[논문]암세포 성장 저해 및 항염증 효능을 나타내는 산여뀌 성분의 분리

김동화; 이상국; 박희준

암세포 성장 저해 및 항염증 효능을 나타내는 산여뀌 성분의 분리
Isolation of the Constituents with Cancer Cell Growth Inhibition and Anti-inflammatory Activity from Persicaria nepalensis 원문보기

생약학회지, v.50 no.4, 2019년, pp.245 - 252

김동화 (서울대학교 약학대학) , 이상국 (서울대학교 약학대학) , 박희준 (상지대학교 제약공학과)

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This study was initially explored to procure biomaterials capable of inhibiting cancer cell growth from nine Persicaria species (Polygonaceae). The extract of P. nepalensis that was selected from the initial screenings was further fractionated to identify bioactive compounds. The ethyl acetate (EtOAc) fraction was shown to be the most active in the inhibition of cell growth against six cancer cell lines (IC50 value of 3.77-12.87 ㎍/ml). Phytochemical study led to the isolation of two galactolipids of 1,2-di-O-linolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosyl-sn-glycerol (1) and 1-O-linolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosyl-sn-glycerol (2) from the hexane fraction and three phenylpropanoyl sucroses of lapathoside A (3), vanicoside B (4) and lapathoside C (5) from the EtOAc fraction. These isolated compounds have not been reported from this plant. Compounds 3 and 4 exhibited the effective growth inhibition against a panel of cancer cell lines (IC50 value of 6.90-18.09 μM). In addition, the anti-inflammatory activity was evaluated to determine lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) formation in RAW264.7 mouse macrophage cells. The EtOAc fraction (IC50; 34.14 ㎍/ml) and its constituents, 3 (8.55 μM) and 4 (7.83 μM) were shown to be effective in the inhibition of LPS-induced NO production. Therefore, compounds 3 and 4 were considered to be active constituents for anti-inflammatory and antitumor activity from P. nepalensis.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Structure of compounds 1 – 5 isolated from P. nepalensis.
표 Table I. Inhibition activity (IC₅₀) of the MeOH extracts of ten Persicaria species on cancer cell growth in vitro
$Table II. Inhibition activity of the fractions of P. nepalensis on cancer cell growth in vitro$ 표 Table II. Inhibition activity of the fractions of P. nepalensis on cancer cell growth in vitro
그림 Fig. 2. Selected HMBC correlation of compound 1.
그림 Fig. 3. Selected HMBC correlation of compound 2.
표 Table III. Inhibition activity (IC₅₀) of the constituents isolated from P. nepalensis on cancer cell growth in vitro
$Table IV. Inhibition activity (IC<sub>50</sub>) of the fractions of P. nepalensis and the isolated compounds (1 – 5) on LPSinduced NO production and cell viability in RAW 264.7 cells$ 표 Table IV. Inhibition activity (IC₅₀) of the fractions of P. nepalensis and the isolated compounds (1 – 5) on LPSinduced NO production and cell viability in RAW 264.7 cells

AI 본문요약
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문제 정의

Galactolipid에 속하는 화합물 1은 Takahashi 등이⁹⁾ NMR data를 보고한 바 있으나 이에 관하여 보다 자세한 assignment가 없으므로 본 연구를 통하여 assignment를 할 수 있었으므로 그 과정과 결과를 보고한다. 이 화합물은 δ 5.
Panda 등은⁶⁾ 이 계열의 성분에 속하는 lapathoside와 vanicoside 성분들 중 일부가 항종양활성을 나타낸 결과를 발표함에 따라 본 연구자는 강원도에서 수집된 대표적인 여뀌속 식물 추출물에 대하여 암세포에 대한 세포독성을 검색하고자 하였다. 저자들은 강원도 일대에서 서식하는 Persicaria속 식물로서 가시여뀌(P.
이 식물의 활성물질을 확인하기 위하여 식물화학적 실험을 통하여 5종 화합물을 분리하고 그 활성을 검정하였다. 또한, 산여뀌의 추출물과 그 분획물, 그리고 분리된 성분에 대하여 LPS로 유도한 macrophage Raw 264.7 세포를 이용하여 nitric oxide (NO) 생산에 대한 저해능을 평가하여 항염증활성도 알아보고자 하였다.
이 계열의 성분에 속하는 lapathoside와 vanicoside 성분들 중 일부가 항종양활성을 나타낸 결과를 발표함에 따라 본 연구자는 강원도에서 수집된 대표적인 여뀌속 식물 추출물에 대하여 암세포에 대한 세포독성을 검색하고자 하였다. 저자들은 강원도 일대에서 서식하는 Persicaria속 식물로서 가시여뀌(P. dissitiflora), 개여뀌(P. longiseta), 고마리(P. thunbergii), 며느리밑씻개(P. senticosa), 미꾸리낚시(P. sieboldii), 산여뀌(P. nepalensis), 이삭여뀌(P. filiforme), 장대여뀌(P. yokusina var. laxiflora) 및 여뀌(P. hydropiper) 9종 식물을 채집하여 그 추출물에 대한 약리활성을 평가하고자 하였다.

