[논문]사상자 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 효과

남건희; 위지향; 김상용; 백지영; 김영민

doi:10.5352/jls.2019.29.9.1016

사상자 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 효과
Inhibitory Effect of the Ethanol Extract of Torilis Japonica Decandolle on Adipocyte Differentiation in 3T3-L1 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.29 no.9, 2019년, pp.1016 - 1022

남건희 (한남대학교 생명나노대학 생명시스템과학과) , 위지향 (신안산대학교 식품생명과학과) , 김상용 (신안산대학교 식품생명과학과) , 백지영 ((주)파마진) , 김영민 (한남대학교 생명나노대학 생명시스템과학과)

초록
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고령화 사회에서 비만을 예방하는 것에 대한 관심이 높아지는 추세에 따라, 남성과 여성 모두 비만 관리에 상당한 비용과 노력을 지불하고 있는 실정이다. 본 연구에서는 항비만 효과를 증명하기 위해서는 3T3-L1 지방전구세포를 이용한 연구가 필수적으로 수행되기 때문에, 3T3-L1 지방전구세포에서 항비만 효과를 지닌 천연물에 조사하였다. 70% 에탄올을 이용한 사상자(Torilis Japonica Decandolle) 추출물이 3T3-L1 지방전구세포에서 성숙한 지방세포로의 분화에 미치는 효과를 Oil red O assay, western blot을 통해 확인하였다. 대조군에 비해 사상자 추출물의 $100{\mu}g/ml$ 농도에서 지방세포 분화와 세포 내 triglyceride (TG) 수준을 효과적으로 억제하였다. TG 함량 감소 메커니즘을 규명하기 위해, peroxisome-proliferatorsactivated-receptor-${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$) 및 CCAAT enhancer-binding-proteins-${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), acetyl-CoA carboxylase (ACC)의 인산화 등 항비만 관련 단백질의 표현 수준을 확인하였다. 그 결과, 사상자 추출물은 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, ACC 인산화 단백질의 발현 정도를 현저하게 감소시켰다. 종합하자면, 사상자 추출물이 비만 예방에 가장 효과적인 후보임을 명백하게 보여준다. 더 나아가서, 천연물인 사상자의 항비만 효과에 핵심적인 역할을 수행하는 활성 화합물을 탐색 및 분리하기 위한 추가 연구가 필요하다고 사료된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Owing to increased interest in preventing obesity in an aging society, both men and women spend considerable amount of cost on obesity managements. In this study, we investigated the natural substances on anti-obesity activities in 3T3-L1 pre-adipocytes. Also, to improve anti-obesityeffects, research using 3T3-L1 pre-adipocytes cells is crucial. The anti-obesity effect of 70% ethanol extract from Torilis Japonica Decandolle on the differentiation of 3T3-L1 pre-adipocytes to adipocytes was investigated by suppressing adipocyte differentiation and lipid accumulation with Oil Red O assay, and western blot analysis. Compared to the control, 70% ethanol extract of Torilis Japonica Decandolle was significantly inhibited adipocyte differentiation and intracellular triglyceride (TG) level at a concentration of $100{\mu}g/ml$. To determine the mechanism of reduction in TG content, we determined the level of protein expression of obesity-related proteins, such as peroxisome-proliferatorsactivated-receptor-${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$) and CCAAT enhancer-binding-proteins-${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), and Acetyl-CoA carboxylase (ACC) phosphorylation. As a results, 70% ethanol extract of Torilis Japonica Decandolle significantly decreased protein expression of $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$ and ACC phosphorylation. These results indicate that 70% ethanol extract of Torilis Japonica Decandolle is the most effective candidate for preventing obesity. However further studies will be needed to identify the active compounds that confer the anti-obesity activity of Torilis Japonica Decandolle.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. Comparison of yield and proteins content by ethanol concentration
그림 Fig. 1. Effect of 70% ethanol extract of Torilidis Japonica Decandolle on cell viability in 3T3-L1 adipocytes.
그림 Fig. 2. Inhibitory effects of extracts from 70% ethanol extract of Torilidis Japonica Decandolle on the lipid accumulation in 3T3-L1.
그림 Fig. 3. Inhibitory effects of extracts from 70% ethanol extract of Torilidis Japonica Decandolle on the intracellular triglyceride in 3T3-L1.
그림 Fig. 4. Effects of extracts from 70% ethanol extract of Torilidis Japonica Decandolle on PPARγ, C/EBPα and phosphorylation of ACC protein expressions in 3T3-L1.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 사상자 과실의 에탄올 추출물이 지방세포분화 및 지방 축적에 미치는 영향을 분석해 봄으로써 사상자에탄올 추출물의 산업적 이용 가능성 및 가치를 검토해 보고자 한다.

