LC-MS/MS를 이용한 식품 중 맥각 알칼로이드 시험법 개발 Development of Analytical Method for Ergot Alkaloids in Foods Using Liquid Chromatoraphy-Tandem Mass Spectrometry원문보기
우리나라의 해외 곡류 수입량과 수입국가의 다변화를 고려 해 볼 때, 호밀, 밀, 귀리 등 맥류에서 주로 발생하는 것으로 알려져 있는 맥각알칼로이드의 노출가능성도 배제할 수 없다. 따라서 본 연구는 곡류 및 곡류가공품 중 맥각알칼로이드에 대한 선제적 안전관리를 위해 호밀 및 가공품 (크래커, 맥주) 으로 부터 에르고메트린을 포함한 12종 맥각알칼로이드의 공인 시험법을 개발하고자 하였다. 아세토니트릴이 함유된 2 mM 탄산암모늄용액 추출과 Mycocep catridge를 이용한 정제 농축이 전처리 방법으로 적합함이 확인되었고, 기기분석을 통해 표준물질 첨가 검량선의 직선성이 12개 알칼로이드 모두 $R^2$ >0.99 이상이었으며, 정량한계는 $0.01{\sim}0.05{\mu}g/kg$수준이었다. 시험법 검증을 통해 대상 품목간의 차이는 있으나, 12개 맥각 알칼로이드 모두 회수율은 72~113% 수준이었으며, 반복성은 2~10% 수준으로 적합성이 확인되었다.
우리나라의 해외 곡류 수입량과 수입국가의 다변화를 고려 해 볼 때, 호밀, 밀, 귀리 등 맥류에서 주로 발생하는 것으로 알려져 있는 맥각알칼로이드의 노출가능성도 배제할 수 없다. 따라서 본 연구는 곡류 및 곡류가공품 중 맥각알칼로이드에 대한 선제적 안전관리를 위해 호밀 및 가공품 (크래커, 맥주) 으로 부터 에르고메트린을 포함한 12종 맥각알칼로이드의 공인 시험법을 개발하고자 하였다. 아세토니트릴이 함유된 2 mM 탄산암모늄용액 추출과 Mycocep catridge를 이용한 정제 농축이 전처리 방법으로 적합함이 확인되었고, 기기분석을 통해 표준물질 첨가 검량선의 직선성이 12개 알칼로이드 모두 $R^2$ >0.99 이상이었으며, 정량한계는 $0.01{\sim}0.05{\mu}g/kg$수준이었다. 시험법 검증을 통해 대상 품목간의 차이는 있으나, 12개 맥각 알칼로이드 모두 회수율은 72~113% 수준이었으며, 반복성은 2~10% 수준으로 적합성이 확인되었다.
Ergot alkaloids are mycotoxin produced by fungi of the Claviceps genus, mainly by Claviceps purpurea in EU. Recently obtained informations indicates necessity for control the ergot in imported grains. Recent occurrence data of ergot alkaloids from EU countries indicate the necessities of management ...
Ergot alkaloids are mycotoxin produced by fungi of the Claviceps genus, mainly by Claviceps purpurea in EU. Recently obtained informations indicates necessity for control the ergot in imported grains. Recent occurrence data of ergot alkaloids from EU countries indicate the necessities of management and control these toxins from the imported grains like rye, wheat, oat etc. The aim of this study is to optimize the liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of ergot alkaloids (ergometrine, ergosine, ergotamine, ergocornine, ergocryptine, ergocristine and their epimers (-inines) from grain and grain-based food. The test method was optimized by extracting the sample with acetonitrile containing 2 mM ammonium carbonate, purification with Mycosep cartridge, and instrumental analysis by LC-MS/MS using Syncronis C18 column. The standard calibration curves showed linearity with correlation coefficents; $R^2$ >0.99. Mean recoveries ranged from 72.0 to 111.3% at three different fortified levels (20, 50, and $100{\mu}g/kg$). The correlation coefficient expressed as precision was within the range of 1.9-12.9%. The limit or quantifications (LOQ) ranged from 0.012 to $0.058{\mu}g/kg$. The developed analytical method met the criteria of AOAC Int. and CAC validation parameters like accuracy and sensitivity. As a result, it was confirmed that the test method developed in this study is suitable for the simultaneous analysis of six species of ergot alkaloid from grains and grain products.
