[논문]분리세균에 의한 진균독소 ochratoxin A의 제거

최호영; 송홍규

doi:10.7845/kjm.2019.8087

분리세균에 의한 진균독소 ochratoxin A의 제거
Removal of mycotoxin ochratoxin A by isolated bacteria 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.55 no.1, 2019년, pp.33 - 38

초록
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진균독소의 한 종류인 ochratoxin A (OTA)는 저장 곡물에 흔한 오염물질로 주로 Aspergillus에 의해 생성되어 인간과 가축의 건강을 위협한다. 이 연구의 목적은 분리 세균Bacillus subtilis AF13과 Streptomyces shenzhenensis YR226의 OTA 제거능을 조사하는 것이다. NB 배지에서 AF13과 YR226은 $100{\mu}g/L$ OTA를 24시간 동안 각각 94.23과 97.73% 제거하였다. 두 균주 배양액의 원심분리 후 분리된 세척 세포와 무세포 상등액의 OTA 제거능을 측정하였는데 두 균주의 상등액 모두 $100{\mu}g/L$ OTA를 수 초 내에 90% 이상 제거하였으며, YR226의 세척 세포도 OTA를 24시간에 98.88% 제거하였다. 배양 상등액의 고압멸균, proteinase K와 chymotrypsin 처리 시 그 OTA 제거능은 영향을 받지 않았으며 이는 두 균주들에 의해 분비된 열-안정성을 가진 비-단백질성 물질이 OTA 제거에 관련된 것을 추정할 수 있다. 이 결과는 AF13과 YR226 균주가 OTA로 오염된 곡물과 사료에서 OTA를 제거하는데 사용될 수 있으며 따라서 농업과 사료 산업에서 경제적 피해를 감소시킬 수 있을 것이다.

Abstract ▼ AI-Helper

Ochratoxin A (OTA), one of mycotoxins produced mainly by Aspergillus is a common contaminant of stored grains, posing health hazards to human and livestock. The aim of this study is to explore ability of isolated bacteria Bacillus subtilis AF13 and Streptomyces shenzhenensis YR226 to remove OTA. AF13 and YR226 could remove 94.23 and 97.73% of OTA ($100{\mu}g/L$), respectively during 24 h incubation in NB medium. When cultures of two strains were separated into washed cells and cell-free supernatant, the supernatant of both strains removed more than 90% of $100{\mu}g/L$ OTA, and 98.88% of OTA could be also removed by the washed cells of YR226. OTA removal occurred in a few second by the supernatant of both strains, and treatments of autoclaving, proteinase K and chymotrypsin did not affect the OTA removal by the culture supernatants, which indicate that some thermostable and non-proteinaceous substances secreted by these bacteria may be involved in OTA removal in these two bacteria. These results suggest that AF13 and YR226 can be used to remove OTA from OTA-contaminated grains and feeds, and therefore decrease economic damage in agriculture and feed industry.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. OTA (100 μg/L) removal by culture supernatant (■) and washed cells (□) of AF13 and YR226 in phosphate buffer (37℃, 150 rpm, 24 h). ***, significant at P < 0.001.
그림 Fig. 2. Time course of OTA (100 μg/L) removal by culture supernatant of AF13 (○) and YR226 (◇) at 37℃.
그림 Fig. 3. Time course of OTA (100 μg/L) removal by washed cells of YR226 (◇) (37℃, 150 rpm, 72 h). **, significant at P < 0.01; ***, significant at P < 0.001.
그림 Fig. 4. Effect of temperature on OTA (100 μg/L) removal in culture of AF13 (○) and YR226 (◇) (150 rpm, 24 h).
표 Table 1. Effect of treatment of heat, proteinase K (1 mg/ml) and chymotrypsin (1 mg/ml) on OTA (100 µg/L) removal by culture supernatant of strains AF13 and YR226

AI 본문요약
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문제 정의

, 2016). 따라서 본 연구에서는 보다 효율적인 OTA 제거를 위해, 새로 분리된 세균 균주의 OTA 제거능과 제거조건 등을 조사하였다.
진균독소의 한 종류인 ochratoxin A (OTA)는 저장 곡물에 흔한 오염물질로 주로 Aspergillus에 의해 생성되어 인간과 가축의 건강을 위협한다. 이 연구의 목적은 분리 세균Bacillus subtilis AF13과 Streptomyces shenzhenensis YR226의 OTA 제거능을 조사하는 것이다. NB 배지에서 AF13과 YR226은 100 μg/L OTA를 24시간 동안 각각 94.

