[논문]토란으로부터 분리한 면역활성 다당 galactomannan의 구조적 특성 규명

이희원; 신광순

doi:10.9721/kjfst.2020.52.6.595

토란으로부터 분리한 면역활성 다당 galactomannan의 구조적 특성 규명
Structural elucidation of immuno-stimulating polysaccharide, galactomannan isolated from Colocasia esculenta 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.52 no.6, 2020년, pp.595 - 603

이희원 (경기대학교 식품생물공학과) , 신광순 (경기대학교 식품생물공학과)

초록
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토란에 존재하는 점질다당의 새로운 이용방안을 모색하기 위하여 토란으로부터 다당을 분리하여 항보체 활성을 평가하고 구조 분석을 행하였다. 토란으로부터 분리한 조다당 CE를 이온교환수지와 Sephadex G-100 column를 이용하여 정제하였고, 그 중 수율과 활성이 양호한 CE-4a를 최종 획분으로 선정하였다. 초기 면역반응에 중요한 역할을 하는 보체계에 대한 토란 다당의 활성화 여부를 측정한 결과 양성대조군인 PSK에 준하는 강력한 항보체 활성을 보였고, 시료의 농도차이를 두어 실험한 결과 농도 의존적임을 알 수 있었다. CE-4a는 분자량 약 182.4 kDa의 다당체로 구성당 조성을 확인한 결과 Man, Gal 및 GalA를 높은 비율로 함유하고 있었다. 본 당쇄의 결합양식을 규명하기 위하여 methlyation analysis를 행한 결과 CE-4a는 terminal Galp. 3-linked-Galp, 4-linked Manp, 2,4,6-linked Manp를 포함한 총 10종의 결합으로 구성되어 있었다. 또한 CE-4a의 전체구조를 추정하기 위하여 endo-α-(1→4)-polygalacturonase, exo-α-galactosidase 및 endo-β-(1→4)-mannanase를 이용한 연속 가수분해 처리 및 해석을 행하였다. 결과를 종합하면, 토란 유래 다당 CE-4a는 (1→4)-mannan 주쇄로 존재하며 주쇄인 mannose의 C(O)6 위치에서 한가닥 또는 C(O)2, C(O)6 위치에서 동시에 두가닥의 측쇄가 연결되어 존재하고, 측쇄는 주로 galacto oligo당이 측쇄로 분지된 특징이 있음을 확인할 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

To elucidate the structure-function relationship of polysaccharides obtained from Colocasia esculenta, the immuno-stimulating polysaccharide, CE-4a was purified to homogeneity from the crude polysaccharide (CE) extracted from the corms of C. esculenta by two subsequent column chromatographies using DEAE-Sepharose FF and Sephadex G-100, and analysis of their immuno-stimulatory activities and structure were conducted. CE-4a showed an increase in anti-complementary activity in a dose-dependent fashion. The molecular mass was estimated to be 182.4 kDa, which mainly consisted of galactose (43.5%) and mannose (18.2%). Methylation analysis indicated that CE-4a comprised at least 10 different glycosyl linkages, such as terminal Galp, 3-linked Galp, and 4-linked Manp, as well as a characteristic linkage, 2,4,6-branched Manp residue. To analyze the fine structure of CE-4a, it was sequentially digested using endo-α-(1→4)-polygalacturonase, exo-α-galactosidase and endo-β-1,4-D-mannanase. These analyses suggested that CE-4a is to be a highly branched galactomannan with a (1→4)-mannan backbone and galactopyranosyl oligosaccharide side chains.

주제어

표/그림 (10)

