[논문]들깨 유전자원의 지방산 변이 및 rosmarinic acid와 caffeic acid의 함량에 따른 항산화 활성 비교

김다정; 정이진; 전영아; 이재은; 이명철; 이호선; 이주희; 성정숙

doi:10.7783/kjmcs.2019.27.2.96

들깨 유전자원의 지방산 변이 및 rosmarinic acid와 caffeic acid의 함량에 따른 항산화 활성 비교
Variation in Fatty Acid Composition, Caffeic and Rosmarinic Acid Content, and Antioxidant Activity of Perilla Accessions 원문보기

韓國藥用作物學會誌 = Korean journal of medicinal crop science, v.27 no.2, 2019년, pp.96 - 107

Abstract ▼ AI-Helper

Background: The aim of this study was to compare the fatty acid composition, antioxidant activity, and the content of two major phenolic acids, caffeic and rosmarinic acids, of 45 Perilla accessions collected from Russia. Methods and Results: A total of 45 accessions of the genus Perilla were used in this study. The antioxidant activities of these accessions were analyzed using a spectrophotometer, and their caffeic and rosmarinic acid contents were determined using a reversed-phase ultraperformance liquid chromatography (UPLC) system. The Perilla seed oil was recovered using hexane in a soxhlet extraction method. The fatty acid compositions were analyzed using a Shimadzu QP2010 gas chromatography-mass spectoroscopy system. The results showed that accessions IT226732 and IT274300 had the highest content of caffeic and rosmarinic acid, respectively. A cluster analysis based on antioxidant assay results and concentration of phenolic acids led to the categorization of Perilla accessions into three major groups. The accessions in Group I were characterized by higher caffeic and rosmarinic acid content and antioxidant activity, compared to the accessions in the other two groups (p < 0.05). The total oil content ranged between 28.39 and 46.89%. The compositions of oleic, linoleic, and linolenic acid ranged from 11.83 to 19.55%, 11.92 to 16.71%, and 59.19 to 67.28%, respectively. Conclusions: The results of this study indicated that accessions IT274300, IT226732, IT274293, IT235818, and IT235820 could be used as a source of functional materials.

주제어

표/그림 (14)

표 Table 1. Conditions of UPLC for identification and determination of caffeic acid and rosmarinic acid.
표 Table 2. Caffeic, rosmarinic acid contents and antioxidant activities of leaf extracts from 45 perilla accessions.
표 Table 2. Continued.
그림 Fig. 1. Peak of caffeic acid was detected at 3.2 min (a) and a peak of rosmarinic acid was found at 11.3 min (b) by UHPLC system.
표 Table 3. Total oil and fatty acid contents of seed extracts from 45 perilla accessions.
표 Table 3. Continued.
표 Table 4. Eigenvector and eigenvalues generated by principal component analysis of perilla 45 accessions.
표 Table 5. Pearson correlation coefficients between antioxidant activities and major phenolic phytochemicals.
표 Table 6. Average values of each groups based on antioxidant activities and major phenolic phytochemicals.
그림 Fig. 2. Hierarchical clustering analysis of antioxidant activities in perilla 45 accessions.
그림 Fig. 3. Relative antioxidant capacity index (RACI) of perilla 48 accessions.
표 Table 7. Eigenvector and eigenvalues generated by Principal Component Analysis of fatty acid composition.
표 Table 8. Pearson correlation coefficients for oil composition ofperilla.
표 Table 9. Average values of each groups based on fatty acidcomposition.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 러시아 지역에서 수집한 들깨 자원을 대상으로 종자의 지방 조성과 들깻잎의 항산화 활성 평가를 하였으며 그 결과에 따라 유용 지방성분 또는 천연 항산화제로 이용가치가 높은 우수한 들깨 유전자원을 선발하여 기능성 천연물 관련 연구 기초자료로 제공하고자 한다.