제안 방법

OTA 제거 활성을 가진 세균 균주 분리를 위해 OTA 생성 진균이 생장하기 좋을 것으로 예상되는 다양한 토양을 채취하여 0.85% NaCl 용액에 넣고 추출진탕기(Recipro shaker RS-1, JeioTech)로 진탕하였다[30분, 300 stroke per min (spm)]. 토양 현탁액을 OTA 제거세균 분리용 coumarin 한천배지(CA:coumarin 1 g, KH 2 PO 4 0.
균주 배양액의 단백질성과 비단백질성 물질의 OTA 제거능 조사는 Mitchinson과 Pain (1985)의 방법을 수정하여 수행하였는데, 5일 동안 선 배양한 배양액을 원심분리(1,900 × g, 30분)하여 회수한 상등액 30 ml에 30% 농도로 ammonium sulfate를 첨가하여 진탕하면서 4°C에서 12시간 보관하였다.
균주 배양액의 온도에 따른 균주의 OTA 제거능은 10, 20, 30, 37, 45와 75°C의 조건에서 24시간 동안 수행하였으며, 나머지 모든 실험 조건과 방법은 동일하였다.
균주를 nutrient broth (NB, Difco Lab.)에서 24시간 선 배양한 배양액 5 ml를 45 ml의 NB에 계대하여 120시간 배양한 후배양액 5 ml에 DMSO에 녹인 OTA (Cayman Chemical Co.)를최종 농도 100 μg/L가 되게 첨가하였다.
다양한 환경 요인이 OTA (100 μg/L) 제거능에 미치는 영향을 조사하였는데 먼저 반응시간에 따른 제거능 측정 결과 두균주의 상등액 모두 OTA를 매우 빠른 시간 내에 제거하였다.
단백질 분해효소 처리의 효과는 배양 상등액을 37°C에서 1 mg/ml의 proteinase K (1.4 unit/ml, Sigma-Aldrich Co.)와 α-chymotrypsin (240 unit/mg protein, Sigma-Aldrich Co.)에 각각 반응 후 OTA 제거능을 측정하였다.
두 균주 배양액의 원심분리 후 분리된 세척 세포와 무세포 상등액의 OTA 제거능을 측정하였는데 두 균주의 상등액 모두 100 μg/L OTA를 수 초 내에 90% 이상 제거하였으며, YR226의 세척 세포도 OTA를 24시간에 98.88% 제거하였다.
또한 균주의 제거 능이 세포 또는 배양 상등액에 의한 것인지 알기 위해 NB 배지에서 5일 동안 선 배양한 배양액을 원심분리(1,900 × g, 30분) 하여 세포와 상등액을 분리하였다.
먼저 균주의 배양 상등액을 고압멸균(121°C, 15분) 후 100 μg/L의 OTA 제거능을 측정하였다.
분리 세포는 0.85% NaCl 용액으로 3회 세척 후 인산염 완충액(50 mM, pH 7.0)에 재현탁 하였으며(OD 600 2.0), 상등액은 0.2 μm 공극의 여과막으로 여과하여 위의 방법과 동일하게 진행하여 24시간 후의 제거능을 조사하였다.
분석에는 Symmetry C18 column (150 × 4.6 mm, Waters Co.)을 이용하였으며, 이동상은 물/아세토나이트릴/초산(99:99:2, v/v)이며,column oven의 온도는 30°C, 시료 주입량은 20 μl, 유속은 1 ml/min으로 하여 형광 검출기[Aglilent Technologies, 1260 Infinity, 333 nm excitation, 460 nm emission]를 이용하여 15 분간 분석하였다.
, 2016), 자라난 세균 집락은 새로운 CA 배지에서 3회 계대 배양을 거쳐 순수 분리하였다. 우수한 OTA 제거능을 가진 분리 균주는 (주)코스모진텍에 16S rRNA 유전자 서열분석을 의뢰하였으며 염기서열은 미국 National Center for Biotechnology Information 등록균주의 염기서열과 상동성을 비교하여 동정하였다.
이를 배양하면서(암조건, 37°C, 150 rpm) 일정 시간 배양 후 3개의 복식시료에 즉시 10 ml의 chloroform에 넣고 진탕하여(10분, 300 spm) 잔류 OTA 의 추출을 3회 반복하였다. 이 시료를 감압 증발시킨 후 70% methanol (v/v)로 재용해하여 잔류 OTA를 high performance liquid chromatograph (HPLC; Younglin, YL9100 HPLC System)로 분석하여 균주의 OTA 제거능을 측정하였다. 분석에는 Symmetry C18 column (150 × 4.
이 용액을 원심분리(1,900 × g, 30분)하여, 단백질성 pellet과비단백질성 상등액을 분리 후 pellet은 30 ml의 0.85% NaCl에현탁하고 상등액은 0.22 μm 공극의 여과막으로 여과한 후 OTA를 첨가하여 제거능을 평가하였다.
토양 현탁액을 OTA 제거세균 분리용 coumarin 한천배지(CA:coumarin 1 g, KH 2 PO 4 0.25 g, NH 4 NO 3 1 g, MgSO 4 ･7H 2 O 0.25 g, 한천 16 g, 증류수 1 L, pH7)에 도말하여 30°C, 암조건에서 3~10일 동안 배양하고(Xiong et al., 2016), 자라난 세균 집락은 새로운 CA 배지에서 3회 계대 배양을 거쳐 순수 분리하였다.
1이었다. 한편 반응 시간 별 균주 배양 상등액의 OTA 제거능을 1, 3, 5와 10 초에, 그리고 YR226 세척 세포의 제거능은 1, 3, 6, 24, 48과 72 시간에 측정하였으며, 나머지 모든 실험 조건과 방법은 위와 동일하였다.