Ergot alkaloids are mycotoxin produced by fungi of the Claviceps genus, mainly by Claviceps purpurea in EU. Recently obtained informations indicates necessity for control the ergot in imported grains. Recent occurrence data of ergot alkaloids from EU countries indicate the necessities of management and control these toxins from the imported grains like rye, wheat, oat etc. The aim of this study is to optimize the liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for determination of ergot alkaloids (ergometrine, ergosine, ergotamine, ergocornine, ergocryptine, ergocristine and their epimers (-inines) from grain and grain-based food. The test method was optimized by extracting the sample with acetonitrile containing 2 mM ammonium carbonate, purification with Mycosep cartridge, and instrumental analysis by LC-MS/MS using Syncronis C18 column. The standard calibration curves showed linearity with correlation coefficents; $R^2$ >0.99. Mean recoveries ranged from 72.0 to 111.3% at three different fortified levels (20, 50, and $100{\mu}g/kg$). The correlation coefficient expressed as precision was within the range of 1.9-12.9%. The limit or quantifications (LOQ) ranged from 0.012 to $0.058{\mu}g/kg$. The developed analytical method met the criteria of AOAC Int. and CAC validation parameters like accuracy and sensitivity. As a result, it was confirmed that the test method developed in this study is suitable for the simultaneous analysis of six species of ergot alkaloid from grains and grain products.
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문제 정의
최근의 연구는 보리, 호밀, 밀, 귀리 등 곡류에 대해 LC-MS/MS를 이용한 시험법을 제시하고있으나14-22), 우리나라는 표준시험법의 부재로 수입·유통 곡류와 곡류 가공식품에 대한 분석 및 모니터링이 보고된 바 없다. 따라서 본 연구는 곡류 및 곡류가공품 중 맥각알칼로이드에 대한 선제적 안전관리를 위해 공인 시험법을 개발하고자 하였다.
우리나라의 해외 곡류 수입량과 수입국가의 다변화를 고려 해 볼 때, 호밀, 밀, 귀리 등 맥류에서 주로 발생하는 것으로 알려져 있는 맥각알칼로이드의 노출가능성도 배제할 수 없다. 따라서 본 연구는 곡류 및 곡류가공품 중 맥각알칼로이드에 대한 선제적 안전관리를 위해 호밀 및 가공품 (크래커, 맥주) 으로 부터 에르고메트린을 포함한 12종 맥각알칼로이드의 공인 시험법을 개발하고자 하였다. 아세토니트릴이 함유된 2 mM 탄산암모늄용액 추출과 Mycocep catridge를 이용한 정제·농축이 전처리 방법으로 적합함이 확인되었고, 기기분석을 통해 표준물질 첨가 검량선의 직선성이 12개 알칼로이드 모두 R2 >0.
제안 방법
선구이온(precursor ion)은 full scan mode 에서 질량 스펙트럼을 확인하여 맥각알칼로이드 12종의 질량 값(exact mass, M)에 양성자(H+)가 결합된[M+H]+ 형태로, 각각의 선구이온으로 에르고메트린 m/z 326, 에르고메트리닌 m/z 326, 에르고신 m/z 548, 에르고시닌 m/z 548, 에르고타민 m/z 582, 에르고타미닌 m/z 582,에르고코르닌 m/z 562, 에르고코르니닌 m/z 562, 에르고크립틴 m/z 575, 에르고크립티닌 m/z 576, 에르고크리스틴 m/z 610, 에르고크리스티닌 m/z 610으로 확인하였다. MS/MS 분석 시 collision energy를 조절하여 생성이온 (product ion)의 감도와 S/N ratio가 최적이 되도록 조정하고, 모든 조건을 만족하는 precursor/product ion pair를 선정하였다. 이를 통해 안정적이고 높은 감도를 나타내는 생성이온을 정량이온으로 하여 최적의 MRM 조건을 확립하였으며, 선정된 이온과 머무름 시간은 Table 2에 나타내었다.
