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문제 정의
- 안전한 항생제사용 가이드라인 구축을 위해서는 농업환경 내 항생제 내성균 분포현황, 내성패턴, 오염경로 구명 등의 기초자료가 필요하다. 따라서 본 연구는 경기, 강원지역 농업용수 내 식중독균 오염도와 항생제 내성균을 조사하여 국내 농업용수의 미생물학적 안전성과 위해성 평가를 위한 기초자료로 활용하고자 수행하였다.
제안 방법
- 각각의 선택배지에서 양성집락을 보인 E. coli O157:H7과 Salmonella는 Tryptic Soy Agar (TSA; Oxoid, Hampshire, England)에 접종하여 37℃에서 배양하고, L. monocytogenes 는 0.6% yeast extract가 첨가된 TSA에 접종하고 30℃에서 배양하였다. 이후 VITEK2 system(bioMérieux, North Carolina, USA)과 상용화된 PCR kit (PowerChek Detection Kit; Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 활용하여 최종 동정하였다.
- 농업용수에서 분리 동정된 대장균을 TSA에서 37±0.5℃ 에서 24시간 배양한 뒤 VITEK2 system AST-N224 card (bioMérieux, North Carolina, USA)를 통해 항생제 내성 검정을 실시하였다. 항생제 내성검정은 VITEK2 AST-card를 이용해 MIC (최소억제농도)법에 준하였으며 CLIS Guidlines (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) 기준에 따라 16가지 항생제에 대한 내성검정을 수행하였다.
- 대장균의 경우 대장균 병원성 검정 KIT (PowerChek Diarrheal E. coli Detection Kit; Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 통해 병원성을 확인하였다.
- 이 중 농업용수는 농산물의 가식부위에 직접 접촉되고 토양이나 농자재 등 농업환경에 오염원을 전파할 수 있기 때문에 농산물식중독균 오염에 주된 요인으로 알려져 있다[2-4]. 앞서 언급한 2018년 미국 로메인 상추로 인한 식중독사고 역시 미국 질병통제예방센터(CDC, 2018)와 미국 식품의약국(U.S. Food and Drug Administration (FDA), 2018)의 합동 조사 결과로 메인 상추 재배지 수로에서 검출된 병원성 대장균과 식중독 발병환자의 분변에서 검출된 병원성 대장균의 유전형질이 일치하여 농업용수를 로메인 상추 오염원으로 추정하였다. 이처럼 농업용수는 농산물 안전관리에 매우 중요한 요인 중 하나이다.
- 5℃에서 24시간 배양하였다. 양성 반응을 보인 시료를 Palcam (Oxoid, Hampshire, England) 배지에 획선 도말한 뒤 양성 집락을 순수분리 하였다.
- 5℃에서 24시간 배양하였다. 이후 Eosin Methylene Blue (EMB; Oxoid, Hampshire, England) 배지에 획선 도말한 뒤 양성집락를 순수분리 하였다. E.
- 6% yeast extract가 첨가된 TSA에 접종하고 30℃에서 배양하였다. 이후 VITEK2 system(bioMérieux, North Carolina, USA)과 상용화된 PCR kit (PowerChek Detection Kit; Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 활용하여 최종 동정하였다.
- 5℃에서 4시간 배양한 후 noboviocin (Oxoid, Hampshire, England)을 20 mg/L 농도로 첨가하고 20시간 배양하였다. 이후 배양된 배지를 Chromogenic O157 Media (CHROMagar, Paris, France) 에 획선 도말하고 양성 집락을 순수분리 하였다. Salmonella 는 여과막을 40 mL의 BPW에 넣고 37±0.
대상 데이터
- 3과 Table 2에 나타냈다. Listeria는 하천수 조사지점 66지점 중 54지점(81.8%)에서 검출되었다. Listeria가 검출된 54지점 중 23지점(42.