제안 방법

UV spectrum은 UV160A UV-vis recording spectrometer(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였으며, IR spectrum은 JASCO 4200 FT-NMR spectrometer를 이용하여 KBr 디스크법으로 측정하였다. ¹H-, ¹³C-nuclear magnetic resonance(NMR) 스펙트럼과 2D-NMR spectrum은 Bruker AM-600 spectrometer(Bruker, Rheinstetten, Germany)의 제품으로 TMS(tetramethylsilane)를 내부표준물질로 사용하여 측정하였다. 그리고 HR-ESI-MS spectrum은 Synapt G-2(Waters, Miliford, MA) 제품을 사용하여 QTOF(quadrupole time-of-flight) 방식으로 측정하였다.
1시간 후 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)-control을 제외하고 1 μg/mL LPS를 첨가하였다.
30 mL씩 수집하면서 # 17 – 20 및 # 22 – 24 수집액을 농축하여 MeOH에서 각각 재결정하여 화합물 3(31 mg)과 4(39 mg)를 얻었다.
간략히 요약하여, 180 μL의 Griess reagent(0.1% N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride in H2O and 1% sulfanilamide in 5% H3PO4)을 100 μL 배지에 첨가하였다.
그 중 산여뀌가 상대적으로 높은 암세포 독성 효과를 보임에 따라 그 MeOH 추출물의 분획물에 대해서도 효능평가를 실시하였다. 이 식물의 활성물질을 확인하기 위하여 식물화학적 실험을 통하여 5종 화합물을 분리하고 그 활성을 검정하였다.
그리고, 화합물 3과 5는 화합물 4와 같이 phenylpropanoylsucrose구조의 화합물로서 HR-ESI-MS data와 1H-NMR 및 13C-NMR data에 의거하여 각각 6,1'-di-O-feruloyl-3',6'-tri-Op-coumaroylsucrose(3, lapathoside A) 및 6-O-feruloyl-3',6'-di-O-p-coumaroylsucrose(5, lapathoside C)로 동정하였다.
7 cell을10% FBS-DMEM에서 배양하고 24-well plates(2 × 10⁵ cells/mL)에 접종하였다. 다음 날 1% FBS-DMEM으로 교체하고 시료를 처리하였다. 1시간 후 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)-control을 제외하고 1 μg/mL LPS를 첨가하였다.
두 성분은 항염증 효능도 나타냄을 알 수 있었다. 또한, hexane 분획에서 얻은두 화합물 1,2-di-O-linolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosylsn-glycerol 및 1-O-linolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosylsn-glycerol에 대하여 그 NMR assignment를 구체적으로 실시하여 구조 분석을 명확히 하였다. 산여뀌로부터 얻은 이들 5종 성분은 이 식물에서 보고된 바 없다.
Cell Viability Assay 항염증 효과 평가시 사용한 상기 24-well plate에 최종농도를 500 μg/mL으로 한 MTT 용액 각 well에 넣고 37ºC에서 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO)를 가하였다. 세포생존율은 570 nm에서 흡광도를 측정하여 컨트롤 그룹(LPS+)과 비교하여 결정하였다.
1시간 후 NO 생성을 유도하기 위하여 lipopolysaccharide(LPS)-control을 제외하고 1 μg/mL LPS를 첨가하였다. 세포를 18시간동안 배양한 후 Griess 반응을 이용하여 배지의 NO 생성의 양을 측정하였다. 간략히 요약하여, 180 μL의 Griess reagent(0.
배지를 제거한 후 dimethylsulfoxide (DMSO)를 가하였다. 세포생존율은 570 nm에서 흡광도를 측정하여 컨트롤 그룹(LPS+)과 비교하여 결정하였다.
세포증식 실험 – 세포의 증식에 대한 시료의 억제효과는 5종의 세포주에 대해서 모두 sulforhodamine B(SRB) assay로 수행하였다.
, Japan)을 사용하였고, 전개용매로서 CHCl₃-MeOH-H₂O(8:2:1, 하층)을 사용하였다. 송액펌프를 사용하여 전개용매를 전개하였으며 분획수집기를 이용하여 30 mL씩 수집하였다. 수집한 분획들을 TLC로 체크하면서 분획 #6 – 10과 # 31 – 44을 수집하여 각각 농축한 다음 이들을 Sephadex LH-20 column chromatography로 정제하였다.
수집한 분획들을 TLC로 체크하면서 분획 #6 – 10과 # 31 – 44을 수집하여 각각 농축한 다음 이들을 Sephadex LH-20 column chromatography로 정제하였다.
그 중 산여뀌가 상대적으로 높은 암세포 독성 효과를 보임에 따라 그 MeOH 추출물의 분획물에 대해서도 효능평가를 실시하였다. 이 식물의 활성물질을 확인하기 위하여 식물화학적 실험을 통하여 5종 화합물을 분리하고 그 활성을 검정하였다. 또한, 산여뀌의 추출물과 그 분획물, 그리고 분리된 성분에 대하여 LPS로 유도한 macrophage Raw 264.
이 중 산여뀌가 여뀌보다 더 희귀한 자원이기 때문에 본 연구에서는 산여뀌 추출물을 선택하여 용매 극성 정도에 따른 분획물을 제조하고, 각 분획물에 대한 암세포성장 저해 효능을 평가하였다(Table II). 분획을 위한 효능 실험에는 A549, SNU638, HCT116, MDA-MB-231, SK-Hep-1, PC3의 6종 암세포주를 사용하였다.
1에서 그 피크가 나타나 비교된다. 이상과 같이 화합물 1과 2의 NMR spectrum의 assignment의 결과를 재료 및 방법 항에 기술하였다.
한국의 강원도 일대에서 자생하는 9종의 Persicaria속 식물 중 암세포 성장억제 효능을 보인 산여뀌(P. nepalensis)로부터 식물화학적 구조 분석 및 암세포성장 억제와 항염증 효능 평가를 실시하였다. 그 결과, 산여뀌 추출물의 EtOAc분획은 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며, EtOAc분획물에서 얻은 phenylpropanoyl sucrose 계열 성분인lapathoside A와 vanicoside B가 암세포 성장 억제효과를 나타내어 주요 성분임을 알 수 있었다.
한편, 산여뀌의 분획물과 성분이 항염증 활성에도 효과를 나타내는지를 알아 보고자 LPS로 유도한 마우스 macrophage RAW 264.7 세포에서의 NO 생성능에 대한 저해 효과를 평가하였으며 그 결과는 Table IV에 나타내었다. NO는 세포신호전달에 중요한 역할을 하며 염증반응에 깊이 관여하는 것으로 잘 알려져 있다.