제안 방법

24-well plate에 well당 1×106 3T3-L1 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양되었을 때, MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도별로 처리하였다.
2일 후 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)와 MDI 용액(0.5 mM 3-isobuty-1-methylxanthine, 0.5μM dexamethasone, 10 μg/ml insulin)을 포함한 DMEM 배지를 3일 동안 처리하였고 다시 10% 소태아혈청과 10 μg/ml 인슐린을 포함한 DMEM을 3일 동안 2회 총 6일 동안 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다.
2일 후에 10% FBS, Insulin 1 μg/ml insuli이 포함된 DMEM 배지와 시료를 처리하고 2일 간격으로 배지를 교환하면서 8일 동안 분화를 시켰다.
Effect of 70% ethanol extract of Torilidis Japonica Decandolle on cell viability in 3T3-L1 adipocytes. 3T3-L1 preadipocytes were maintained with adipocyte-induction media for 9 days and treated with extracts from Torilidis Japonica Decandolle every 2 days. Cell viability was calculated as a percentage of MTT metabolism in controls.
구입시료를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 분쇄된 사상자 분말을 이용하여 ethanol로 추출하였다. Ethanol (w/v)을 첨가하여 완전히 침지한 후, 상온에서 72시간 동안 환류 추출을 실시하였다. 얻어진 ethanol 사상자 추출물을 pore size 6 μm paper filter (Advantec, Korea)로 여과를 진행 한 후 5 μm paper filter (Advantec, Korea)로 2차 여과를 진행하여 잔사를 모두 제거하였다.
본 실험에 사용된 사상자는 경상북도 영천(goodherb, YeongCheon, Korea)의 농장에서 8~9월에 재배된 것을 이용하였다. 구입시료를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 분쇄된 사상자 분말을 이용하여 ethanol로 추출하였다. Ethanol (w/v)을 첨가하여 완전히 침지한 후, 상온에서 72시간 동안 환류 추출을 실시하였다.
세척 후, anti-Rabbit IgG (CellSignaling Technology, Beverly, USA)를 2차 항체로 반응시켰다. 그 후 Amersham ECL prime western blotting detectionreagent (Piscataway, NJ, USA)를 처리하고 이미지 리더(Supernova 1800; Lugen Sci Co., Ltd., Korea)로 분석하였다.
그 후 PPARγ 항체, C/EBPα 항체, AMPK 항체, p-AMPK 항체, p-ACC 항체, 그리고 β-actin 항체(CellSignaling Technology, USA)를 1:1,000 비율로 희석하여 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다.
단백질 30 μg을 4-10% 젤(Lifetechnologies, Korea)을 사용하여 전개(running)한 후 PVDFmembrane (Life technologies, Korea)에 transfer 시켰다.
반면에, 150 μg/ml 농도에서부터 미처리군과 비교하여 유의성이 있는 차이(*p<0.05)가 있는 것으로 보아, 세포독성이 나타나는 것을 하였다.
2일 후에 10% FBS, Insulin 1 μg/ml insuli이 포함된 DMEM 배지와 시료를 처리하고 2일 간격으로 배지를 교환하면서 8일 동안 분화를 시켰다. 분화억제 정도를 위상차 현미경으로 관찰, 촬영하고 Oil-Red-Ostaining을 통해 분석하였다. 지방 세포 분화가 끝난 세포를 phosphate buffered saline (PBS; Thermo Fisher Scientific,USA)을 넣어 3회 세척한 후 10% formalin으로 고정하고, Oil-Red-O staining solution으로 10분간 염색하였다.