- Salmonella는 강원지역은 4월, 7월 하천수 조사지점 34 지점에서 각각 1지점(2.9%) 씩 검출되었다(Table 3). 위 결과를 종합해보면 경기, 강원지역 농업용수 모두 하천수가 지하수보다 식중독균의 검출률이 높게 나타났다.
- 지표수는 2019년 4월, 7월, 10월에 경기지역 32지점, 강원지역 34지점에서 비커봉(Angular beaker, Bürkle GmbH, Germany)을 이용해 중앙지점에서 수면으로부터 2m 이내의 물을 채취하였다. 또한 지하수는 지역별로 각각 20지점에서 2019년 4월과 7월에 채취하였으며 지하수 시료는 펌프를 5분 이상 가동하여 관정 내의 고인 물을 제거한 후 무균채수병을 이용하여 채취하였다. 채취된 시료는 아이스박스에 넣어 실험실로 이송하여 4℃ 냉장고에서 보관 후 24시간 이내에 분석하였다.
- 본 연구에 사용된 농업용수는 농촌진흥청에서 시행하고 있는 농업환경변동조사(환경부 수질오염공정시험기준. 환경부 고시 제 2017-57호, 2017) 수질조사 지점 중 경기와 강원지역에서 채취하였다(Fig. 1). 지표수는 2019년 4월, 7월, 10월에 경기지역 32지점, 강원지역 34지점에서 비커봉(Angular beaker, Bürkle GmbH, Germany)을 이용해 중앙지점에서 수면으로부터 2m 이내의 물을 채취하였다.
- 1). 지표수는 2019년 4월, 7월, 10월에 경기지역 32지점, 강원지역 34지점에서 비커봉(Angular beaker, Bürkle GmbH, Germany)을 이용해 중앙지점에서 수면으로부터 2m 이내의 물을 채취하였다. 또한 지하수는 지역별로 각각 20지점에서 2019년 4월과 7월에 채취하였으며 지하수 시료는 펌프를 5분 이상 가동하여 관정 내의 고인 물을 제거한 후 무균채수병을 이용하여 채취하였다.
- 채집한 시료로부터 식중독균 조사는 대장균을 비롯해 주요식중독균인 Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7), Salmonella, Listeria monocytogenes (L. monocytogenes) 을 대상으로 하였다. 시료 250 mL를 나이트로셀룰로스 여과막(pore size = 0.
- 항생제 내성검정은 VITEK2 AST-card를 이용해 MIC (최소억제농도)법에 준하였으며 CLIS Guidlines (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) 기준에 따라 16가지 항생제에 대한 내성검정을 수행하였다. 항생제 내성검정에는 β-락탐계의 ampicillin (AMP), amoxicillin-clavulanic acid (AMC), piperacillin-tazobactam (TZP) 세파졸린계의 cefazolin (CFZ), cefoxitin (FOX), cefotaxime (CTX), ceftazidime (CAZ), cefepime (FEP) 모노박탐계의 aztreonam (ATM) 카바페넴계의 ertapenem (ETP), imipenem (IPM) 아미노글리코시드계의 amikacin (AMK), gentamicin (GEN) 플로르퀴놀론계의 ciprofloxacin (CIP), 테트라사이클린계의 tigecycline (TGC) 기타 합성제인 trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP/SMX) 항생제가 사용되었다.
이론/모형
- 5℃ 에서 24시간 배양한 뒤 VITEK2 system AST-N224 card (bioMérieux, North Carolina, USA)를 통해 항생제 내성 검정을 실시하였다. 항생제 내성검정은 VITEK2 AST-card를 이용해 MIC (최소억제농도)법에 준하였으며 CLIS Guidlines (Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) 기준에 따라 16가지 항생제에 대한 내성검정을 수행하였다. 항생제 내성검정에는 β-락탐계의 ampicillin (AMP), amoxicillin-clavulanic acid (AMC), piperacillin-tazobactam (TZP) 세파졸린계의 cefazolin (CFZ), cefoxitin (FOX), cefotaxime (CTX), ceftazidime (CAZ), cefepime (FEP) 모노박탐계의 aztreonam (ATM) 카바페넴계의 ertapenem (ETP), imipenem (IPM) 아미노글리코시드계의 amikacin (AMK), gentamicin (GEN) 플로르퀴놀론계의 ciprofloxacin (CIP), 테트라사이클린계의 tigecycline (TGC) 기타 합성제인 trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP/SMX) 항생제가 사용되었다.
