어류, 수족관수 및 환자에서 분리된 Vibrio vulnificus의 독소유전자 분포 및 항생제 내성 Prevalence of Toxin Genes and Profiles of Antibitoc Resistance in Vibrio vulnificus Isolates from Fish, Fish Tanks, and Patients원문보기
본 연구에서는 비브리오 패혈증 예방과 치료에 유용한 항생제를 제시하기 위해 V. vulnificus의 독소유전자 분포와 항생제 내성을 분석하였다. 2015년부터 2017년까지 3년간 전남지역에서 발생한 비브리오 패혈증 환자로부터 분리되어 보관된 18균주와 전남지역에서 채취된 어패류 및 횟집 수족관수에서 분리된 5균주, 총 23균주를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 V. vulnificus 23균주 모두 V. vulnificus로 재확인되었다. V. vulnificus 균주의 독소유전자를 분석한 결과, 23균주 중 19균주(82.6%)에서 RtxA 독소유전자가 확인되었고, 23균주 모두에서 viuB와 vvhA 독소유전자가 검출되었다. 이러한 결과는 독소유전자의 검출율이 기존 보고에 비해 높은 것이며, 실험에 사용한 모든 V. vulnificus 균주가 1개 이상의 독소유전자를 보유한 것으로 생선회 섭취와 상처를 통한 비브리오 패혈증 감염의 위험성이 상존하고 있었다. 따라서 횟집 종사자 등에 대한 비브리오 패혈증 예방 교육이 필요한 것으로 판단되었다. V. vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과 cefoxitin 항생제에 94.4%가 내성을 나타내었고, chloramphenicol과 tetracycline 등 14종의 항생제에 감수성을 나타내었다. 비브리오 패혈증 치료에 chloramphenicol과 tetracycline 항생제를 사용하는 현 치료법이 유용한 것으로 판단되었다.
본 연구에서는 비브리오 패혈증 예방과 치료에 유용한 항생제를 제시하기 위해 V. vulnificus의 독소유전자 분포와 항생제 내성을 분석하였다. 2015년부터 2017년까지 3년간 전남지역에서 발생한 비브리오 패혈증 환자로부터 분리되어 보관된 18균주와 전남지역에서 채취된 어패류 및 횟집 수족관수에서 분리된 5균주, 총 23균주를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 V. vulnificus 23균주 모두 V. vulnificus로 재확인되었다. V. vulnificus 균주의 독소유전자를 분석한 결과, 23균주 중 19균주(82.6%)에서 RtxA 독소유전자가 확인되었고, 23균주 모두에서 viuB와 vvhA 독소유전자가 검출되었다. 이러한 결과는 독소유전자의 검출율이 기존 보고에 비해 높은 것이며, 실험에 사용한 모든 V. vulnificus 균주가 1개 이상의 독소유전자를 보유한 것으로 생선회 섭취와 상처를 통한 비브리오 패혈증 감염의 위험성이 상존하고 있었다. 따라서 횟집 종사자 등에 대한 비브리오 패혈증 예방 교육이 필요한 것으로 판단되었다. V. vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과 cefoxitin 항생제에 94.4%가 내성을 나타내었고, chloramphenicol과 tetracycline 등 14종의 항생제에 감수성을 나타내었다. 비브리오 패혈증 치료에 chloramphenicol과 tetracycline 항생제를 사용하는 현 치료법이 유용한 것으로 판단되었다.
Prevalence of toxin genes and profiles of antibiotic resistance in Vibrio vulnificus were investigated for prevention of Vibrio sepsis and selection of effective antibiotics. A total of 23 V. vulnificus strains were isolated from Vibrio sepsis patients, fish, and water samples collected from fish ta...
Prevalence of toxin genes and profiles of antibiotic resistance in Vibrio vulnificus were investigated for prevention of Vibrio sepsis and selection of effective antibiotics. A total of 23 V. vulnificus strains were isolated from Vibrio sepsis patients, fish, and water samples collected from fish tanks in restaurants in Jeonnam province during 2015-2017 period. Prevalence of toxin genes including, RtxA, viuB and vvhA were assessed and susceptibilities to 15 different antibiotics were determined. As a result of the toxin gene profile, the RtxA toxin gene was detected in 19 (82.6%) out of 23 strains, and vvhA and viuB toxin genes were positive in all strains. These results showed that V. vulnificus tested in this study possessed at least one more toxin gene, and the toxin gene detection rate was higher than in previous reports. Therefore, there is always a risk of Vibrio sepsis through eating fish or having contact with aquarium water at seafood restaurants. Especially, it was deemed necessary to provide preventive education about Vibrio sepsis for workers in such restaurants. The results of antibiotic susceptibility tests presented 94.4% resistance to cepoxitin antibiotics but all strains showed susceptibility to 14 kinds of antibiotics including chloramphenicol and tetracycline. The currents antibiotic therapy using chloramphenicol and teteracycline against Vibrio sepsis was judged to be useful.