제안 방법

96 well plate에 1,000 ppm 시료 100 ㎕와 1 N Folin & Ciocalteu’ phenol 100 ㎕를 반응시킨 후 호일을 덮고 3 분간 실온 보관하였다. 2% Na₂CO₃ 100 ㎕ 를 넣은 뒤 호일을 덮고 30 분간 실온에서 반응 후 마이크로플레이트리더 (Eon, BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 750 ㎚로 흡광도를 측정하였다. Garlic acid를 표준물질로 사용하여 측정된 값을 환산하여 비교하였다.
96 well plate에 시료 10 ㎕에 준비한 FRAP용액 300 ㎕를 혼합 후 호일로 빛을 차단하였다. 37℃에서 30 분간 반응시킨 후 마이크로플레이트리더 (Epoch, BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 593 ㎚로 흡광도를 측정하였다. 측정값은 ascorbic acid equivalent 농도로 환산하여 비교하였다.
96 well plate에 sample 100 ㎕ 150 µM DPPH 용액 150 ㎕를 섞어 호일로 빛 차단 후 30 분간 실온에 반응시킨 뒤 마이크로플레이트리더(Epoch, BIO-TEK, Winooski, VT, USA) 를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다. Ascorbic acid equivalent 농도로 환산하여 비교하였다.
Caffeic acid와 rosmarinic acid 성분 분석 및 항산화 활성실험에 사용된 시료는 건조된 들깻잎 2g을 고속용매추출장치 ASE-200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 추출하였으며 추출용매는 75% 에탄올, 질소가스 1,200 psi, 70℃ 조건으로 하였다. 추출된 시료는 진공농축기 HT-4X (American Laboratory Trading Inc.
2% Na₂CO₃ 100 ㎕ 를 넣은 뒤 호일을 덮고 30 분간 실온에서 반응 후 마이크로플레이트리더 (Eon, BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 750 ㎚로 흡광도를 측정하였다. Garlic acid를 표준물질로 사용하여 측정된 값을 환산하여 비교하였다.
Silica capillary 컬럼[HP-INNOWAX (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA, USA), 30 m × 0.32 ㎜ × 0.25 ㎛]을 이용하여, 주입부 온도는 200℃, flame ionization detector는 250℃에서 사용하였고 질소가스 흐름은 0.6 ㎖·min−1를 유지하였다.
처리한 용액을 원심분리 하여 상층액을 취한 후 황산나트륨 (Na₂SO₄)에 반응시킨다. 다시 이를 여과시키고 상층액을 취하여 가스크로마토그래피 (QP2010 Ultra, Shimadzu, Kyoto, Japan)를 이용하여 지방산 조성을 분석하였다. Silica capillary 컬럼[HP-INNOWAX (Agilent Technologies Inc.
들깻잎 시료의 caffeic acid와 rosmarinic acid의 함량은 Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC, 초고속액체크로마토그래피, Agilent 1290 Infinity II LC, Agilent Technologies Co., Ltd., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 측정 하였으며 분석 조건은 Table 1과 같다.
1% ferric chloride 20 ㎕ 분주한 후 호일로 빛을 차단하였다. 상온에서 10 분간 반응시킨 후 마이크로플레이트리더 (Epoch, BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 700 ㎚로 흡광도를 측정하였다. 측정값은 ascorbic acid equivalent 농도로 환산하여 비교하였다.
, East Lyme, CT, USA)를 이용하여 40℃ 조건에서 농축하여 준비하였다. 조지방 함량 분석에 사용된 시료는 건조된 들깨 종자를 5 g을 분쇄하여 준비하였으며 추출된 조지방을 이용하여 지방산 분석 시료로 이용하였다.
조지방 함량을 측정하기 위하여 건조 분쇄하여 준비한 종자 시료 1g에 헥산을 용매로 하여 Soxtec^TM 2043 (FOSS Tecator AB, Hilleroed, Denmark)을 이용하여 분석하였다.
96 well plate에 sample 10 ㎕와 준비된 ABTS 용액 190 ㎕를 섞어 호일로 빛 차단 후 30분간 실온에서 반응시킨 뒤 마이크로플레이트리더 (Epoch, BIO-TEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 734 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 ascorbic acid equivalent 농도로 환산하여 비교하였다.