성능/효과
- 1%)에서 높은 비율로 검출되었다. Trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP/SMX)에 내성을 가진 대장균은 모든 축종의 분변 (32.3%)과 도체(26.3%)에서 높은 비율로 검출되었다. 농업용수에서 분리한 대장균과 축사에서 분리된 대장균이 유사한 패턴을 보이기 때문에 수계 내에 존재하는 항생제 내성 균의 유입 원이 축사와 연관이 되어 있을 것으로 추정된다.
- 또한 강원지역 대장균의 경우 10월에 검출률이 높았고 병원성대장균 비율도 높게 나타났는데 이는 평년에 비해 유독 높았던 10월 강수량과 관련 있을 것으로 보인다. 검출 지점별로 보았을 때 대장균 하천수 검출지점의 63.5%(40/63), Listeria 하천수 검출지점의 42.6%(23/54)에서는 계절별로 2번 이상 연속적으로 검출되었다. 이는 점오염원이 존재할 수 있는 가능성을 나타내지만 더 정확한 판단을 위해서는 연속 검출 지점의 오염원 구명이 필요할 것으로 보인다.
- 검출된 대장균 343균주 중 병원성대장균은 장병 원성 대장균(Enteropathogenic E. coli; EPEC)이 61%로 가장 많았고, 장독소성대장균(Enterotoxigenic E. coli; ETEC) 16%, 장침투성대장균(EnteroInvasive E. coli; EIEC) 11%, 장 응집성 대장균(Enteroaggregative E. coli; EAEC) 6%, 시가 톡신 생성 대장균(Shigatoxigenic E. coli; STEC) 6% 순으로 분석되었고 E. coli O157:H7은 검출되지 않았다.
- 위 결과를 종합해보면 경기, 강원지역 농업용수 모두 하천수가 지하수보다 식중독균의 검출률이 높게 나타났다. 계절별로 보면 경기지역 대장균과 경기, 강원지역 리스테리아는 4월과 10월 보다 7월에 검출률이 높았고, 강원지역 대장균은 4월과 7월 보다 10월에 검출률이 높았다. 농업용수에서 식중독균 검출률에는 수온, 강수량, 수질변화, 주변 환경 조건(야영지, 농경지 폐수 등) 등이 영향을 줄 수 있다.
- 1%) 순으로 비중이 높게 나타났다. 다제내성균은 CLSI subclass 기준으로 보았을 때 2계통의 항생제에 내성을 보인 균주는 15균주(19%), 3계통 12균주(15%), 4계통 12균주(15%), 5계통 4균주(5%), 7계통 3균주(4%)로 나타났다.
- 7%)가 하나 이상의 항생제에 대해 내성을 보였다. 대장균 중 페니실린계 ampicillin 항생제에 대한 내성을 갖는 균주가 18.7% (64/343)로 가장 많았고, 플로르퀴놀론계 ciprofloxacin 항생제에 내성을 갖는 7.0% (24/343), 기타분류의 trimethoprim- sulfamethoxazole 항생제에 내성을 갖는 6.7% (23/343), 세파졸린계 ceftazidime 항생제에 내성을 갖는 4.7% (16/343) 순으로 높은 항생제 내성률을 보였다. 카바페넴계 항생제인 ertapenem과 imipenem, 아미노글리코사이드계 항생제인 amikacin과 테트라사이클린계 항생제인 tigecycline 에는 모든 균주가 감수성으로 나타났다(Fig.