사상자 에탄올 추출물에 대한 3T3-L1 adipocytes의 세포생존율을 측정하기 위해 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150 μg/ml의 농도로 각 시료를 처리한 후, MTT assay를 실시하였다(Fig.1).
사상자 에탄올 추출물이 3T3-L1 지방세포(adipocyte)의 지방적(lipid droplet) 형성을 얼마나 저해할 수 있는지 확인하기 위하여 Oil Red O 염색을 실시하였다. 지방세포로 분화가 완료된 control 그룹과 지방세포에 사상자 에탄올 추출물을 세포독성이 나타나지 않는 범위 이내에서 농도별(80-100 μg/ml)로처리한 결과(Fig.
사상자를 이용하여 에탄올 농도별 추출 수율과 단백질 함량차이를 측정하였다(Table 1). 사상자 추출물을 동일한 조건에서 감압, 농축하여 에탄올을 모두 제거한 후에 동결건조하여 수율 및 단백질 함량 등을 조사한 결과, 70% 에탄올을 통한 추출 조건에 수율 및 단백질 함량 면에서 우수하며, 95%에 비해 가격적인 면에서도 이점을 갖기 때문에 본 연구에서 중점적으로 사용하였다.
사상자를 이용하여 에탄올 농도별 추출 수율과 단백질 함량차이를 측정하였다(Table 1). 사상자 추출물을 동일한 조건에서 감압, 농축하여 에탄올을 모두 제거한 후에 동결건조하여 수율 및 단백질 함량 등을 조사한 결과, 70% 에탄올을 통한 추출 조건에 수율 및 단백질 함량 면에서 우수하며, 95%에 비해 가격적인 면에서도 이점을 갖기 때문에 본 연구에서 중점적으로 사용하였다.
사상자의 에탄올 농도별 수율 차이를 비교 확인해 보기 위하여 경상북도 영천(goodherb, YeongCheon, Korea)의 농장에서 8~9월에 재배된 사상자를 구입하여, 50, 70, 95% 에탄올 추출을 실시하여 얻어진 추출물의 수율 및 단백질 함량을 비교분석하였다.
사상자의 에탄올 추출물이 지방세포의 분화를 억제한다는 결과를 토대로 이러한 과정에 영향을 미치는 여러 인자들의 분자생화학적 기전을 규명하기 위해 C/EBPα, PPARγ와 ACC의 단백질 발현량을 조사하였다.
세포내 단백질의 발현은 SDS-PAGE를 사용하여 확인하였다. 시험이 완료된 세포를 PBS 용액으로 세척한 후, RIPA lysisbuffer (Life technologies, Korea)를 넣고 4℃에서 1시간 용해시켰다.
세포를 수거하여 16,600× g, 4℃에서 20분간 원심분리한 후 상층액을 회수하여 BSA Solution (Amersham, USA)를 사용하여 단백질을 정량하였다.
얻어진 ethanol 사상자 추출물을 pore size 6 μm paper filter (Advantec, Korea)로 여과를 진행 한 후 5 μm paper filter (Advantec, Korea)로 2차 여과를 진행하여 잔사를 모두 제거하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용된 사상자는 경상북도 영천(goodherb, YeongCheon, Korea)의 농장에서 8~9월에 재배된 것을 이용하였다. 구입시료를 분쇄기를 이용하여 분쇄한 후, 분쇄된 사상자 분말을 이용하여 ethanol로 추출하였다.
분화용 배지는 10% FBS, 1 μg/ml insulin, 0.1 μM dexamethasone (Dex), 0.5 μM isobutyl-1-methylxanthine (IBM)가 포함된 DMEM 배지를 사용하였다.
2일 동안 더 배양한 후에 분화유도 배지에 추출물을 함께 처리하였다. 세포 분화 유도는 2일 동안 유도한 후 2일 마다 10% 소태아혈청 DMEM 배지로 교환하여 9일 동안 배양하였다. 배양하는 배양액에 추출물을 같이 처리하였다.
실험에 사용된 3T3-L1 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 분양받아 실험에 사용하였다. 3T3-L1 세포는 10% bovinecalf serum, 1% 페니실린-스트렙토마이신항생물질(penycillinstreptomycine antibiotics, Gibco BRL, Grand Island, NY,USA)을 넣은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium high glucose (DMEM: Gibco BRL) 배지에서 5% 이산화탄소(CO₂), 37℃ 조건으로 배양하였다.
여과가 완료된 추출물은 감압농축기(EYELAN-1200A, SB1200, A-1000S, CCA1111, Korea)를 이용하여 heating bath 40℃ 조건에서 감압농축 한 후, 각 농축물은 동결건조시킨 후에 냉동 보관하였다. 실험에 사용될 사상자 추출물은 Dimethyl sulfoxide (DMSO)를 통해 농도 별로 녹여서 사용하였다.