대상 데이터

본 연구에 사용된 러시아 수집 들깨 [Perilla frutescensvar. japonica (Hassk.) Hara.] 45 자원과 한국 대조품종 3 자원은 농업유전자원센터 보존자원을 이용하였으며 2017년 전라북도 전주 소재 시험포장에서 표준재배법을 적용하여 재배하여 수확하였다.
Caffeic acid와 rosmarinic acid 성분 분석 및 항산화 활성실험에 사용된 시료는 건조된 들깻잎 2g을 고속용매추출장치 ASE-200 (Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 추출하였으며 추출용매는 75% 에탄올, 질소가스 1,200 psi, 70℃ 조건으로 하였다. 추출된 시료는 진공농축기 HT-4X (American Laboratory Trading Inc., East Lyme, CT, USA)를 이용하여 40℃ 조건에서 농축하여 준비하였다. 조지방 함량 분석에 사용된 시료는 건조된 들깨 종자를 5 g을 분쇄하여 준비하였으며 추출된 조지방을 이용하여 지방산 분석 시료로 이용하였다.
항산화 활성 평가용 시약인 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS), 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazil (DPPH), folin–Ciocalteu reagent, potassium ferricyanide [K3Fe(CN)6], phosphate buffer (NaH2PO4-Na2HPO4), trichloroacetic acid (TCA), ferric chloride(FeCl3·6H2O), sodium acetate (CH3COONa), HCl, acetic acid, 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ) 및 표준품으로 사용한 gallic acid, L-ascorbic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

데이터처리

Reducing Power (RP). Pearson correlation coefficients was conducted using average values of each variable (n = 45) by R statistical analysis. *Correlation is significant p ≤ 0.
모든 실험의 결과의 통계분석은 R 프로그램 (www.rproject.org, R i386 3.5.1, Vienna, Austria)를 이용하였으며, p < 0.05의 조건에서 값의 유의성을 인정하였다.

이론/모형

Yen 과 Chen (1995)의 방법을 참고하여 reducing power assay를 통해 항산화 활성을 측정하였다. 1.
라디칼 제거 활성을 측정할 수 있는 ABTS assay는 Re 등(1999)의 방법을 참고하였다. ABTS용액은 7 mM ABTS와 2.
라디칼 제거 활성을 측정할 수 있는 DPPH assay는 Piao 등 (2013)의 방법을 참고하였다. 96 well plate에 sample 100 ㎕ 150 µM DPPH 용액 150 ㎕를 섞어 호일로 빛 차단 후 30 분간 실온에 반응시킨 뒤 마이크로플레이트리더(Epoch, BIO-TEK, Winooski, VT, USA) 를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.
총 폴리페놀 함량은 Waterhouse (2002)의 Folin-Ciocalteu 방법을 참고하여 측정하였다. 96 well plate에 1,000 ppm 시료 100 ㎕와 1 N Folin & Ciocalteu’ phenol 100 ㎕를 반응시킨 후 호일을 덮고 3 분간 실온 보관하였다.
항산화 활성을 측정할 수 있는 FRAP assay는 Benzie 과 Strain (1996)의 방법을 참고하였다. FRAP용액은 0.