Prevalence of toxin genes and profiles of antibiotic resistance in Vibrio vulnificus were investigated for prevention of Vibrio sepsis and selection of effective antibiotics. A total of 23 V. vulnificus strains were isolated from Vibrio sepsis patients, fish, and water samples collected from fish tanks in restaurants in Jeonnam province during 2015-2017 period. Prevalence of toxin genes including, RtxA, viuB and vvhA were assessed and susceptibilities to 15 different antibiotics were determined. As a result of the toxin gene profile, the RtxA toxin gene was detected in 19 (82.6%) out of 23 strains, and vvhA and viuB toxin genes were positive in all strains. These results showed that V. vulnificus tested in this study possessed at least one more toxin gene, and the toxin gene detection rate was higher than in previous reports. Therefore, there is always a risk of Vibrio sepsis through eating fish or having contact with aquarium water at seafood restaurants. Especially, it was deemed necessary to provide preventive education about Vibrio sepsis for workers in such restaurants. The results of antibiotic susceptibility tests presented 94.4% resistance to cepoxitin antibiotics but all strains showed susceptibility to 14 kinds of antibiotics including chloramphenicol and tetracycline. The currents antibiotic therapy using chloramphenicol and teteracycline against Vibrio sepsis was judged to be useful.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 2015년부터 2017년까지 3년간 전남지역에서 발생한 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된 V. vulnificus 균주와 전남지역에서 채취된 어패류 및 횟집 수족관수에서 분리된 V. vulnificus 균주를 대상으로 Rtx, viu, vvh 등의 독소유전자 분포와 항생제 감수성을 분석하여 비브리오 패혈증 환자 발생시 치료에 기여하고자 하였다.
제안 방법
vulnificus 균주의 vvhA 독소유전자를 확인하기 위해 PowerChekTM Vibrio 4-plex Real-time PCR kit(Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 확인하였다. ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 사용하여 50oC에서 2분, 1 cycle, 95oC에서 10분, 1 cycle 반응시킨 후, 95oC에서 15초, 60oC에서 60초를 40 cycle을 반응시켰다. 분석결과는 제조자의 기준에 따라 Ct 값이 33 이하에서 증폭이 나타났을 경우,비브리오 패혈증균의 vvhA 유전자가 검출된 것으로 판정하였다.
gov/tools/primer-blast)로 설계한 염기서열을 이용하였다(Table 1). PCR primer는 GenoTech(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, PowerChekTM 2X Premix III strip kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 실험하였다. PCR 반응은 SimpliAmpTM Thermal Cycler (Applied Biosystems, Singapore)를 이용하여 95oC에서 10분간 열변성한 후 95oC 30초, 58oC 30초, 72oC 60초를 30회 반복한 후 최종적으로 72oC에서 10분간 PCR을 실시하였다.
PCR primer는 GenoTech(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, PowerChekTM 2X Premix III strip kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 실험하였다. PCR 반응은 SimpliAmpTM Thermal Cycler (Applied Biosystems, Singapore)를 이용하여 95oC에서 10분간 열변성한 후 95oC 30초, 58oC 30초, 72oC 60초를 30회 반복한 후 최종적으로 72oC에서 10분간 PCR을 실시하였다. V.
TSA 배지에서 순수 분리된 한 개 집락을 선택하여 DensiCHEK instrument (Biomerieux, Marcy-l'Etoile, France)를 이용하여 McFarland No. 0.6으로 현탁하여 접종균액을 제조하였다.
V. vulnificus 균주의 vvhA 독소유전자를 확인하기 위해 PowerChekTM Vibrio 4-plex Real-time PCR kit(Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 확인하였다.