데이터처리

means Not Significant. The statistical analysis of the data was carried out by use of a t-test. ^*p<0.
각 자료는 3번 이상의 반복된 실험을 통하여 얻은 결과로 검정하였고 p<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.
실험설계에 대한 분석은 통계프로그램인 SPSS (20.0, SPSS,USA)의 Student’s t-test로 검정하였다.

이론/모형

3T3-L1 preadipocyte의 지방세포로의 분화는 Chu 등[5]이 사용한 방법을 이용하였다. 분화용 배지는 10% FBS, 1 μg/ml insulin, 0.
세포 내 중성지방의 함량은 AdipoRedTM assay (LONZA,USA)에 지시되어 있는 정량법에 따라 수행하였는데, 이 방법은 Nile Red 염색법으로서 트라이글리세라이드(triglyceride)에 특이성이 높은 것으로 알려져 있다[20]. 세포 내 중성지방함량 측정은 6-well 플레이트에 well당 1×10⁶ 세포를 분주하여 세포가 100% 밀집되게 배양하였다.
시료의 세포 증식과 독성을 측정하기 위해 Green 등의 방법[9]에 따라 3-(3,4-dimethyl-thiazolyl-2)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay를 실시하였다. MTT assay는 미토콘드리아의 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT가 불용성 의 보라색 formazan으로 환원되는 원리를 이용한 방법으로, 생성된 formazan의 흡광도는 살아있고 대사가 왕성한 세포의 농도를 반영한다.

성능/효과

또한 사상자 추출물에 의해 지방 전구세포를 지방세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPα의 발현이 억제되면서 지방세포로의 분화가 억제됨을 확인할 수 있었다.
05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다. 또한, N.S. (not significant)는 대조군 대비 해당 실험군의 결과가 유의성이 없다는 것을 표시하였다.
또한, 사상자 에탄올 추출물의 지방세포분화억제 효능을 확인한 결과, 100 μg/ml 이상의 농도로 처리하였을 경우는 세포 독성이 확인되었으며, 낮은 농도로 처리한 경우에는 지방분해 억제에 거의 활성이 없는 것으로 확인되었으며, 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 지방분해억제율이 69%로 매우 효과적인 것을 확인하였다.
5μM dexamethasone, 10 μg/ml insulin)을 포함한 DMEM 배지를 3일 동안 처리하였고 다시 10% 소태아혈청과 10 μg/ml 인슐린을 포함한 DMEM을 3일 동안 2회 총 6일 동안 배양하며 세포 내 지방구의 형성을 근거하여 지방세포로 분화시켰다. 모두 12일 동안의 분화를 통해 80% 이상의 세포가 분화되었음을 확인하였다. 시료의 처리는 분화유도 배지 첨가 시점부터 같이 처리 하였다.
사상자 에탄올 추출물의 지방세포 내 triglyceride 감소효과를 확인하기 위하여 지방 세포 내에 축적된 중성지방의 함량을 확인해 본 결과(Fig. 3), Oil Red O 염색 결과와 동일하게사상자 추출물을 처리한 군의 중성지방 함량이 농도 의존적으로 유의적으로 낮아지는 것으로 확인되었다. 사상자 추출물을 10 μg/ml 농도로 처리한 군에서는 통계적 유의성이 나타나지 않았으나, 50, 100 μg/ml 농도로 처리한 군에서 triglyceride함량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 통계적 유의성을 보였다.
사상자 추출물을 10 μg/ml 농도로 처리한 군에서는 통계적 유의성이 나타나지 않았으나, 50, 100 μg/ml 농도로 처리한 군에서 triglyceride함량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 통계적 유의성을 보였다.
시료 처리 결과, 100 μg/ml 농도까지는 유의성이 없는 차이가 난다고 측정되어(N.S. (not significant, p>0.05) 사상자 에탄올 추출물에 의한 독성이 없어 80% 이상의 세포 생존율이 확인되었다.
이러한 연구 결과를 요약하자면, 사상자 에탄올 추출물은70% 에탄올 농도에서 가장 높은 수율과 단백질 함량을 함유한다는 것을 확인하였다. 또한, 사상자 에탄올 추출물의 지방세포분화억제 효능을 확인한 결과, 100 μg/ml 이상의 농도로 처리하였을 경우는 세포 독성이 확인되었으며, 낮은 농도로 처리한 경우에는 지방분해 억제에 거의 활성이 없는 것으로 확인되었으며, 100 μg/ml의 농도로 처리하였을 때 지방분해억제율이 69%로 매우 효과적인 것을 확인하였다.
사상자 추출물을 10 μg/ml 농도로 처리한 군에서는 통계적 유의성이 나타나지 않았으나, 50, 100 μg/ml 농도로 처리한 군에서 triglyceride함량이 농도 의존적으로 감소하였으며, 통계적 유의성을 보였다. 이상의 결과로부터 사상자 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방세포의 분화 유도과정에서 지방구의 생성을 억제하여 지방축적을 억제시키는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
이에 본 실험에서는 사상자 에탄올 추출물을 통해 3T3-L1 세포내 중성지방 함량을 측정한 결과, 중성지방의 함량이 대조군과 비교하였을 때 농도 의존적으로 유의하게 감소하는 것을 확인하였으며, 사상자 추출물을 100 μg/ml 이상의 농도로 처리하였을 때 가장 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.
이에 본 연구에서는 사상자 70% ethanol추출물이 adipogenic transcription factor의 발현에 어떠한 영향을 미치는지를 단백질 수준에서 확인해 본 결과(Fig. 4), 사상자 에탄올 추출물에 의해서 에너지 대사 조절 지표인 PPARγ, C/EBPα, p-ACC의 발현이 농도 의존적으로 감소하는 것을 알 수 있었다.
이에 본 연구에서는지방세포 내에서 중성지방의 함량이 낮았던 것이 지방합성 및 에너지 조절 효소인 PPARγ, C/EBPα, p-ACC 단백질 발현의 영향에 의한 것인지를 확인해 본 결과, 사상자 추출물 처리에 의해서 이들 단백질의 발현이 억제되는 것을 알 수 있었다.
지방세포로 분화가 완료된 control 그룹과 지방세포에 사상자 에탄올 추출물을 세포독성이 나타나지 않는 범위 이내에서 농도별(80-100 μg/ml)로처리한 결과(Fig. 2), 지방분해 억제율이 각각 83, 69%로 나타나 농도 의존적으로 유의성이 있게(*p<0.05, ***p<0.001) 지방세포의 분화가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
특히 100 μg/ml 농도로 사상자 에탄올 추출물을 처리한 군에서 효과가 뛰어났다.

