견과류 중에 있는 트리코테센계 곰팡이독소 오염도를 조사하기 위하여 LC-MS/MS를 이용한 정확성과 신뢰성을 동시에 확보할 수 있는 분석방법을 개발하였다. 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소는 QuEChERS 추출 및 EMR-Lipid-dSPE 정제과정을 통하여 분석에 사용되었다. 검량선 작성을 위하여 트리코테센계 곰팡이독소 10종에 대하여 $2.00{\sim}75.00{\mu}g/kg$의 범위로 혼합표준용액을 제조하여 실험하였으며, 상관계수는 모두 0.998 이상으로 높은 직선성을 나타내었다. 분석방법의 검출한계는 $0.41{\sim}3.57{\mu}g/kg$로 나타났으며, 정량한계는 $1.23{\sim}10.82{\mu}g/kg$로 나타났다. 또한 트리코테센계 곰팡이 독소 10종에 대하여 각각 저, 중, 고 3가지 농도로 처리하여 회수율 실험을 수행한 결과 81.84~96.87%로 나타났다. 확립된 분석법으로 견과류 중 땅콩을 대상으로 오염도를 조사한 결과 1종에서 deoxynivalenol이 검출되었다. 이러한 결과를 바탕으로 확립된 시험법은 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 분석에 적합함을 확인할 수 있었으며 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 검출 가능성을 확인한바 보다 다양한 종류의 견과류에 대한 모니터링 조사가 필요한 것으로 판단된다.
견과류 중에 있는 트리코테센계 곰팡이독소 오염도를 조사하기 위하여 LC-MS/MS를 이용한 정확성과 신뢰성을 동시에 확보할 수 있는 분석방법을 개발하였다. 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소는 QuEChERS 추출 및 EMR-Lipid-dSPE 정제과정을 통하여 분석에 사용되었다. 검량선 작성을 위하여 트리코테센계 곰팡이독소 10종에 대하여 $2.00{\sim}75.00{\mu}g/kg$의 범위로 혼합표준용액을 제조하여 실험하였으며, 상관계수는 모두 0.998 이상으로 높은 직선성을 나타내었다. 분석방법의 검출한계는 $0.41{\sim}3.57{\mu}g/kg$로 나타났으며, 정량한계는 $1.23{\sim}10.82{\mu}g/kg$로 나타났다. 또한 트리코테센계 곰팡이 독소 10종에 대하여 각각 저, 중, 고 3가지 농도로 처리하여 회수율 실험을 수행한 결과 81.84~96.87%로 나타났다. 확립된 분석법으로 견과류 중 땅콩을 대상으로 오염도를 조사한 결과 1종에서 deoxynivalenol이 검출되었다. 이러한 결과를 바탕으로 확립된 시험법은 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 분석에 적합함을 확인할 수 있었으며 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 검출 가능성을 확인한바 보다 다양한 종류의 견과류에 대한 모니터링 조사가 필요한 것으로 판단된다.
This study presents a method validation for extraction and quantitative analysis of trichothecene mycotoxins in nuts based on quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) approach for extraction and enhanced matrix removal (EMR)-lipid-disperive-SPE (d-SPE) cleanup method, with detectio...
This study presents a method validation for extraction and quantitative analysis of trichothecene mycotoxins in nuts based on quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) approach for extraction and enhanced matrix removal (EMR)-lipid-disperive-SPE (d-SPE) cleanup method, with detection and quantification by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in positive- and negative-ion modes. Linearity, precision, and accuracy were validated for LC-MS/MS methods. Results obtained with LC-MS/MS were linear, with correlation coefficient ($R^2$) of 0.998. Limits of detection and quantification for mycotoxins were $0.41-3.57{\mu}g/kg$ and $1.23-10.82{\mu}g/kg$, respectively. Intra- and inter-day precisions (RSD, %) were 0.40-8.44% and 1.93-12.46%, respectively. Results indicated to be rapidly and accurately identifying trichothecene mycotoxins and may be used as a suitable safety management method for nuts and nuts related commodities.
This study presents a method validation for extraction and quantitative analysis of trichothecene mycotoxins in nuts based on quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) approach for extraction and enhanced matrix removal (EMR)-lipid-disperive-SPE (d-SPE) cleanup method, with detection and quantification by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in positive- and negative-ion modes. Linearity, precision, and accuracy were validated for LC-MS/MS methods. Results obtained with LC-MS/MS were linear, with correlation coefficient ($R^2$) of 0.998. Limits of detection and quantification for mycotoxins were $0.41-3.57{\mu}g/kg$ and $1.23-10.82{\mu}g/kg$, respectively. Intra- and inter-day precisions (RSD, %) were 0.40-8.44% and 1.93-12.46%, respectively. Results indicated to be rapidly and accurately identifying trichothecene mycotoxins and may be used as a suitable safety management method for nuts and nuts related commodities.