성능/효과

ABTS는 RP와 0.906*, 총 폴리페놀 함량과 0.902* 의 높은 양의 상관관계를 보였으며 rosmarinic acid와 항산화 활성평가 값들과의 상관관계는 모두 0.7이 넘는 높은 양의 상관관계를 보였다 (p ＜ 0.05) (Table 5).
ABTS의 양이온 소거능을 측정한 결과, 러시아 자원의 평균값은 129.52 ㎍·ASCE·㎎-1 DE의 값을 보였으며 86.33 -190.59 ㎍·ASCE·㎎-1 DE의 넓은 범위를 보였다.
FRAP 평가 결과, 한국 대조품종 안유, 다유, 대유의 값은 146.12, 49.15, 129.45 ㎍·ASCE·㎎-1 DE로 러시아 자원의 평균값인 194.70 ㎍·ASCE·㎎-1 DE보다 낮은 값을 보였다.
Rosmarinic acid의 성분이 높게 함유된 자원 (IT274300)은 RP를 제외한 나머지 항산화 활성 평가 값에서도 가장 높게 나타난 것을 확인 할 수 있었다. RP에서는 IT274293 자원이 264.
UHPLC를 통한 분석 결과 3.2 분에 caffeic acid, 11.3 분에 rosmarinic acid가 검출되었다 (Fig. 1).
4%를 해석 가능하며 이를 설명하는데 oleic acid와 linolenic acid의 기여도가 높았다 (Table 7). linolenic acid와 oleic acid는 -0.825로 강한 음의 상관관계를 보였으며 palmitic acid와 조지방 성분 또한 -0.747의 높은 음의 상관관계를 보였다 (p ＜ 0.05) (Table 8). 군집분석 결과 3 개의 그룹으로 나뉘어졌으며, 그룹 III (28 자원)은linolenic acid 성분이 65.
가장 높은 값을 보인 자원은 IT274300이었으며, 한국 대조품종 중 가장 높은 값을 보인 대유는 129.45 ㎍·ASCE·㎎-1 DE로 러시아 자원의 평균값과 비슷한 값을 보였다 (Table 2).
각 수집자원의 DPPH radical 소거 활성을 측정한 결과, 한국 대조품종 중 가장 높은 값을 보인 대유는 90.08 ㎍·ascorbic acid equivalent (ASCE)·㎎-1 DE 값을 보였으며 러시아 자원의 평균값은 86.64 ㎍·ASCE·㎎-1 DE로 안유 (76.29 ㎍·ASCE·㎎-1DE), 다유 (19.26 ㎍·ASCE·㎎-1 DE)보다 높은 값을 보였으며, 러시아 수집 자원은 68.11 - 94.80 ㎍·ASCE·㎎-1 DE범위의 값을 보였으며 가장 높은 값을 보인 자원은 IT274300였다 (Table 1).
각 자원의 환원력 측정을 위해 RP assay를 진행한 결과 한국 대조품종 대유의 값은 145.25 ㎍·ASCE·㎎-1 DE, 안유는 115.56 ㎍·ASCE·㎎-1 DE, 다유는 7.16 ㎍·ASCE·㎎-1 DE의 값을 보였다.
05) (Table 8). 군집분석 결과 3 개의 그룹으로 나뉘어졌으며, 그룹 III (28 자원)은linolenic acid 성분이 65.37%로 다른 그룹에 비하여 높게 나타났으며 그룹 I (5 자원)은 oleic acid 성분이 17.16%로 다른 그룹보다 높게 나타났다 (Table 9).
들깨 종자의 지방산 구성은 포화 지방산보다 불포화 지방산의 함량이 높게 함유되어 있으며, 지방산 조성 중 가장 높은 함량을 보인 linolenic acid는 평균 64.18%의 값을 보였으며 59.19 - 67.28%의 범위를 보였다. 그 다음으로 높은 함량을 가진 oleic acid와 linoleic acid가 각각 14.
러시아 수집 들깨 [Perilla frutescens var. japonica(Hassk.) Hara.] 자원의 총 폴리페놀 함량은 평균 112.54 ㎍·gallic acid equivalent (GAE)·㎎-1 dried extract (DE)을 보였으며 88.77 - 148.85 ㎍·GAE·㎎-1 DE의 범위를 보였다.
러시아 수집 들깻잎의 caffeic acid와 rosmarinic acid 함량 측정값과 항산화활성 평가 값의 군집분석 결과 3 개의 그룹으로 나뉘어 졌으며 그룹 I 은 높은 caffeic acid (0.86 ㎎·g-1), rosmarinic acid (83.43 ㎎·g-1) 성분, 높은 항산화 활성 값을 보이며 총 9개의 자원이 포함되어 있다.
18%로 높은 함량을 보였다. 러시아 자원의 평균 함량이 3 개의 한국 대조품종 자원 안유(60.80%), 다유 (59.32%), 대유 (59.74%)의 함량보다 높게 나타났으며 그 중 가장 높은 함량을 보인 자원은 67.28%(IT235818) 그 다음 높은 함량을 보인 자원은 67.17%(IT235820) 값을 보였다.
본 연구 결과에 따르면, IT274300는 총폴리페놀 함량(148.85 ㎍·GAE·㎎-1 DE), DPPH (94.80 ㎍·ASCE·㎎-1 DE),ABTS (190.59 ㎍·ASCE·㎎-1 DE), FRAP (326.39 ㎍·ASCE·㎎-1DE)에서 가장 높은 값을 보였고, IT274293는 RP(264.88 ㎍·ASCE·㎎-1 DE)에서 가장 높은 값을 보였다.
본 연구결과 들깻잎의 한국품종 중 가장 높은 함량을 가진 대유는 46.38 ㎎·g-1 이였으며, 러시아 수집자원 중 가장 높은 함량을 가진 자원은 98.5 ㎎·g−1(IT274300)으로 대유의 약 2 배 높은 함량을 보였다 (Table 2).
상대 항산화능 지수 결과, 한국 대조품종 대유는 0.06으로 22 순위, 안유는 –0.76으로 42 순위, 다유는 –3.78로 48 순위를 보였으며 러시아 수집자원 중 상위 3 자원 IT274300, IT226732, IT274293은 2.12, 1.56, 1.52로 한국 대조품종과 비교하여 높은 상대 항산화능 지수를 보였다 (Fig. 3).
71%의 범위를 보였다. 상대적으로 낮은 함량을 가진 palmitic acid, stearic acid는 6.37%, 1.62%의 평균값을 보였으며 5.57 - 7.09%, 1.16 -2.27%의 범위를 보였다 (Table 3).
조지방 함량과 지방산 조성의 주성분 분석 결과 제 1, 제 2주성분으로 전체 변이의 74.4%를 해석 가능하며 이를 설명하는데 oleic acid와 linolenic acid의 기여도가 높았다 (Table 7). linolenic acid와 oleic acid는 -0.
4. 조지방 함량 및 지방산 조성