V. vulnificus 균주의 독소유전자를 확인하기 위해 PCR product 3 µL를 2% agarose gel 상에 로딩하여 110 V에서 40분간 전기영동 하였다.
V. vulnificus 균주의 항생제 감수성 실험은 제조사가 제시하는 방법에 따라 AST-N169 card (Biomerieux)와 Vitek2 system을 이용하여 실험하였다. 분리 보관된 V.
vulnificus로 동정되었다. V. vulnificus균주임이 확인된 23균주에 대하여 PCR과 Real-time PCR을 이용하여 독소유전자(RtxA, viuB, vvhA) 분석을 실시하였다(Table 2). PCR 실험결과 총 23균주 중 19균주(82.
원심분리한 후 상층액을 제거하고 멸균증류수 200 µL을 첨가하여 재현탁 시켜99oC 히팅블럭(HB-96D, Daihan Scientific, Wonju, Korea)에서 10분간 가열하였다. 가열 후 2분간 얼음 위에 정치시킨 후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상층액을conventional PCR과 real-time PCR의 주형 DNA로 사용하였다.
보관된 균주가 V. vulnificus 균주임을 재확인하기 위하여 생화학 동정을 실시하였다. 1%-NaCl 함유 TSB에서 재활성화 된 균액 한 백금이를 TCBS (thiosulfate citrate bile-salt sucrose, Oxoid, England)배지에 획선 도말하여 37oC에서 24시간 배양하였다.
vulnificus 균주의 항생제 감수성 실험은 제조사가 제시하는 방법에 따라 AST-N169 card (Biomerieux)와 Vitek2 system을 이용하여 실험하였다. 분리 보관된 V. vulnificus 균주를 1%-NaCl 함유 TSA (tryptic soy agar, Oxoid)에 배양한후 한 개의 집락을 선택하여 DensiCHEK instrument (Biomerieux)를 이용하여 McFarland No. 0.6으로 현탁하였다. 균주 현탁액과 Vitek2 system (Biomerieux)를 이용하여 V.
6으로 현탁하여 접종균액을 제조하였다. 접종균액을 Vitek GN카드에접종한 후 Vitek2 system (Biomerieux)를 이용하여 V. vulnificus 균주를 동정하였다.
대상 데이터
V. vulnificus 균주의 독소유전자 중 siderophore receptor 생성에 관여하는 viuB 유전자와 resiniferatoxin를 분비하는RtxA 유전자를 대상으로 하였다. 독소유전자 중 viuB 유전자 검출을 위한 primer 염기서열은 Bhattacharyya의 보고22)를 바탕으로 제작하였으며, RtxA 유전자 검출을 위한primer는 국립보건연구원에서 Kwak 등23)이 보고한 GenBank database (HQ391952-HQ391988)를 바탕으로 primer-blast (https:www.
본 실험에 사용한 V. vulnificus 균주는 2015년부터 2017년까지 전남지역 어류에서 분리된 2균주, 횟집 수족관수에서 분리된 3균주, 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된18균주, 총 23균주를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 V.
vulnificus 균주는 2015년부터 2017년까지 전남지역 어류에서 분리된 2균주, 횟집 수족관수에서 분리된 3균주, 비브리오 패혈증 환자로부터 분리된18균주, 총 23균주를 대상으로 하였다. 실험에 사용된 V. vulnificus 균주는 비브리오 패혈증 유행예측사업을 통해 분리 동정되어 -70oC 냉동고에 보관되어 있었으며, 보관균주를 1%-NaCl 함유 TSB (tryptic soy broth, Oxoid, London, England)에 접종하여 37oC에서 24시간 3회 배양하여 재활성화 하였다.
vulnificus 균주의 항생제 감수성을 실험하였으며, 감수성, 중간내성 및 내성의 판단은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 기준에 따라 판정하였다24). 실험에 사용된 항생제의 종류는 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin/sulbactam, cefazolin, cefotetan, cefoxitin, ceftriaxone, imipenem, amikacin, gentamycin, nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, trimethoprim/sulfamethoxazole 등 15종을 사용하였다.