- 항생제 내성패턴은 Table 5와 같다. 모두 31개의 내성패턴이 관찰되었고 그 중 1가지 항생제에 저항성을 보인 경우에는 ampicillin에 저항성을 갖는 경우가 항생제 내성균 78균주 중 20 균주(25.6%)로 가장 많았고, 2개 이상의 항생제에 내성을 보인 경우는 AMP-TMP/SMX 5균주(6.4%), AMP-AMC 4균주(5.1%), AMC-GEN-TMP/SMX 4균주(5.1%) 순으로 비중이 높게 나타났다. 다제내성균은 CLSI subclass 기준으로 보았을 때 2계통의 항생제에 내성을 보인 균주는 15균주(19%), 3계통 12균주(15%), 4계통 12균주(15%), 5계통 4균주(5%), 7계통 3균주(4%)로 나타났다.
- 4 mm로 역시 7월에 높은 강수량을 보였다. 본 실험결과는 [12]와 [13]의 실험과 같이 강수량이 높을수록 식중독균의 농도가 높아지는 결과를 보여 강수량이 식중독균 검출률에 영향을 주었을 것으로 판단된다[12, 13]. 또한 강원지역 대장균의 경우 10월에 검출률이 높았고 병원성대장균 비율도 높게 나타났는데 이는 평년에 비해 유독 높았던 10월 강수량과 관련 있을 것으로 보인다.
- 국내 항생제 판매량을 보면 2018년 기준 penicillin 계열과 tetracycline 계열 항생제가 각각 약 259톤, 약 249톤으로 가장 많이 판매된 것으로 조사되었다(국가항생제 사용 및 내성 모니터링 보고서, 2018). 본 실험에서는 ampicillin (AMP), ciprofloxacin (CIP), trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP/SMX) 순으로 내성균 비율이 높게 나타났는데, 이는 가축 도체와 분변에서 검출된 대장균의 내성 양상과 비슷한 결과를 나타냈다. 국가항생제 사용 및 내성 모니터링 보고서 (2018)를 보면 ampicillin (AMP)에 내성을 가진 대장균은 모든 축종의 분변(53.
- 8%), 10월 분리 항생제 내성균 24균주 중 12균주(50%)였다. 요약하면 10월이 분리된 대장균에서 항생제 내성균 비율이 가장 높았고, 다제내성균 비율은 7월에 가장 높게 나타났다.
- 6%)로 조사됐다. 요약하면 경기지역이 강원지역보다 항생제 내성균 분리균주 수와 비율 모두 높았고 다제내성균 비율도 높게 나타났다.
- 9%) 씩 검출되었다(Table 3). 위 결과를 종합해보면 경기, 강원지역 농업용수 모두 하천수가 지하수보다 식중독균의 검출률이 높게 나타났다. 계절별로 보면 경기지역 대장균과 경기, 강원지역 리스테리아는 4월과 10월 보다 7월에 검출률이 높았고, 강원지역 대장균은 4월과 7월 보다 10월에 검출률이 높았다.
- 2 와 Table 1에 나타냈다. 전체적으로 볼 때 하천수 66지점 중 63지점(95.5%)에서 대장균이 검출되었고 대장균이 검출된 63지점 중 40지점(63.5%)에서는 4월, 7월, 10월 중 2번 이상 연속적으로 검출되었고, 12지점(19%)에서 3번 연속 검출되었다. 지하수는 40지점 중 8지점(20%)에서 대장균이 검출되었고 대장균이 검출된 8지점 중 1지점(12.
- 4와 Table 4와 같다. 즉, 농업용수 내에서 분리된 대장균 343균주 중 78균주(22.7%)가 하나 이상의 항생제에 대해 내성을 보였다. 대장균 중 페니실린계 ampicillin 항생제에 대한 내성을 갖는 균주가 18.