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문제 정의
최근 건강한 삶에 대한 국민들의 관심이 증가로 간식의 트랜드가 바뀌면서 불포화지방산 등이 풍부한 견과류와 견과류를 활용한 가공제품의 소비량이 급증하고 있으며, 이러한 소비자의 기호를 반영하듯 견과류의 수입규모도 매년 증가하고 있다. 따라서, 본 연구에서는 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 QuEChERS 전처리 조건 및 분석법을 개발하고 그 유효성을 검증하고자 한다.
제안 방법
견과류에서의 트리코테센계 곰팡이 독소 10종 표준용액은 아세토니트릴을 이용하여 5포인트의 농도로 희석하여 위의 제시한 LC-MS/MS 조건으로 분석하였다. 직선성은 0.
곰팡이 독소의 경우 국내 설정된 기준의 단위가 μg/kg, mg/kg와 같이 낮은 수준으로 고감도 분석이 요구되기 때문에 시료의 간섭물질에 영향을 받지 않고 선택성이 높은액체크로마토그래프-질량분석기(Liquid ChromatographTandem Mass spectrometer, LC-MS/MS)를 분석 기기로 선정하였다. 트리코테센계 곰팡이 독소 10종에 대하여 분자 이온의 확인을 위하여 nivalenol은 negative mode(-)에서 Q1 scan을 실시하였고, 다른 9종은 positive mode(+)에서 Q1 scan을 실시하였다.
특히, 견과류의 경우 지방함량이 약 50% 이상으로 지질로 인한 간섭이 분석물질을 정확히 분석하는데 방해요인으로 작용될 수 있다. 따라서 본 연구에서는 정제방법 최적화를 위하여 d-SPE법과 EMR-Lipid-dSPE법에 대하여 저, 중, 고 3가지 농도로 회수율 비교실험을 수행하였다. d-SPE 정제법은 QuEchERS 추출과 함께 주로 병행되는 실험법으로 견과류 중 토코페롤류와 시토스테롤류 분석 연구에서 71~116%의 회수율을 나타내었다15).
본 연구에서는 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소에 적합한 정제 과정을 선택하고 dispersive-SPE (d-SPE)법과 EMR-Lipid-dSPE법을 회수율 실험을 통하여 비교하였다. d-SPE를 이용한 정제법은 QuEChERS 추출액 중 상층액(아세토니트릴 층) 4 mL에 0.
트리코테센계 곰팡이 독소를 분석하기 위해 Agilent LC 1200 HPLC system (Agilent technologies, USA)가 부착된 4000 QTRAP mass spectrometer (AB Sciex, USA)를 이용하였고, 분석용 컬럼은 Imtack C18 (2.0 mm I.D × 50 mm, 3 μm, USA)를 이용하였다. 이동상은 0.
정확성을 확인하기 위하여 회수율을 측정하였다. 회수율은 트리코테센계 곰팡이독소가 검출되지 않은 땅콩에 10종의 혼합 표준용액을 저, 중, 고의 농도로 처리하여 LCMS/MS로 분석하여 검출되는 농도를 확인하였다. 그 결과 Table 5에서 보는 바와 같이 혼합 표준용액에 대한 회수율은 81.
대상 데이터
개발한 시험법의 적용을 위하여 국내 생산되는 대표적인 견과류 중 하나인 땅콩을 선택하였으며, 각 지역별 및 수입품에 대하여 실험을 수행하였다. 총 26종의 땅콩에 대하여 트리코테센계 곰팡이 독소를 분석한 결과(Table 6),충청북도에서 생산된 땅콩 1종에 대해서만 deoxynivalenol 이 검출되었으며, 검출량은 71.
본 실험에서는 견과류 중 트리코테센계 곰팡이 독소 분석을 위하여 국내에서도 생산되는 대표적인 견과류인 땅콩을 선정하였으며, 실험에 사용된 땅콩은 국내 각 지역별 및 중국, 미국, 베트남, 태국에서 생산된 것을 구입하여 사용하였다. 모든 시료는 분쇄기로 균질화한 후 밀봉하여 냉동 보관하여 실험에 사용하였다.
분석 대상 성분의 최적 추출 용매를 선택하는데 있어서 용해도와 극성도는 매우 중요한 요인이 된다. 본 연구에서는 QuEChERS 추출법을 사용하는 기존 문헌에서 트리코테센계 곰팡이독소를 추출하는데 주로 사용되는 아세토니트릴을 용매로 선정하였다. 또한 matrix effect를 최소화하기 위하여 유지를 비롯한 비 간섭물질에 대한 정제과정을 실시하였다.
이론/모형
이는 EMR 흡착제가 물에 의해 활성화가 된 후소수성 상호작용이 증대되어 지질을 효과적으로 제거하는 특성을 나타내기 때문이다17). 따라서 견과류의 트리코테센계 곰팡이 독소를 분석에는 EMR-Lipid-dSPE 정제법이 적합하다고 판단하고 이를 정제방법으로 선택하여 실험을 수행하였다(Table 3).
