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문제 정의
- 한편 흑생강의 혈액순환 관련 연구로는 생성된 fibrin을 분해하는 fibrinolysis 효과에 의해 혈액흐름이 증가된다는 Murata 등의 보고[15]가 알려져 있으나, 이는 생성된 혈전의 분해와 관련된 연구이며, 현재까지 혈액응고 저해 및 혈소판 응집저해에 따른 예방적 측면에서의 흑생강의 항혈전 활성에 대한 보고는 알려진 바 없다. 본 연구에서는 다양한 유용생리활성을 가진 흑생강의 추출물 및 이의 순차적 유기용매 분획물의 항혈전 활성을 평가한 결과, 폴리페놀 고함유 분획물에서 강력한 혈액응고 저해 활성 및 인간 혈소판 응집저해 활성을 확인하였기에 이에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Japan)하여 분말로 조제하였다. 열수 추출물의 경우에도 동일하게 흑생강 시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 3회 반복한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 열수 추출물을 제조하였다. 이후, 조제시료를 증류수에 현탁한 후 hexane, ethylacetate (EA), butanol로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다.
- 응집반응은 Whole Blood Aggregometer의 교반장치를 이용하여 반응액을 500 rpm으로 교반시키면서 collagen 첨가 후 12분간 측정하였다. 이후 얻어진 응집곡선으로부터 amplitude, slope, area under 를 측정하여 혈소판 응집을 평가하였다[10]. 이때, amplitude (Ω)는 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 혈소판의 최대 응집도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, area under는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 나타낸다[10, 23].
- 열수 추출물의 경우에도 동일하게 흑생강 시료에 대해 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 1시간 가열 추출한 후 방냉하고, 다시 상기 과정을 3회 반복한 후 추출액을 모아 필터링한 후, 감압 농축하여 분말로 제조하여 열수 추출물을 제조하였다. 이후, 조제시료를 증류수에 현탁한 후 hexane, ethylacetate (EA), butanol로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액 응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다.
- 이후, 조제시료를 증류수에 현탁한 후 hexane, ethylacetate (EA), butanol로 순차적 분획하였으며, 최종적으로 물 잔류물을 회수하였다. 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액 응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다. 실험에 사용한 흑생강 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2015-KP).
- 혈소판 응집저해 활성은 수세된 농축 혈소판에 흑생강 시료를 첨가한 후, Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, PA, U.S.A)의 미세전극에 혈소판이 부착, 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하여 평가하였다[23]. 보다 자세하게는 10 mM CaCl2 50 μl, suspending buffer 147.
- 흑생강 추출물 및 이의 분획물의 급성독성 평가를 위해 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였다. 용매 대조구로 사용된 DMSO는 용혈활성이 없었으며, 활성대조구로 사용된 triton X-100과 amphotericin B는 1.
- 흑생강 추출물 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가를 위해 인간 혈소판 응집저해능을 평가하였다. 혈소판은 혈관 손상보호 및 혈소판 응집과 관련된 다양한 물질을 고농도로 포함하는 cytoplasmic granule을 가지고 있으며, 혈관내벽의 손상이 나타나는 경우 응집인자들을 분비하고, 내피세포의 손상으로 노출된 collagen 등과 결합하여 1차 지혈 플러그를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포이다.
- 흑생강 추출물 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 항응고 활성을 평가하였다. 먼저 항응고 활성 대조구인 아스피린은 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 모두 15배 이상 연장시켰으며, 1.
- 흑생강의 ethanol 및 열수 추출물을 조제하고 이의 순차적 분획물을 조제하였다. 흑생강의 경우 ethanol 추출효율은 3.
- 흑생강의 혈액응고 저해 활성은 기존의 보고한 thrombin time (TT), prothrombin time (PT) 및 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 측정하여 평가하였다[11, 20]. 각각의 혈액응고활성은 3회 반복 측정하였으며, thrombin, prothrombin, 혈액응고인자 저해활성은 시료 첨가시의 TT, PT 및 aPTT의 평균값을 용매 대조구인 DMSO첨가시의 TT, PT 및 aPTT 평균값의 비로 각각 나타내었다[11].
대상 데이터
- 본 실험의 흑생강 시료는 2015년 태국에서 재배, 수확한 지하부를 사용하였으며, 흐르는 물에 수세하여 이물질을 제거한 후, ethanol추출물 및 열수 추출물 제조에 사용하였다. Ethanol추출물 조제시에는 흑생강 시료에 대해 10배의 에탄올을 가하고, 상온에서 4회 반복 추출한 후 추출액을 모아 filter paper (Whatsman No.
