서는 약하게 감소하였던 p-AKT의 발현이 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 현저히 감소하는 결과와 함께 AKT 의 인산화 수준이 H1299 세포주의 apoptosis 유발과 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다(Fig. 5E). 따라서 EAM-EAT 병용처리가 apoptosis 유발을 통해 항암 시너지 작용을 나타내는 데 AKT의 인산화 억제가 중요한 역할을 함을 알 수 있었다.
5B). 이러한 세포증식억제가 apoptosis 유발에 의한 것인지 확인하기 위하여 cell cycle 분석을 시행한 결과 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 sub-G1 phase cell population이 대폭 증가하였으며(Fig. 5C), 이와 함께 apoptosis marker 단백질인 cleaved-PARP의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 5D). 이러한 결과는 LY294002 단독 처리에 의해서는 약하게 감소하였던 p-AKT의 발현이 LY294002와 EAM-EAT의 병용처리에 의해 현저히 감소하는 결과와 함께 AKT 의 인산화 수준이 H1299 세포주의 apoptosis 유발과 밀접하게 연관되어 있음을 보여주었다(Fig.
따라서 apoptosis가 일어난 세포는 stage에 상관없이 공통적으로 annexin V가 양성으로 나타난다³²⁾. 이를 바탕으로 데이터를 해석한 결과 EAM-EAT 병용 처리에 의해 현저히 증가한 apoptotic cell population이 NAC 처리에 의해 control 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 3A). Cell cycle 분석결과 역시 같은 패턴을 보여 apoptotic cell을 의미하는 sub-G1 phase cell population이 EAM-EAT 병용처리에 의해 증가했다가 NAC 처리에 의해 감소하는 경향을 보였다 (Fig.
4B). 이를 통해 EAM-EAT 병용처리에 의한 AKT의 활성 감소가 활성산소종 발생에 의한 것임을 알 수 있었다.
이상의 결과는 황기와 사삼의 병용처리에 의해 폐암에 대한 항암효과를 높일 수 있는 기전을 명확히 제시하며, AKT 저해제와 같은 항암제와의 combination을 시도할 수 있는 전임상 근거를 제공한다. 향후 새로운 폐암 치료제 개발에 있어서 황기와 사삼 이외에 다양한 한약재의 combination effect와 그 기전을 연구해야 할 필요가 있을 것으로 사료된다.
2 and 3). 흥미롭게도 EAM-EAT 병용처리는 AKT의 인산화를 억제하였고, NAC 처리에 의해 p-AKT의 발현이 다시 증가되었으므로 활성산소종 생성이 AKT의 인산화를 저해함을 알 수 있었다(Fig. 4). 또한 LY294002를 통한 AKT의 활성 억제는 세포생존율을 감소시켰으므로 EAM과 EAT의 항암 시너지 작용은 활성산소종 생성을 통한 AKT 인산화 억제와 관련 있음을 확인하였다(Fig.

후속연구

본 연구는 황기와 사삼의 항암 시너지 작용의 기전을 밝힘으로써 향후 폐암을 치료하기 위해 황기와 사삼을 응용할 때 유용한 전 임상 근거를 제공하며, AKT 저해제와 같은 항암제를 함께 투여했을 때 보다 탁월한 효과를 거둘 수 있을 것임을 제안한다. 그러나 활성산소종이 AKT의 인산화를 억제하는 기전은 추후 더욱 연구되어야 할 부분으로 사료된다.
이상의 결과는 황기와 사삼의 병용처리에 의해 폐암에 대한 항암효과를 높일 수 있는 기전을 명확히 제시하며, AKT 저해제와 같은 항암제와의 combination을 시도할 수 있는 전임상 근거를 제공한다. 향후 새로운 폐암 치료제 개발에 있어서 황기와 사삼 이외에 다양한 한약재의 combination effect와 그 기전을 연구해야 할 필요가 있을 것으로 사료된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	Apoptosis의 특징은 무엇인가?	Apoptosis는 일정한 프로그램에 따라 세포가 능동적으로 죽는 과정으로서 세포막의 blebbing 현상, 세포질과 염색질의 응축, DNA의 절편화 등을 특징으로 한다. Necrosis가 일어난 세포는 팽창하여 터짐으로써 주변 조직에 염증을 일으키는 반면 apoptosis 가 일어난 세포는 식세포의 식작용에 의해 제거되므로 주위에 염증 반응을 일으키지 않는다17,18).
	암세포에 활성산소종을 유발함으로써 항암활성을 가지는 천연물 성분에는 무엇이 있는가?	특히 다양한 천연물 성분이 암세포에 활성산소종을 유발함으로써 항암활성을 가진다고 알려져 있다. 예를 들어 capsaicin은 췌장암세포에24), curcumin은 위암세포에25), phenethyl isothiocyanate은 만성골수성백혈병세포에26), piperine은 악성흑색종세포27), deguelin은 폐암세포에 각각 활성산소종을 유발하여 apoptosis를 일으킨다고 보고되어 있다28). 뿐만 아니라 활성산소종을 유발하는 천연물질들은 암세포의 세포주기조절과 전이 억제 및 기존 항암치료의 효과를 높임으로써 항암활성을 나타낸다29-31).
	황기의 효능은 무엇인가?	한의학적으로 폐암은 전신적인 正氣와 陰液 부족 등 虛證을 근본으로 痰飮과 瘀血이 생겨 형성되는 것으로 알려져 있으며, 실제 중의학에서는 폐암을 치료하는데 황기와 사삼을 주요약재로 한 益氣養陰法을 적극적으로 운용해왔다4,5). 황기와 사삼의 항암작용에 대한 전임상연구들을 살펴보면 황기는 면역증강과 신생 혈관억제를 통해 항암활성을 가지며6-10), 사삼은 암세포의 apoptosis 유도, 비장세포 증식유도 및 혈관신생억제 등을 통해 항암작용을 나타낸다11-15). 이에 본 저자는 인체폐암세포에서 황기와 사삼이 항암 시너지효과를 가지는지 여부를 조사하여 유의한 결과를 보고하였으나16), 그 기전은 명확히 밝혀지지 않았다.

참고문헌 (48)

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상세보기
National Cancer Information Center. Available from: http://www.cancer.go.kr/mbs/cancer.
Liu LK, Li YF, Wang XX. Exploraion of the Pathogenesis and Therapeutic Methods of Lung Cancer. China Journal of Basic Medicine In Traditional Chinese Medicine. 2004;10(5):75.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

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용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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