조지방 함량은 평균 38.76%를 보였으며 가장 낮은 값은 28.39% (IT220391), 가장 높은 값은 46.89% (IT220389)으로 확인되었다. 다음으로 높은 값을 보이는 자원은 46.
조지방 함량은 한국 대조품종인 다유 (47.71%)가 가장 높은 값을 보였으며 러시아 자원 중 가장 높은 함량을 가진 자원은 46.89% (IT220389)로 한국 대조품종인 안유 (45.56%), 대유(35.66%)보다 높은 값을 보였다.
주성분 분석 결과 제 1, 제 2 주성분으로 전체 변이의 89.5%를 해석 가능하며 제 1 주성분만으로도 76.9%를 해석할 수 있었고 ABTS 값과 총 폴리페놀 함량의 기여도가 높았다(Table 4).
한국 대조품종 다유의 경우 29.32 ㎍·GAE·㎎-1 DE의 낮은 폴리페놀 함량을 보였으며 대유의 경우 107.54 ㎍·GAE·㎎−1 DE의 함량으로 한국 대조품종 중 가장 높은 값을 보였으나 러시아 수집자원 평균보다 낮은 값을 보였다.
한국 대조품종인 안유(0.73 ㎎·g-1), 다유 (0.37 ㎎·g-1)가 러시아 수집자원 평균 함량인 0.78 ㎎·g-1보다 낮은 함량을 보였으며 가장 높은 caffeic acid를 함유한 자원은 IT226732 (1.09 ㎎·g-1)으로 한국 대조품종 중 가장 높은 함유량을 보인 대유 (0.90 ㎎·g-1)보다 높은 함량을 보였다.
한국 대조품종인 안유는 30.22 ㎎·g-1, 다유는 4.47 ㎎·g-1로 러시아 수집자원 평균 함량인 60.75 ㎎·g-1보다 낮은 함량을 보였으며 가장 높은 rosamrinic acid를 함유한 자원은 IT274300 (98.50 ㎎·g-1)으로 한국 대조품종 중 가장 높은 함유량을 보인 대유(46.38 ㎎·g-1)의 약 2 배 높은 함량을 보였다 (Table 2).