데이터처리

모든 실험은 삼반복으로 실시하였으며 통계 분석은 SPSS v. 24.0 (IBM SASS statistics 24)를 이용하여 수행하였으며 Independent two-sample t-test를 통해 대조군과 처리구 사이의 통계적으로 유의한 차이를 조사하였다.

성능/효과

Coumarin 배지를 이용하여 다양한 토양 시료에서 약 350개의 순수 분리 균주를 얻었고, 그 중 OTA 제거능이 가장 우수한 균주는 AF13과 YR226이었다. 균주의 동정은 그람 염색과 형태 학적 분석 후 ㈜코스모진텍에 16S rRNA 유전자 분석을 의뢰하여 얻은 염기서열을 비교한 결과 AF13 균주는 Bacillus subtilis DSM 10, 그리고 YR226 균주는 Streptomyces shenzhenensis 172115과 99% 이상의 상동성을 보였다.
OTA 제거능에 대한 온도의 영향에 대해 평가한 결과, 10에서 75°C 사이에서 AF13과 YR226 균주는 각각 86.08과 94.05% 이상의 높은 OTA 제거 활성을 나타내었다(Fig. 4).
균주 배양액을 세척 세포와 배양 상등액으로 분리하여 100μg/L의 OTA가 첨가된 인산염 완충액에서 24시간 동안 OTA 제거능을 측정한 결과 AF13 균주는 각각 배양 상등액에 의하여 94.34%가 제거되었고, 세척 세포에 의해서는 불과 4.76% 만이 제거되어 세포가 분비한 제거 원인물질이 제거에 주로 관여하는 것으로 나타났으며(Fig. 1), 이는 세포 상등액에 의해 97.6%의 OTA 생분해를 보인 Bacillus subtilis CW14와 매우유사하였다(Shi et al., 2014).
Coumarin 배지를 이용하여 다양한 토양 시료에서 약 350개의 순수 분리 균주를 얻었고, 그 중 OTA 제거능이 가장 우수한 균주는 AF13과 YR226이었다. 균주의 동정은 그람 염색과 형태 학적 분석 후 ㈜코스모진텍에 16S rRNA 유전자 분석을 의뢰하여 얻은 염기서열을 비교한 결과 AF13 균주는 Bacillus subtilis DSM 10, 그리고 YR226 균주는 Streptomyces shenzhenensis 172115과 99% 이상의 상동성을 보였다.
두 균주 모두 고온에서도 OTA 제거능을 나타내어 배양 상등액에 대한 고압멸균의 영향을 조사하였는데 AF13과 YR226 균주의 배양 상등액은 그 보다 낮은 온도에서와 유사하게 OTA 를 각각 95.06과 96.43% 제거하였다. 고압멸균보다 낮지만 10분간 끓인 Fusarium sp.
, 2017). 또한 AF13과 YR226 균주 배양 상등액에 proteinase K 처리 시 OTA를 각각 94.93과 94.91% 제거하였으며, 또 다른 단백질 분해효소인 chymotrypsin 처리 시에도 두 균주의 배양 상등액이 OTA를 각각 94.84와 93.82% 제거하여 비처리 대조구와 거의 동일한 제거 활성을 나타내었다(Table 1). 이 결과들은 두 균주의 OTA 제거가 비효소적 반응에 의한 것임을 나타내는 강력한 증거가 될 수 있으며 초 수준의 매우 신속한 제거도 이를 뒷받침한다고 볼 수 있다(Fig.