- 지역별로 보면 경기지역에서 분리된 대장균 206균주 중항생제 내성을 갖는 대장균은 49균주(23.8%)였고, 강원지역의 경우 분리된 대장균 137균주 중 내성균이 29균주(21.1%) 였다. 항생제 다제내성균 비율은 경기지역에서 분리된 항생제 내성균 49균주 중 38균주(77.
- 7% (16/343) 순으로 높은 항생제 내성률을 보였다. 카바페넴계 항생제인 ertapenem과 imipenem, 아미노글리코사이드계 항생제인 amikacin과 테트라사이클린계 항생제인 tigecycline 에는 모든 균주가 감수성으로 나타났다(Fig. 4). 항생제 내성패턴은 Table 5와 같다.
- 1%) 였다. 항생제 다제내성균 비율은 경기지역에서 분리된 항생제 내성균 49균주 중 38균주(77.6%), 강원지역에서 분리된 항생제 내성균 29균주 중 8균주(27.6%)로 조사됐다. 요약하면 경기지역이 강원지역보다 항생제 내성균 분리균주 수와 비율 모두 높았고 다제내성균 비율도 높게 나타났다.
후속연구
- 또한 지역별, 계절별로 항생제 내성균 비율이 차이가 나는 것도 지역 및 계절별로 항생제 내성균의 유입원이 달라지기 때문으로 추측된다. 다만 내성균 유입원은 축사를 비롯해 병원, 요양 시설, 야영지 등 다양하기 때문에 정확한 판단을 위해서는 내성균의 유입원 추적에 대한 연구가 필요할 것으로 보이고, 안전한 항생제 사용 가이드라인 구축을 위해 농업환경 내 항생제 내성균 분포현황, 내성패턴, 오염경로 구명 등의 기초자료 확보가 필요할 것으로 판단된다. 본 과제에서는 경기와 강원지역의 농업용수 내 존재하는 항생제 내성균 분포와 내성 패턴에 대해 조사 하였고 이 자료는 추후 가이드라인 설정에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 이는 점오염원이 존재할 수 있는 가능성을 나타내지만 더 정확한 판단을 위해서는 연속 검출 지점의 오염원 구명이 필요할 것으로 보인다. 물 환경 내 미생물에 미치는 요소는 매우 다양하기 때문에 농업용수 내 미생물 검출량 변화를 예측하기 위해서는 기온과 강수량을 비롯해 수온, 주변 오염원, 수생태계 등 다양한 요인들을 주기적으로 모니터링하고, 농업용수 오염도와 여러 환경요인 간의 상관관계에 대한 연구도 필요할 것으로 사료된다.
- 다만 내성균 유입원은 축사를 비롯해 병원, 요양 시설, 야영지 등 다양하기 때문에 정확한 판단을 위해서는 내성균의 유입원 추적에 대한 연구가 필요할 것으로 보이고, 안전한 항생제 사용 가이드라인 구축을 위해 농업환경 내 항생제 내성균 분포현황, 내성패턴, 오염경로 구명 등의 기초자료 확보가 필요할 것으로 판단된다. 본 과제에서는 경기와 강원지역의 농업용수 내 존재하는 항생제 내성균 분포와 내성 패턴에 대해 조사 하였고 이 자료는 추후 가이드라인 설정에 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
- 6%(23/54)에서는 계절별로 2번 이상 연속적으로 검출되었다. 이는 점오염원이 존재할 수 있는 가능성을 나타내지만 더 정확한 판단을 위해서는 연속 검출 지점의 오염원 구명이 필요할 것으로 보인다. 물 환경 내 미생물에 미치는 요소는 매우 다양하기 때문에 농업용수 내 미생물 검출량 변화를 예측하기 위해서는 기온과 강수량을 비롯해 수온, 주변 오염원, 수생태계 등 다양한 요인들을 주기적으로 모니터링하고, 농업용수 오염도와 여러 환경요인 간의 상관관계에 대한 연구도 필요할 것으로 사료된다.
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