땅콩에 존재하는 트리코테센계 곰팡이 독소를 분석하기 위하여 단시간에 많은 시료를 처리할 수 있는 QuEChERS 방법을 응용하였다11). 시료 4g을 정밀히 칭량하여 증류수 20 mL를 가한 후 교반하고, 1% formic acid가 함유된 84% 아세토니트릴 20 mL를 넣어 교반한다.
본 연구에 사용된 분석법은 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션에 대한 가이드라인’에 준하여 특이성(specificity), 직선성(linearity), 정밀성(precision), 정확성(accuracy), 검출한계(limit of detection, LOD, S/N =3) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ, S/N =10)로 유효성 검증을 실시하였다12).
이동상의 유속은 300 μL/min으로 하였으며, injection volume은 5 μL로 하였다. 질량분석기로는 전기 분무 이온화(Electrospray Ionization, ESI) 방식을 사용하였으며, 각 독소들의 최적 분석조건들이 다르므로 negative mode와 positive mode에서 MRM (multiple reaction monitoring)방법을 사용하여 분석의 최적 조건을 설정하였다. LC-MS/MS기기에 대한 조건은 Table 1에 나타내었다.
성능/효과
이는 표준용액의 처리 농도와 EMR-lipid의 활성화 차이에 기인한 것으로 판단된다. 본 분석법은 Codex 가이드라인에서 권장하는 회수율 70~120% 및 분석오차 20% 미만에 충족하는 결과로 분석법으로서 적합함을 확인하였다.
개발한 시험법의 적용을 위하여 국내 생산되는 대표적인 견과류 중 하나인 땅콩을 선택하였으며, 각 지역별 및 수입품에 대하여 실험을 수행하였다. 총 26종의 땅콩에 대하여 트리코테센계 곰팡이 독소를 분석한 결과(Table 6),충청북도에서 생산된 땅콩 1종에 대해서만 deoxynivalenol 이 검출되었으며, 검출량은 71.56 μg/kg로 나타났다. 이는 중국에서 유통되는 곡류 및 견과류의 doexynivalenol 오염도를 조사한 결과와 유사한 것으로 땅콩의 경우 시료 95개에서 19.
후속연구
2~1 mg/kg 이하)보다는 낮은 오염도를 나타내었다. 따라서 추후 견과류 중 트리코테센계 곰팡이독소 모니터링 조사를 통한 안전관리 기준 확보가 필요한 것으로 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
곰팡이 독소는 무엇인가?
곰팡이 독소는 식품의 저장, 가공, 유통과정 중에 생성되는 곰팡이의 2차대사산물로서 사람이나 가축에게서 세포독성, 발암성, 변이유발원 등 직접적으로 질병을 유발하거나 생장저하, 면역기능저해, 체중감소 등 간접적으로 작용한다1-4). 트리코테센계(trichothecene) 곰팡이 독소는 Fusarium 속 곰팡이가 생산하는 독소로서 주요 독소로는 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 니발레놀(nivalenol), 제랄레논(zearalenone), 푸모니신(fumonisine) 등이 있다.
EMR-Lipid-dSPE 정제법이 실험에 사용한 곰팡이 독소 10종에 대해 높은 회수율을 나타낼 수 있었던 이유는?
이와 유사하게 식물성 오일 중 농약 분석법연구에서도 PSA, zirconium dioxide-based sorbent (Z-Sep) 및 EMR-Lipid의 회수율을 비교한 결과 EMR-Lipid에서 213개의 농약 중 83%가 70~120% 이상의 회수율을 나타내었다16). 이는 EMR 흡착제가 물에 의해 활성화가 된 후소수성 상호작용이 증대되어 지질을 효과적으로 제거하는 특성을 나타내기 때문이다17). 따라서 견과류의 트리코테센계 곰팡이 독소를 분석에는 EMR-Lipid-dSPE 정제법이 적합하다고 판단하고 이를 정제방법으로 선택하여 실험을 수행하였다(Table 3).
트리코테센계 곰팡이 독소에는 무엇이 있는가?
곰팡이 독소는 식품의 저장, 가공, 유통과정 중에 생성되는 곰팡이의 2차대사산물로서 사람이나 가축에게서 세포독성, 발암성, 변이유발원 등 직접적으로 질병을 유발하거나 생장저하, 면역기능저해, 체중감소 등 간접적으로 작용한다1-4). 트리코테센계(trichothecene) 곰팡이 독소는 Fusarium 속 곰팡이가 생산하는 독소로서 주요 독소로는 데옥시니발레놀(deoxynivalenol), 니발레놀(nivalenol), 제랄레논(zearalenone), 푸모니신(fumonisine) 등이 있다. 트리코테센계 곰팡이 독소는 밀, 보리, 옥수수, 견과류 등에서 빈번히 발생하며, 국내 뿐 아니라 전 세계적으로 오염 사례에 대한 연구가 꾸준히 보고되고 있다.
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