대상 데이터

Galactolipid(화합물 1, 2)의 분리 – Hexane 분획물 3.0 g을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리하고자 MPLC column(30 μm, silica gel column, φ 3.0 cm × 30 cm, Yamazen Co., Japan)을 사용하였고, 전개용매로서 CHCl3-MeOH-H2O(8:2:1, 하층)을 사용하였다.
iNOS Assay – 마우스 대식 세포주인 RAW 264.7 cell을10% FBS-DMEM에서 배양하고 24-well plates(2 × 105 cells/mL)에 접종하였다.
기기 및 시약 –물질분리를 위해 사용된 사용된 컬럼은 Yamazen사의 prepacked column(30μm, Japan) 이었으며, TLC plate는 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품을 사용하였다.
따라서, 본 연구에서 산여뀌 추출물로부터의 주요 활성성분 분리는 우선적으로 hexane 분획과 EtOAc 분획을 대상으로 실시하였다. 분리 결과, hexane 분획으로부터 galactolipid에 속하는 화합물 1과 2를 분리하였으며, EtOAc 분획으로부터 phenylpropanoyl sucrose에 속하는 화합물 3, 4, 5를 분리하였다.
0 g을 수득하였다. 본 실험 중 얻은 ether 분획물은 hexane 분획물의 성분과 유사한 경향을 보여 이 분획을 제외한 3종의 분획을 활성실험을 위해 사용하였다.
이 중 산여뀌가 여뀌보다 더 희귀한 자원이기 때문에 본 연구에서는 산여뀌 추출물을 선택하여 용매 극성 정도에 따른 분획물을 제조하고, 각 분획물에 대한 암세포성장 저해 효능을 평가하였다(Table II). 분획을 위한 효능 실험에는 A549, SNU638, HCT116, MDA-MB-231, SK-Hep-1, PC3의 6종 암세포주를 사용하였다. 이 실험에서 40 μg/mL 이하 농도에서 산여뀌 MeOH 추출물은 효과를 나타내지 않았으나 EtOAc 분획물은 9.
세포배양 – 인체 암세포인 폐암 세포(A549), 대장암 세포(HCT116), 유방암 세포(MDA-MB-231), 위암 세포(SNU-638), 간암 세포(SK-HEP-1), 전립선암 세포(PC3) 등의 암세포와 마우스 대식세포(RAW 264.7)을 American Type Culture Collection(ATCC, VA, USA)로부터 제공받았다.
식물재료 – Persicaria속 식물은 강원도 원주시, 영월군, 그리고 평창군 일대에서 채집한 후 건조하여 추출을 위한 재료로 사용하였다(Table I).
세포주들은 10% heat-inactivated fetal bovine serum(FBS) 및 antibiotics-antimycotics(PSF; 100 units/mL penicillin Gsodium, 100 ng/mL streptomycin, and 250 ng/mL amphotericin B)를 추가한 배지를 사용하여 배양하였다. 여기서 SK-HEP-1, MDA-MB-231, RAW 264.7 세포주는 DMEM배지로 배양하였고, 나머지 4종 세포주는 A549, HCT116, SNU-638, PC3에 대해서는 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. 각 세포들 5% CO₂를 함유한 습윤 공기 중에서 37ºC 온도로 유지하였다.
식물재료 – Persicaria속 식물은 강원도 원주시, 영월군, 그리고 평창군 일대에서 채집한 후 건조하여 추출을 위한 재료로 사용하였다(Table I). 특히 식물화학적 분리를 수행한 식물인 산여뀌는 강원도 원주시에서 7월경 전초를 채집하여 세척한 후 건조한 다음 세절하여 실험에 사용하였다. 9종의 식물은 상지대학교 산림과학과 송병민 교수에 의해 동정되었다.