이론/모형
6으로 현탁하였다. 균주 현탁액과 Vitek2 system (Biomerieux)를 이용하여 V. vulnificus 균주의 항생제 감수성을 실험하였으며, 감수성, 중간내성 및 내성의 판단은 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)의 기준에 따라 판정하였다24). 실험에 사용된 항생제의 종류는 ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin/sulbactam, cefazolin, cefotetan, cefoxitin, ceftriaxone, imipenem, amikacin, gentamycin, nalidixic acid, ciprofloxacin, tetracycline, chloramphenicol, trimethoprim/sulfamethoxazole 등 15종을 사용하였다.
vulnificus 균주의 독소유전자 중 siderophore receptor 생성에 관여하는 viuB 유전자와 resiniferatoxin를 분비하는RtxA 유전자를 대상으로 하였다. 독소유전자 중 viuB 유전자 검출을 위한 primer 염기서열은 Bhattacharyya의 보고22)를 바탕으로 제작하였으며, RtxA 유전자 검출을 위한primer는 국립보건연구원에서 Kwak 등23)이 보고한 GenBank database (HQ391952-HQ391988)를 바탕으로 primer-blast (https:www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)로 설계한 염기서열을 이용하였다(Table 1). PCR primer는 GenoTech(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 합성하였으며, PowerChekTM 2X Premix III strip kit (Kogenbiotech, Seoul, Korea)를 이용하여 실험하였다.
성능/효과
vulnificus균주임이 확인된 23균주에 대하여 PCR과 Real-time PCR을 이용하여 독소유전자(RtxA, viuB, vvhA) 분석을 실시하였다(Table 2). PCR 실험결과 총 23균주 중 19균주(82.6%)에서 470 bp 밴드를 확인하여 RtxA 독소유전자를 보유한것으로 나타났으며, 실험에 사용된 23균주 모두에서 505 bp 밴드를 나타내어 viuB 독소유전자를 보유한 것으로 나타났다. 또한 vvhA 독소유전자를 확인하기 위한 real-time PCR 결과는 실험한 23균주(100%) 모두 30 이하의 Ct 값을 나타내어 vvhA 독소유전자를 보유하고 있는 것으로 나타났다.
그러나 독소유전자 중RtxA 유전자는 횟집 수족관수에서 분리된 2균주에서만 모두 검출되었고 어류에서 분리된 3균주 중 1균주(33.3%), 패혈증 환자에서 분리된 18균주 중 16균주(88.9%)에서만 검출되었다.
6%)에서 470 bp 밴드를 확인하여 RtxA 독소유전자를 보유한것으로 나타났으며, 실험에 사용된 23균주 모두에서 505 bp 밴드를 나타내어 viuB 독소유전자를 보유한 것으로 나타났다. 또한 vvhA 독소유전자를 확인하기 위한 real-time PCR 결과는 실험한 23균주(100%) 모두 30 이하의 Ct 값을 나타내어 vvhA 독소유전자를 보유하고 있는 것으로 나타났다. 어류, 횟집 수족관수 및 환자 등 분리원에 따른 V.
5%로 보고21)되고있다. 본 실험결과 총 23균주에 대한 Rtx 독소유전자 검출율은 82.6%로 Hong 등의 보고21)에 비해 다소 높은 양성율을 나타내었으나, 어류의 경우 33.3%로 낮은 검출율을 나타내었고, 횟집 수족관수의 경우 100%의 검출율을 나타내었다. 이러한 결과는 기존 보고에 비해 어류 분리 V.
ABI 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA)을 사용하여 50oC에서 2분, 1 cycle, 95oC에서 10분, 1 cycle 반응시킨 후, 95oC에서 15초, 60oC에서 60초를 40 cycle을 반응시켰다. 분석결과는 제조자의 기준에 따라 Ct 값이 33 이하에서 증폭이 나타났을 경우,비브리오 패혈증균의 vvhA 유전자가 검출된 것으로 판정하였다.
vulnificus에 대한 항생제 내성 실험결과는 Table 4에 나타내었다. 실험결과 cefoxitin 항생제에 18균주 중 17균주(94.4%)가 내성(resistance)을 나타내어 실험에 사용한 항생제 중 가장 높은 내성을 나타내었으며, 나머지 1균주는 중등도 내성(intermediate)을 나타내었다. 실험에 사용된 V.
vulnificus 독소유전자 중 vvh 유전자는 cytolysin-hemolysin을 생산하여 숙주세포로 침투하여 세포를 용혈시키는 독소31,32)이고, viu 독소유전자는 혈액 중 Fe을 포획하는 siderophore 생성하는 독소유전자로서 siderophore-hydroxamate형, phenolate형, vulnibactin형이 보고되고 있다14). 실험결과 어류, 횟집 수족관수 및 환자에서 분리된 23균주의 V. vulnificus에서 vvhA와 viuB 독소유전자가 모두 검출되었다. 이러한 결과는 패혈증 환자에서 분리된 V.