검량선은 각각의 시료가 지닌 매질 특성의 영향을 최소화 하기 위해, 추출 시료의 시험용액에 혼합표준용액을 1, 2, 5, 10, 20, 50 ng/mL 농도로 첨가(matrix-matched) 하였으며, 회수율은 공시험 시료 각각에 혼합표준용액을 가하여 20, 50, 100 μg/kg 농도가 되게 하고, 5반복 시험을 통해 그 결과값과 표준편차(standard deviation)를 구하였다(Table 3).
이 추출용매는 Guo 등25)이 사용한 방법 중 탄산암모늄의 몰 농도를 약간 변형 한 것이다. 곡물의 지방, 단백질, 탄수화물을 제거하기 위해 Mycocep 150 Ergot column, Silica, MCX카트리지를 적용하여 회수율을 확인해보았다. 그 결과 Silica, Mycocep 150 Ergot column 을 사용하는 것이 MCX를 사용하였을 때보다 회수율이 높게 나타났으며, Mycocep 150 Ergot column과 Silica로 정제하였을 경우는 회수율은 유사하나 (Fig.
곡물의 지방, 단백질, 탄수화물을 제거하기 위해 Mycocep 150 Ergot column, Silica, MCX카트리지를 적용하여 회수율을 확인해보았다. 그 결과 Silica, Mycocep 150 Ergot column 을 사용하는 것이 MCX를 사용하였을 때보다 회수율이 높게 나타났으며, Mycocep 150 Ergot column과 Silica로 정제하였을 경우는 회수율은 유사하나 (Fig. 2), Mycocep 카트리지가,Silica 보다 전처리단계가 간단하여 본 연구에서는 전처리시간 단축을 위해 Mycocep column 을 사용하였다.
기기분석은 액체크로마토그래프-질량분석기(LC: Shiseido nanospace II, Japane – MS/MS: AB Sciex QTRAP 4500, USA)로 수행하였으며, 대상 맥각알칼로이드의 분자량 확인 등 일련의 기기분석 조건 설정을 위해, 맥각알칼로이드 12종은 컬럼을 통과하지 않고 표준용액 (100 ng/mL)을질량분석기에 직접 주입하였다.
또한 반복성(repeatability) 확인을 위해 3반복으로 동일 일자와 시간차를 두는 일간 시험을, 재현성(reproducibility) 확인을 위해 타 시험소간의 결과도 비교·확인하였다. 다만, 검출한계(limit of detection, LOD), 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 ICH24)의 가이드라인을 적용하여 검량선을 통해 다음과 같이 산출하였다.
맥각알칼로이드 12종 동시분석법의 선택성 (selectivity), 특이성 (specificity), 직선성 (linearity)을 검증하기 위해 호밀, 크래커, 맥주 공시험 시료 (control), 혼합표준용액, 공시험시료에 혼합표준용액을 첨가하여 크로마토그램을 비교하였다 (Fig. 3-5). 그 결과, 공시험 시료 중 맥각알칼로이드 12종과 같은 머무름 시간을 갖는 어떤 방해물질도 검출되지 않아 분리능과 선택성이 확인되었으나, 매질의 영향도 확인되었다.
맥각알칼로이드 12종의 동시·정량을 위한 LC-MS/MS 기기분석법은, 맥각알칼로이드의 Log Pow 값을 근거로 극성도에 대해 넓은 스펙트럼을 가지며, 분석물질이 분배의 원리로 분리되는 C18 칼럼을 선택하였고, 3 mM 탄산암모늄 용액과 아세토니트릴을 이동상으로 하는 기울기 용리 방식을 선택하였다.