데이터처리

여기서, A는 평균 흡광도를 말한다. IC₅₀ 값은 TableCurve 2D v5.01(Systat Software Inc., San Jose, CA, USA)를 이용하여 비직선 회귀분석을 통하여 계산하였다.

이론/모형

기기 및 시약 –물질분리를 위해 사용된 사용된 컬럼은 Yamazen사의 prepacked column(30μm, Japan) 이었으며, TLC plate는 Merck사(Darmstadt, Germany)의 제품을 사용하였다. UV spectrum은 UV160A UV-vis recording spectrometer(Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였으며, IR spectrum은 JASCO 4200 FT-NMR spectrometer를 이용하여 KBr 디스크법으로 측정하였다. ¹H-, ¹³C-nuclear magnetic resonance(NMR) 스펙트럼과 2D-NMR spectrum은 Bruker AM-600 spectrometer(Bruker, Rheinstetten, Germany)의 제품으로 TMS(tetramethylsilane)를 내부표준물질로 사용하여 측정하였다.
iNOS 억제율은 100 ×[(Atreated–ALPS-)/(ALPS+– ALPS-)]의 계산식을 이용해서 얻었다.
¹H-, ¹³C-nuclear magnetic resonance(NMR) 스펙트럼과 2D-NMR spectrum은 Bruker AM-600 spectrometer(Bruker, Rheinstetten, Germany)의 제품으로 TMS(tetramethylsilane)를 내부표준물질로 사용하여 측정하였다. 그리고 HR-ESI-MS spectrum은 Synapt G-2(Waters, Miliford, MA) 제품을 사용하여 QTOF(quadrupole time-of-flight) 방식으로 측정하였다.
세포증식 백분율(%)은 cell proliferation(%) = 100 × [(Atreated–Azero day)/(Acontrol–Azero day)]의 계산식을 이용해서 얻었다.