후속연구

Hwang 등[13]의 연구에 의하면 사상자 70% 에탄올추출물 중에 함유된 torilin 함량은 7.167±0.168 mg/g 정도인 것으로 보고되었는데 사상자에 함유된 torlin 성분은 다양한 생리활성을 나타내는 기능성분인 것으로도 잘 알려져 있어 본 실험에서 확인된 사상자 추출물의 지방분화 억제 효과를 나타내는 활성성분에 대한 연구는 추가적으로 더 이루어져야 할 것이다.
이상의 결과로부터 사상자는 지방 전구세포가 증식하는 과정에서 PPARγ, C/EBPα, p-ACC 단백질의 발현을 억제하여 지방세포 내 중성지방의 함량도 감소시키는 효과를 나타내는 것으로 추측되어 사상자는 추후 체지방 감소 효능을 갖는 천연물 소재로 활용이 가능할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	사상자 추출물의 지방세포 분화 억제 효과는 어떤 성분이 많이 함유되어 있기 때문이라고 추측하였는가?	또한 사상자 추출물에 의해 지방 전구세포를 지방세포로의 분화를 촉진하는 전사인자인 PPARγ, C/EBPα의 발현이 억제되면서 지방세포로의 분화가 억제됨을 확인할 수 있었다. 이러한 사상자 에탄올 추출물의 지방세포 분화 억제 효과는 사상자에 함유된 다양한 성분들 중 sesquiterpene acetate인 torilin 성분이 많이 함유되어 있기 때문으로 추측된다. Hwang 등[13]의 연구에 의하면 사상자 70% 에탄올추출물 중에 함유된 torilin 함량은 7.
	현재까지 비만 치료제는 제제에 따라 어떻게 나눌 수 있는가?	항비만 관련 치료제의 개발은 꾸준히 활발하게 이루어지고있는데, 현재까지의 비만 치료제는 식욕을 억제시키는 제제(fenfluramine, sibutramine)와 지방의 대사를 촉진시키거나 지방질합성(lipogenesis)를 억제하거나 대사활성을 증가시키는 제제(ephedrine, orlistat)로 크게 나눌 수 있으나 이런 약물들은 그 부작용 또한 많고 습관성의 문제도 대두되고 있다[26]. 따라서 소비자들은 적은 노력으로 큰 효과를 내면서 부작용이 적은 천연물질로부터 비만을 해결하기 위한 방법을 필요로하고 있다[6, 21, 22].
	사상자는 어떤 약초인가?	사상자(Torilis Japonica Decandolle)는 뱀도랏이라고도 불리며, 우리나라 전역의 산야에 자생하는 산형과(Umbelliferae)에 속하는 높이 30~70 cm 내외의 초본성 약초로서 전체에 털이 분포하며, 전국 각지에서 야생한다. 도랑가 혹은 습지에 주로 자생하는데, 뱀이 이 풀 속에 숨어 그 씨는 즐겨 먹기에 사상자라는 이름이 붙었다고 한다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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