후속연구

두 균주의 배양 상등액은 열이나 단백질 분해효소 처리 시 OTA 제거능이 영향을 받지 않았으므로 YR226 균주의 배양 상등액의 단백질을 ammonium sulfate로 염석하여 단백질성 물질과 비단백성 물질로 분리한 후 37°C에서 72시간 동안 OTA 제거능을 측정한 결과 단백질성과 비단백질성 물질의 제거능은 각각 7.81과 90.26%로 OTA제거 대부분이 비단백질성 물질에 의해 일어나는 것을 확인할 수 있었지만, protainase K와 chymotrypsin이 모든 단백질을 분해하는 것이 아니며, 30% ammonium sulfate처리 시에도 모든 단백질이 침전되는 것이 아니기 때문에 비단백성 물질에 의해 분해가 이루어진다고 결론짓기 위해 추가적인 연구가 필요하다.
배양 상등액의 고압멸균, proteinase K와 chymotrypsin 처리 시 그 OTA 제거능은 영향을 받지 않았으며 이는 두 균주들에 의해 분비된 열-안정성을 가진 비-단백질성 물질이 OTA 제거에 관련된 것을 추정할 수 있다. 이 결과는 AF13과 YR226 균주가 OTA로 오염된 곡물과 사료에서 OTA를 제거하는데 사용될 수 있으며 따라서 농업과 사료 산업에서 경제적 피해를 감소시킬 수 있을 것이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	ochratoxin A (OTA)의 특징은 무엇인가?	진균독소의 한 종류인 ochratoxin A (OTA)는 저장 곡물에 흔한 오염물질로 주로 Aspergillus에 의해 생성되어 인간과 가축의 건강을 위협한다. 이 연구의 목적은 분리 세균Bacillus subtilis AF13과 Streptomyces shenzhenensis YR226의 OTA 제거능을 조사하는 것이다.
	10에서 75°C 사이에서 AF13과 YR226 균주는 각각 86.08과 94.05% 이상의 높은 OTA 제거 활성을 나타내므로 알 수 있는 사실은 무엇인가?	4). 이는 제거에 관여하는 물질이 온도에 거의 영향을 받지 않는다는 것을 보이는데 대부분의 OTA 분해 균주들이 중온 범위에서 분해 능을 나타내거나(Shi et al., 2014), 좁은 온도범위에서 최대 활성이 유지되는데(Bellis et al.
	OTA의 열에 안정한 특징이 갖는 문제점은 무엇인가?	OTA는 광범위한 오염 분포를 나타낼 뿐만 아니라, 인간에게 신장 독성, 기형 유발, 면역 독성, 유전 독성 및 신경 독성을 보이고(Wangikar et al., 2005), 열에 안정하여 일반적인 조리와 가공 후에도 제거되지 않아 더욱 문제가 된다. 이에 국제 암연구기관은 OTA를 발암유발 가능물질인 2군으로 분류하였으며 나라별로 식품과 농산물에 엄격한 기준을 정하여 규제하고 있으며(IARC, 1993), 우리나라에도 진균독소 별로 별도의 기준이 존재한다(KMFDS, 2017).

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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