성능/효과

NO는 세포신호전달에 중요한 역할을 하며 염증반응에 깊이 관여하는 것으로 잘 알려져 있다.^7,8)실험결과 EtOAc 분획에서 항염증 효능을 나타내었으며, 성분 중에서는 화합물 3과 4가 탁월한 항염증 효과를 가지는 것으로 평가되었다. 이들은 모두 20 μM 이하의 농도에서 macrophage Raw 264.
Hexane 분획도 3종의 세포종에 대하여 28.36 – 39.63 μg/ml에서 효과를 나타내었으나 EtOAc 분획에 비하여는 그 활성이 다소 약함을 알 수 있었다.
pcoumaricacid와 ferulic acid와 같이 α,β-unsaturated carbonyl기를 가지는 moiety가 trans-double bond에 해당하는 J 값이 15.6 – 16.2 Hz로 나타나는 피크가 8개가 나타나므로 이 화합물은 sucrose에 phenylpropanoid가 4분자 결합한 화합물임을 알 수 있었다.
그 결과 산여뀌(P. nepalensis) 추출물이 3종의 암세포에 대하여, 여뀌(P. hydropiper) 추출물이 4종의 암세포에 대하여 100 μg/ml농도 이하에서 성장저해효과를 나타냄을 확인하였다.
nepalensis)로부터 식물화학적 구조 분석 및 암세포성장 억제와 항염증 효능 평가를 실시하였다. 그 결과, 산여뀌 추출물의 EtOAc분획은 높은 암세포 성장 저해효과를 나타내었으며, EtOAc분획물에서 얻은 phenylpropanoyl sucrose 계열 성분인lapathoside A와 vanicoside B가 암세포 성장 억제효과를 나타내어 주요 성분임을 알 수 있었다. 두 성분은 항염증 효능도 나타냄을 알 수 있었다.
본 연구를 통하여 통하여 산여뀌에서 얻은 EtOAc 분획물은 수종의 암세포에 대한 높은 성장저해작용을 나타내었으며, 그 활성분획으로부터 phenylpropanoyl sucrose 성분이 암세포 성장을 효과적으로 억제하며, 동시에 항염증 활성도 나타냄을 확인하였다. 그리고 산여뀌로부터 분리된 성분은 보고된 바 없다.
따라서, 본 연구에서 산여뀌 추출물로부터의 주요 활성성분 분리는 우선적으로 hexane 분획과 EtOAc 분획을 대상으로 실시하였다. 분리 결과, hexane 분획으로부터 galactolipid에 속하는 화합물 1과 2를 분리하였으며, EtOAc 분획으로부터 phenylpropanoyl sucrose에 속하는 화합물 3, 4, 5를 분리하였다.
이 실험에서 40 μg/mL 이하 농도에서 산여뀌 MeOH 추출물은 효과를 나타내지 않았으나 EtOAc 분획물은 9.01 – 38.88 μg/mL에서 6종의 암세포종에 대하여 크게 성장 억제 효과를 나타내었기에 이 분획물이 암세포 성장 억제 효능의 주요 분획일 가능성이 높다고 여겼다.
이들은 그 분광분석치에 의거하여 화합물 1은 1,2-di-Olinolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosyl-sn-glycerol이었으며, 화합물 2는 1-O-linolenoyl-3-O-β-D-galactospyranosyl-snglycerol구조를 가지는 화합물임을 확인할 수 있었다.

후속연구

7 세포에 대한 세포독성은 없이 NO 저해활성에 따르는 항염증 효과를 나타낼 것으로 여겨진다. 이상과 같이 산여뀌 EtOAc 분획물은 phenylpropanoyl sucrose에 따르는 항암 및 항염효과를 나타내어 선도물질로서의 가치가 있을 것으로 기대된다.
Phenylpropanoyl moiety 3개를 가지는 화합물 5는 20 μM 농도에서 효과가 없었으나 4개를 가지는 화합물 3과 4는 큰 암세포성장 저해작용을 나타내었다. 이상과 같이 산여뀌의 EtOAc 분획이 가지는 높은 암세포성장 저해효과는 이들의 phenylpropanoyl sucrose에 기인한 것으로 예상되므로 이를 이용하여 암 치료를 위한 선도물질로 개발할 수 있을 것으로 예상된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	phenylpropanoyl sucrose 화합물이란?	여뀌로부터 vanicoside A - D와2-4) lapathoside A – F5,6) 등 phenylpropanoyl sucrose 성분이 다수 보고되어 있다. Sucrose 구조의 수산기에 주로 p-coumaric acid 혹은 ferulic acid가 에스테르결합하여 생성된 화합물이 phenylpropanoyl sucrose 화합물이다.
	산여뀌의 추출물과 그 분획물은 어떤 효과를 나타내는가?	본 연구를 통하여 통하여 산여뀌에서 얻은 EtOAc 분획물은 수종의 암세포에 대한 높은 성장저해작용을 나타내었으며, 그 활성분획으로부터 phenylpropanoyl sucrose 성분이 암세포 성장을 효과적으로 억제하며, 동시에 항염증 활성도 나타냄을 확인하였다. 그리고 산여뀌로부터 분리된 성분은 보고된 바 없다.
	한국에 자생하는 여뀌과(Polygonacease) 여뀌속(Persicaria species) 식물은 몇 종인가?	한국에 자생하는 여뀌과(Polygonacease) 여뀌속(Persicaria species) 식물은 10여종 이상 서식하고 있다.1) 여뀌속 식물의 대표적인 종은 여뀌(Persicaria hydropiper)로서 그 성분 연구는 비교적 많이 이루어진 바 있다.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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