본 시험법의 정확성을 확인하기 위해 호밀, 크래커, 맥주에 맥각알칼로이드 12종 혼합표준용액을 처리농도 20, 50, 100 μg/kg 이 되도록 첨가하여 회수율 실험을 5회 반복하여 수행하였다.
총 12종 표준원액은 갈색 유리병에 각각 담아 -70℃에서 보관하면서 실험 직전에 희석하여 혼합표준용액을 20, 50, 100 μg/L로 조제하여 사용하였다.
대상 데이터
시험용 시료의 선정은 맥각알칼로이드가 주로 검출된다고 보고된5) 곡류(호밀)와 가공품(맥주, 크래커)을 대상으로 시중에서 구입하였고, 분쇄·균질화하여 분석 전까지 냉동고(-20℃)에 보관하였다. 공시험 시료(matrix blank) 는 일련의 시험과정 개발을 통해 맥각 알칼로이드가 검출되지 않음을 확인하여 선정하고, 밀봉된 용기에 담아 -20℃ 이하에서 보관하면서 시험에 사용하였다.
추출시 아세토니트릴은 비극성물질을 상당히 감소시킨다고 보고되어25). 극성과 비극성을 균형화 시키기 위해 아세토니트릴과 2 mM 탄산암모늄 용액을 16:84 (v/v)의 비율로 사용하였다. 이 추출용매는 Guo 등25)이 사용한 방법 중 탄산암모늄의 몰 농도를 약간 변형 한 것이다.
시험용 시료의 선정은 맥각알칼로이드가 주로 검출된다고 보고된5) 곡류(호밀)와 가공품(맥주, 크래커)을 대상으로 시중에서 구입하였고, 분쇄·균질화하여 분석 전까지 냉동고(-20℃)에 보관하였다.
추출 및 분석에 사용한 아세토니트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol) 등은 Merck(Darmstadt, Hesse, Germany)의 HPLC 등급을, 탄산암모늄(Ammonium carbonate, ≥ 99.999%)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)의 특급 또는 분석용을 사용하였다.
추출용매는 맥각알칼로이드의 이성질체가 변형되지 않도록 비양자성 용매 (aprotic solvent)인 아세토니트릴을 사용하였다. 추출시 아세토니트릴은 비극성물질을 상당히 감소시킨다고 보고되어25).
표준품은 Romer사(Tulln, Austria)의 에르고메트린 (98%, Cat. No.002067), 에르고신(95.9%, Cat. No.002068), 에르고타민(95.1%, Cat. No.002069), 에르고코르닌(97.8%, Cat. No.0002064), 에르고크리스틴(98.7%, Cat. No.002065), 에르고크립틴(97.6%, Cat. No.002066)과 각각의 이성질체 에르고메트리닌(98%, Cat. No. LMY-090), 에르고시닌(99%, Cat. No. LMY-089), 에르고타미닌(95.8%, Cat. No.002075) 에르고크립티닌(97.1%, Cat. No.002074), 에르고코르니닌(95.6%, Cat. No.002072), 에르고크리스티닌(96.6, Cat. No. 002073)을 사용하였다. 특히, 에르고메트린, 에르고타민, 에르고타미닌은 마약 원료물질 1급에 해당되어 마약류 관리에 관한 법률 제 4조에 따라 사용을 승인받았다.
데이터처리
또한 반복성(repeatability) 확인을 위해 3반복으로 동일 일자와 시간차를 두는 일간 시험을, 재현성(reproducibility) 확인을 위해 타 시험소간의 결과도 비교·확인하였다.