- 먼저 PBS로 3회 수세한 인간 적혈구(4%) 100 μl를 96-well microplate에 가하고 다양한 농도의 시료용액 100 μl를 가한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰으며, 이후, 반응액을 10분간 원심분리(1,500 rpm)하여 상등액 100μl를 새로운 microtiter plate로 옮긴 후 용혈에 따른 헤모글로빈 유출 정도를 414 nm에서 측정하였다. 시료의 용매 대조구로는 DMSO (2%)를 사용하였으며, 활성 대조구로는 triton X-100과 amphotericin B를 사용하였다. 용혈활성은 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
- 조제된 추출물과 분획물은 DMSO또는 증류수에 적당한 농도로 녹여, 성분분석, 혈액 응고 저해, 혈소판 응집저해, 적혈구 용혈활성 평가에 사용하였다. 실험에 사용한 흑생강 시료는 안동대학교 식품영양학과에서 보관하고 있다(voucher specimen 2015-KP).
데이터처리
- 실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean ± SD로 나타내었으며, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였으며, Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성을 조사하였다.
- 이때 시료 대조군으로는 aspirin (Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을, 용매 대조군으로는 DMSO를 사용하였으며, 흑생강 시료에 대한 각각의 실험결과는 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다.
이론/모형
- 흑생강 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 기존의 보고된 방법[22]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26]. 각각의 분석결과는 3회 반복한 실험의 평균과 편차로 나타내었다.
- 흑생강 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 기존의 보고된 방법[22]에 따라 측정하였으며, 각각 rutin과 tannic acid를 표준시약으로 사용하였다. 총당 정량의 경우에는 phenol-sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26].
성능/효과
- 5%의 응집도를 나타내어, 에탄올 추출물에서만 강력한 응집저해 활성을 나타내었다. 그러나 분획물의 경우, 추출용매에 관계없이 헥센 및 EA 분획에서 13.8~48.2%의 응집도를 나타내어 흑생강의 지용성 성분이 혈소판 응집저해활성과 관련됨을 알 수 있었으며, 특히 ethanol 및 열수 추출물의 EA 분획물이 가장 우수한 혈소판 응집저해활성을 나타내었다(Table 3, Fig. 2). 이러한 응집저해 활성은 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린보다 강력하므로, 흑생강의 EA 분획으로 위장장애 등의 부작용을 나타내는 아스피린을 대치할 수 있는 항혈전제로 개발함이 가능할 것으로 판단된다.
- 기존의 흑생강 추출물 및 이의 methoxyflavone 화합물에 의한 혈전 용해활성이 보고[15]된 바 있으나, 본 연구 결과는 흑생강의 혈전 생성 억제 활성에 대한 최초의 보고이며, 흑생강의 EA 분획이 인간 적혈구 용혈활성 없이 강력한 항응고 및 혈소판 응집저해 활성을 나타내어 신규의 항혈전제로 이용 가능함을 제시하고 있다. 향후 활성물질의 분리 및 관련 기작 연구를 통해 내인성 혈액응고 저해제 및 혈소판 응집저해제로 개발이 가능하리라 판단된다.
- 5 mg/ml)의 PT 및 aPTT와 유사한 의미 있는 혈전생성 저해 활성을 나타내었다(Table 2). 따라서 ethanol 추출물의 EA 분획물이 가장 우수한 항응고 활성을 나타내며, 특히 내인성 혈전 생성의 경우 아스피린(상품명: 프로텍트)과 비교할 만한 강력한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였다. 이는 통상의 혈액순환 개선활성이 있다고 알려진 한약재들보다 우수한 항응고 활성으로[20], 흑생강이 내인성 혈전 생성을 억제하여 심혈관계 질환의 예방에 도움이 될 수 있음을 제시하고 있으며, 현재 사용한 추출물 및 활성 분획물이 정제되지 않은 상태임을 고려한다면, 차후 활성물질의 정제시에는 5 mg/ml 농도보다 낮은 농도에서 항응고 활성이 나타나리라 판단된다.
- 5%의 추출효율을 나타내어 약 4배 높은 수율을 보였다. 또한 열수 추출물의 경우 44.7%가 butanol 분획물, 46.2%가 물 잔류물로 이행되었으며, EA 분획물은 추출물의 6.1%를 차지하였다. 그러나, ethanol 추출물의 경우 52.
- 흑생강 추출물 및 이의 분획물의 항혈전 활성 평가의 일환으로 항응고 활성을 평가하였다. 먼저 항응고 활성 대조구인 아스피린은 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 모두 15배 이상 연장시켰으며, 1.5 mg/ml 농도에서는 각각 1.68, 1.40, 1.38배 연장효과를 나타내어 우수한 항응고 활성을 나타내었다(Table 2). 흑생강 ethanol 추출액의 경우 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 각각 1.
- 따라서 혈소판 응집저해는 혈전 생성을 방지하는 매우 중요한 활성이다[23]. 먼저 활성 대조구로 사용된 아스피린은 농도 의존적으로 혈소판응집을 저해하였으며, 0.125 mg/ml 농도에서 무처리구에 비해 47.2%, 0.25 mg/ml 농도에서 36%의 응집도를 나타내었다. 흑생강의 경우 0.