후속연구

또한, 항산화성분 고함량 유용자원을 선발 활용함으로서 기능성 성분 확보에 투자되는 비용절감과 시장활성화가 기대된다. 향후, 국가보존 들깨 자원에 대한 대량평가를 수행하여 보다 양질의 들깨 자원을 선발하여 관련연구자들에게 정보와 자원을 공유할 수 있도록 연구를 지속할 예정이다.
본 연구 결과, 러시아 수집 자원 중 한국 대조품종 안유, 다유, 대유와 비교하여 rosmarinic acid 함량이 높고 항산화 활성이 높게 나타난 IT274300, IT226732, IT274293과 linolenic acid 함량이 높은 IT235818, IT235820자원은 기능성 들깨 연구의 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 사료된다.
또한, 항산화성분 고함량 유용자원을 선발 활용함으로서 기능성 성분 확보에 투자되는 비용절감과 시장활성화가 기대된다. 향후, 국가보존 들깨 자원에 대한 대량평가를 수행하여 보다 양질의 들깨 자원을 선발하여 관련연구자들에게 정보와 자원을 공유할 수 있도록 연구를 지속할 예정이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	활성산소의 특징?	최근 다양한 질병의 원인으로 알려진 활성산소 (reactive oxygen radical, ROS)는 쌍을 이루지 못한 전자에 의해 높은 반응성을 가지며 이는 산화적 스트레스의 직접적 원인이 된다. 활성산소는 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 손상을 일으키며, 돌연변이, 세포독성, 심혈관계 질환, 암, 동맥경화, 신경 전달물질에 영향을 미치는 등 인체 내 치명적인 문제를 주게 된다.
	들깨 종실의 성분과 효능은 무엇인가?	들깨 종실은 예로부터 기름을 짜거나 가루로 만들어 식용으로 많이 이용되어져 왔으며 최근에는 기능성 식품으로 체내에서 생성하지 못하여 필수로 섭취해야하는 오메가-3 지방산이 많이 포함되어있어 들기름에 대한 주목도가 더욱 높아지고 있다. 들깨 종실에는 α-linolenic acid가 높은 함량으로 포함되어 있는데 이는 체내에서 DHA와 EPA로 변하여 혈중 콜레스테롤을 낮추며, 항암 효과, 뇌의 기능을 촉진하는 효과 등이 알려져 있다.
	천연 항산화제를 통해 활성산소를 제거하고자 하는 연구가 활발한 이유는 무엇인가?	최근 다양한 질병의 원인으로 알려진 활성산소 (reactive oxygen radical, ROS)는 쌍을 이루지 못한 전자에 의해 높은 반응성을 가지며 이는 산화적 스트레스의 직접적 원인이 된다. 활성산소는 체내 고분자들을 공격하여 세포와 조직에 손상을 일으키며, 돌연변이, 세포독성, 심혈관계 질환, 암, 동맥경화, 신경 전달물질에 영향을 미치는 등 인체 내 치명적인 문제를 주게 된다. 따라서 체내 활성산소를 제거하기 위해 다양한 연구가 진행되고 있을 뿐 아니라 (Jennings and Barnett, 1988; Fridovich, 1989) 천연 항산화제에 대한 연구 또한 활발히 진행되고 있다 (Um et al.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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