이론/모형
시험법은 AOAC 가이드라인23)에 따라, 직선성 (linearity), 회수율 (recovery), 반복성 (repeatability), 재현성(reproducibility) 등을 확인하였다. 검량선은 각각의 시료가 지닌 매질 특성의 영향을 최소화 하기 위해, 추출 시료의 시험용액에 혼합표준용액을 1, 2, 5, 10, 20, 50 ng/mL 농도로 첨가(matrix-matched) 하였으며, 회수율은 공시험 시료 각각에 혼합표준용액을 가하여 20, 50, 100 μg/kg 농도가 되게 하고, 5반복 시험을 통해 그 결과값과 표준편차(standard deviation)를 구하였다(Table 3).
이는 Meri Kokkonen과 Marika Jestoi15) 의 연구결과와 유사하게 나타났다. 이러한 이유로 대상 시료 별 매질의 영향을 최소화하기 위해 공시료에 표준물질 첨가 방법의 검량선 작성 방법을 사용하였다. 검량선의 상관계수는 0.
값을 근거로 극성도에 대해 넓은 스펙트럼을 가지며, 분석물질이 분배의 원리로 분리되는 C18 칼럼을 선택하였고, 3 mM 탄산암모늄 용액과 아세토니트릴을 이동상으로 하는 기울기 용리 방식을 선택하였다. 이온화법으로는 전기분무이온화법(ESI)의 positive ion mode 및 multiple reaction monitoring(MRM) mode 조건으로 분석되었다. 선구이온(precursor ion)은 full scan mode 에서 질량 스펙트럼을 확인하여 맥각알칼로이드 12종의 질량 값(exact mass, M)에 양성자(H+)가 결합된[M+H]+ 형태로, 각각의 선구이온으로 에르고메트린 m/z 326, 에르고메트리닌 m/z 326, 에르고신 m/z 548, 에르고시닌 m/z 548, 에르고타민 m/z 582, 에르고타미닌 m/z 582,에르고코르닌 m/z 562, 에르고코르니닌 m/z 562, 에르고크립틴 m/z 575, 에르고크립티닌 m/z 576, 에르고크리스틴 m/z 610, 에르고크리스티닌 m/z 610으로 확인하였다.
성능/효과
본 시험법의 정확성을 확인하기 위해 호밀, 크래커, 맥주에 맥각알칼로이드 12종 혼합표준용액을 처리농도 20, 50, 100 μg/kg 이 되도록 첨가하여 회수율 실험을 5회 반복하여 수행하였다. LC-MS/MS를 사용하여 맥각알칼로이드를 분석한 결과 평균 회수율은 72.0 ~ 113.3% 이였고, 분석오차는 1.1 ~ 10.3%로 확인되었다. 또한 3일간 각 시료에 반복 실험을 진행하여 일간(inter day) 정밀성(변동계수, RSD, %)을 확인한 결과 호밀에서의 3.
2%로 나타내었다(Table 3-5). 그 결과 각 시료별 농도의 유효성검증 결과값이 AOAC 가이드라인의 권장기준을 대부분 충족하여 시험법의 적합성을 확인할 수 있었다.
3-5). 그 결과, 공시험 시료 중 맥각알칼로이드 12종과 같은 머무름 시간을 갖는 어떤 방해물질도 검출되지 않아 분리능과 선택성이 확인되었으나, 매질의 영향도 확인되었다. 특히 에르고타민과 그 이성질체 에르고타미닌에 가장 큰 영향을 받는 것으로 나타났다 (Fig.
3%로 확인되었다. 또한 3일간 각 시료에 반복 실험을 진행하여 일간(inter day) 정밀성(변동계수, RSD, %)을 확인한 결과 호밀에서의 3.3 ~ 8.1%, 크래커에서는 2.7 ~ 5.0%, 맥주에서는 3.1 ~ 10.2%로 나타내었다(Table 3-5). 그 결과 각 시료별 농도의 유효성검증 결과값이 AOAC 가이드라인의 권장기준을 대부분 충족하여 시험법의 적합성을 확인할 수 있었다.