- 3mg/g)을 나타내었다. 반면 총당 및 환원당은 butanol 분획 및 물 잔류물에서 함량이 높았다(Table 1).
- 흑생강 추출물 및 이의 분획물의 급성독성 평가를 위해 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였다. 용매 대조구로 사용된 DMSO는 용혈활성이 없었으며, 활성대조구로 사용된 triton X-100과 amphotericin B는 1.0 및 0.02 mg/ml 농도에서 적혈구를 각각 100% 및 85.3% 용혈시킴을 확인하였다. 흑생강의 경우, 헥센 분획물을 제외한 시료에서는0.
- 1). 조제된 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 분석결과, 열수 추출물이 ethanol 추출물보다 높은 함량을 보여 통상의 추출물과는 차이가 있었으며, ethanol 추출물의 경우 물 잔류물, EA 분획, butanol 분획, 헥센 분획의 순으로, 열수 추출물의 경우 물 잔류물 EA 분획, butanol 분획, 헥센분획의 순으로 높은 함량을 나타내었다. 즉 각각의 추출물 모두에서 순차적 유기용매 분획후의 물 잔류물이 가장 높은 총폴리페놀 함량(34.
- 조제된 추출물 및 분획물의 총 폴리페놀 분석결과, 열수 추출물이 ethanol 추출물보다 높은 함량을 보여 통상의 추출물과는 차이가 있었으며, ethanol 추출물의 경우 물 잔류물, EA 분획, butanol 분획, 헥센 분획의 순으로, 열수 추출물의 경우 물 잔류물 EA 분획, butanol 분획, 헥센분획의 순으로 높은 함량을 나타내었다. 즉 각각의 추출물 모두에서 순차적 유기용매 분획후의 물 잔류물이 가장 높은 총폴리페놀 함량(34.3~42.4 mg/g)을 나타내었다. 흑생강 추출물의 경우, 아로니아, 블랙커런트 등의 베리류보다는 총 폴리페놀 함량이 낮았으나, 통상의 한약재들[20] 및 체리[1]보다는 총 폴리페놀 함량이 높았다.
- 흑생강 추출물의 경우, 아로니아, 블랙커런트 등의 베리류보다는 총 폴리페놀 함량이 낮았으나, 통상의 한약재들[20] 및 체리[1]보다는 총 폴리페놀 함량이 높았다. 한편 총 플라보노이드 함량 분석결과, ethanol 추출물이 열수 추출물보다 약 1.5배 높았으며, 각각 EA 분획에서 가장 높은 함량(23.5~26.3mg/g)을 나타내었다. 반면 총당 및 환원당은 butanol 분획 및 물 잔류물에서 함량이 높았다(Table 1).
- 이러한 응집저해 활성은 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린보다 강력하므로, 흑생강의 EA 분획으로 위장장애 등의 부작용을 나타내는 아스피린을 대치할 수 있는 항혈전제로 개발함이 가능할 것으로 판단된다. 한편 흑생강 추출물들의 물 잔류물은 오히려 혈소판 응집을 강하게 촉진하여, 흑생강을 항혈전제로 개발하고자 하는 경우 EA 분획물을 이용하여야 함을 확인하였다.
- 38배 연장효과를 나타내어 우수한 항응고 활성을 나타내었다(Table 2). 흑생강 ethanol 추출액의 경우 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 각각 1.07, 0.96, 1.24배, 열수 추출물은 각각 1.07, 1.39, 1.19배 연장시켜, ethanol 추출물의 경우 혈액응고인자 저해, 열수 추출물의 경우 prothrombin저해에 의한 혈액응고저해 활성을 나타냄을 확인하였다. 한편 ethanol 추출물의 EA 분획물의 경우 5 mg/ml 농도에서 TT, PT, aPTT를 각각 1.
후속연구
- 2). 이러한 응집저해 활성은 임상에서 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린보다 강력하므로, 흑생강의 EA 분획으로 위장장애 등의 부작용을 나타내는 아스피린을 대치할 수 있는 항혈전제로 개발함이 가능할 것으로 판단된다. 한편 흑생강 추출물들의 물 잔류물은 오히려 혈소판 응집을 강하게 촉진하여, 흑생강을 항혈전제로 개발하고자 하는 경우 EA 분획물을 이용하여야 함을 확인하였다.
- 기존의 흑생강 추출물 및 이의 methoxyflavone 화합물에 의한 혈전 용해활성이 보고[15]된 바 있으나, 본 연구 결과는 흑생강의 혈전 생성 억제 활성에 대한 최초의 보고이며, 흑생강의 EA 분획이 인간 적혈구 용혈활성 없이 강력한 항응고 및 혈소판 응집저해 활성을 나타내어 신규의 항혈전제로 이용 가능함을 제시하고 있다. 향후 활성물질의 분리 및 관련 기작 연구를 통해 내인성 혈액응고 저해제 및 혈소판 응집저해제로 개발이 가능하리라 판단된다.
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