4%)가 내성(resistance)을 나타내어 실험에 사용한 항생제 중 가장 높은 내성을 나타내었으며, 나머지 1균주는 중등도 내성(intermediate)을 나타내었다. 실험에 사용된 V. vulnificus 18균주 모두 chloramphenicol과 tetracycline 등14종의 항생제에 감수성(susceptibility)을 나타내었다. 이러한 결과는 2014년에서 2015년 전남지역 해수 및 갯벌에서 분리된 V.
vulnificus 감염에 따른 패혈증은 간 손상 환자에게서 많은 발병하고 있으며, 그 기작에 관해 아직까지 명확하게 규명되지 않았지만 혈중 Fe 농도와 밀접한 관계가 있는 것으로 보고26)되고 있다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 어류,횟집 수족관수, 환자에게서 분리된 V. vulnificus 균주 모두가 1개 이상의 독소유전자를 보유하고 있어 하절기 생선회섭취 시 주의가 요망되고, 횟집 수족관수에서 분리된 V. vulnificus는 3개 독소가 모두 검출되어 수족관수의 적절한관리가 필요한 것으로 나타났다. 특히 수족관수와 항시 접촉하는 횟집 종사자의 경우 상처를 통한 패혈증 감염의 위험성이 상존하고 있어 교육이 필요한 것으로 판단된다.
전라남도 지역의 어류, 횟집 수족관수 및 환자에서 분리된 V. vulnificus 23균주를 Vitek2 system을 이용하여 동정한 결과 모두 V. vulnificus로 동정되었다.
후속연구
이러한 결과는 기존 보고에 비해 어류 분리 V. vulnificus 균주의 경우 Rtx 독소유전자 검출율이 매우 낮은 결과이고, 횟집 수족관수 분리 V. vulnificus 균주의경우 매우 높은 결과이나 실험대상 균주가 5균주로 매우 적어 지속적인 V. vulnificus 감시사업을 통해 다수의 균주를 대상으로 한 실험이 필요한 것으로 판단된다.
4%까지 감수성을 나타내었다는 보고34)와 유사한 결과를 나타내었다. 그러나 인천지역에서 2004년부터2006년까지 분리된 V. vulnificus 균주의 경우 cefoxitin 항생제에 대한 내성이 6.7%라는 보고9)와 비교 시 항생제 내성이 증가하는 경향을 나타내어 지속적인 연구가 필요한것으로 판단되었다. 또한 국내 발생 비브리오 패혈증 환자의 경우 발병한지 2-3일 이내에 50-80% 이상이 사망한다15,16)는 보고로 보와 비브리오 패혈증 환자 발생 시chloramphenicol과 tetracycline 항생제를 사용하는 현 치료법이9) 유용한 것으로 판단되었다.
우리나라의 경우 패혈증이 발생하면 저혈압 등의 쇼크증상이 나타나는 원발성 감염이 대부분으로 발병 후 2-3일 이내에 50-80% 이상이 사망한다14-16). 따라서 비브리오 패혈증 감염에 따른 사망을 방지하기 위해환자가 가장 많이 발생하는 전남 해안에서 분리된 V. vulnificus 균주의 독소유전자 분포 및 항생제 내성 분석이 필요하다 하겠다. 그러나 현재까지 연구를 살펴보면 멕시코 만 해수와 조개류에서 분리된 V.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
V. vulnificus 감염 증상에는 무엇이 있는가?
V. vulnificus 감염 증상으로는 피부병변과 함께 발열, 복통, 설사 등의 증상이 나타난다9). 2013년부터 2017년까지 5년간 전국에서 발생한 비브리오 패혈증 환자 256명중 120명(46.
우리나라의 패혈증 감염에 따른 사망률 양상은?
또한 multiplex PCR를 이용한 16S rDNA 유전자의 증폭산물에 따라 임상형과 환경형으로 분류되고 있다11-13). 우리나라의 경우 패혈증이 발생하면 저혈압 등의 쇼크증상이 나타나는 원발성 감염이 대부분으로 발병 후 2-3일 이내에 50-80% 이상이 사망한다14-16). 따라서 비브리오 패혈증 감염에 따른 사망을 방지하기 위해환자가 가장 많이 발생하는 전남 해안에서 분리된 V.
병원성 비브리오균의 종류에는 무엇이 있는가?
병원성 비브리오균에는 Vibrio cholera, Vibrio parahae-molyticus, Vibrio vulnificus 등이 있으며 우리나라 해안지역에 광범위하게 분포하여1), 해수, 갯벌, 어패류 등에 서식하고 있다2). V.
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