이온화법으로는 전기분무이온화법(ESI)의 positive ion mode 및 multiple reaction monitoring(MRM) mode 조건으로 분석되었다. 선구이온(precursor ion)은 full scan mode 에서 질량 스펙트럼을 확인하여 맥각알칼로이드 12종의 질량 값(exact mass, M)에 양성자(H+)가 결합된[M+H]+ 형태로, 각각의 선구이온으로 에르고메트린 m/z 326, 에르고메트리닌 m/z 326, 에르고신 m/z 548, 에르고시닌 m/z 548, 에르고타민 m/z 582, 에르고타미닌 m/z 582,에르고코르닌 m/z 562, 에르고코르니닌 m/z 562, 에르고크립틴 m/z 575, 에르고크립티닌 m/z 576, 에르고크리스틴 m/z 610, 에르고크리스티닌 m/z 610으로 확인하였다. MS/MS 분석 시 collision energy를 조절하여 생성이온 (product ion)의 감도와 S/N ratio가 최적이 되도록 조정하고, 모든 조건을 만족하는 precursor/product ion pair를 선정하였다.
05 μg/kg수준이었다. 시험법 검증을 통해 대상 품목간의 차이는 있으나, 12개 맥각 알칼로이드 모두 회수율은 72~113% 수준이었으며, 반복성은 2~10% 수준으로 적합성이 확인되었다.
아세토니트릴이 함유된 2 mM 탄산암모늄용액 추출과 Mycocep catridge를 이용한 정제·농축이 전처리 방법으로 적합함이 확인되었고, 기기분석을 통해 표준물질 첨가 검량선의 직선성이 12개 알칼로이드 모두 R2 >0.99 이상이었으며, 정량한계는 0.01 ~ 0.05 μg/kg수준이었다.
그 결과, 공시험 시료 중 맥각알칼로이드 12종과 같은 머무름 시간을 갖는 어떤 방해물질도 검출되지 않아 분리능과 선택성이 확인되었으나, 매질의 영향도 확인되었다. 특히 에르고타민과 그 이성질체 에르고타미닌에 가장 큰 영향을 받는 것으로 나타났다 (Fig. 6). 이는 Meri Kokkonen과 Marika Jestoi15) 의 연구결과와 유사하게 나타났다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
곰팡이독소란?
곰팡이독소(mycotoxin)는 식품과 사료에 오염되어 사람과 동물이 섭취하였을 때 건강상에 유해한 독성인자이다1-3). 곰팡이독소의 인체 유해성에 대한 최초의 보고는 유럽의 맥각중독(ergot-poisoning)연구와 관련이 있다.
맥각 중독이 주로 발생하는 것은?
Anthony’s fire’라고도 불렸으며 프랑스, 인디아, 에티오피아 등에서 발생하여 수 천명의 사망 사고와 다양한 중증 증상이 일어나기도 했다4). 맥각균(Claviceps purpurea)에 오염된 곡물 섭취가 주 원인인 맥각 중독의 독성인자는 맥각알칼로이드로 밝혀졌으며, 특히, 호밀, 밀, 보리, 기장, 귀리 등의 곡물에서 주로 발생한다고 알려져 있다5-7).
호최근 우리나라는 FTA체결에 따라 미국은 물론, 러시아를 포함한 여러 유럽연합 국가에서 호밀, 밀, 보리 등의 곡물을 다량수입하고 있는 것이 시사하는 것은?
최근 우리나라는 FTA체결에 따라 미국은 물론, 러시아를 포함한 여러 유럽연합 국가에서 호밀, 밀, 보리 등의 곡물을 다량수입하고 있는데, 2017년 농림축산식품부의 수출입동향 통계에 따르면 곡물의 수입량이 14,000천톤 이상이다. 이는 유럽에서 주로 발생한 맥각알칼로이드 오염사고의 국내 발생가능성 등의 우려와 이에 대한 안전관리의 필요성 강화 등을 시사한다.
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