그림 Fig. 1. Isolation and purification of immuno-stimulating polysaccharides from Colocasia esculenta.
그림 Fig. 2. Elution pattern and MW determination of CE-4a purified from crude polysaccharide on HPSEC. HPLC equipped with Asahipak GS520, GS320, and GS220 columns were used in this analysis.
$Fig. 3. Anti-complementary activities of subfractions obtained from anion-exchange chromatography of CE-1~8.$ 그림 Fig. 3. Anti-complementary activities of subfractions obtained from anion-exchange chromatography of CE-1~8.
그림 Fig. 4. Anti-complementary activity of CE-4a purified from Colocasia esculenta. ¹⁾Anti-complementary activity was presented as the inhibition of 50% total complementary hemolysis by Mayer's method. ²⁾Polysaccharide-K (PSK), a known immunoactive polysaccharide from Coriolus versicolor was used as a positive control.
그림 Fig. 5. Total ion chromatograms on GC-MS of partially methylated alditol acetates of CE-4a purified from Colocasia esculenta.
그림 Fig. 6. GC-MS fragment ion patterns of three characteristic linkages of CE-4a purified from Colocasia esculenta.
표 Table 1. Methylation analysis of CE-4a purified from Colocasia esculenta
$Table 2. Sugar composition of subfractions obtained after sequential enzymatic digestion of CE-4a from Colocasia esculenta$ 표 Table 2. Sugar composition of subfractions obtained after sequential enzymatic digestion of CE-4a from Colocasia esculenta
그림 Fig. 7. Sequential enzymatic digestion of CE-4a for structural characterization and elution patterns of enzyme digests on Superdex 75 GL.
그림 Fig. 8. A proposed main structure of immuno-stimulating polysaccharide, CE-4a purified from Colocasia esculenta. Squares with dotted lines indicate a characteristic linkage in CE-4a.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 활성 다당 CE-4a를 각종 효소를 처리하여 단편화하고 이들을 분석하고자 하였다[Fig. 7(A)]. CE-4a 다당에서는 상당량의 GalA를 함유하고 있었던 바, 우선 endo-α-(1→4)-polygalacturonase를 처리하고 Superdex 75 GL column을 이용한 HPLC를 행한 결과, Fig.
그러나 이는 토란 다당 성분에 대한 효능만 확인했을 뿐 활성 본체에 대한 물질의 구조는 아직 규명되지 않았다. 따라서, 본 연구에서는 면역 증강 활성이 우수한 것으로 평가되었던 토란의 면역활성 본체를 분리, 정제하고 그 구조적 특성을 살펴봄으로써 토란 유래 면역활성 본체인 토란 다당체를 이용한 건강기능식품의 소재로 개발함에 있어 그 기초자료를 제공하고자 하였다.

제안 방법

CE-4a의 전체 구조를 규명하기 위하여 3종의 구조 특이적 효소를 활용한 연속적 효소처리를 통해구조분석이 용이한 형태인 분자량이 작은 oligo당으로 가수분해하였다(McCleary 등, 1987). 연속적인 효소처리를 행하여 가수분해를 하였다.
Enzymatic hydrolysis I- CE-4a 시료 40mg을 50mM ammonium formate buffer (pH 5.5)에 용해시키고, 10 units의 endo-α-(1→4)-polygalacturonase (from A. actuleatus, Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Ireland)를 가하여 40ºC 항온수조에서 5일간 가수분해를 행하고, 100ºC에서 15분간 중탕하여 잔존효소를 실활시켰다. 이 반응물을 원심분리한 상등액은 50mM ammonium formate buffer (pH 5.
Exo-α-galactosidase 처리 후, 분획된 고분자 획분 AG-I은 endo-α-(1→4)-mannanase로 재차 가수분해하였고 위와 동일한 column 을 이용하여 분획하였다. 그 결과, Fig.
그 후, 환원과정 및 acetyl화 과정을 통해 partially methylated alditol acetate로 전환하였으며, 이는 2상 용매계(chloroform, H2O)로 분리, 추출하여 acetone에 용해시켜 GC 및 GC-MS로 분석하였다. GC 분석은 capillary column (SP-2380, 0.25mm×30m, 0.2 μm film thickness; Supelco, Bellefonte, USA)이 장착된 gas chromatography (ACME6100, Young-Lin Co., Ltd., Anyang,Korea)를 사용하여 최적온도 조건 [60 C (1min), 60 C→180 C(30/min), 180 C→250 C (1.5/min), 250°C (5min)]에서 splitless injection mode (1/20)로 분석하였으며, 이때 carrier gas (N2)의 flow rate는 1.5mL/min로 조정하였다. 한편 GC-MS는 SP-2380 capillary column을 장착한 Agilent 6890N GC system과 5973N mass spectrophotometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 GC 분석과 동일한 최적온도 조건에서 splitless injection mode (He flow rate: 1.
Hakomori 방법(Hakomori, 1964)을 일부 변형하여 다당시료의 결합 위치 결정을 위한 methylation analysis를 실시하였다. 동결건조된 다당 시료 1mg에 1mL의 무수 DMSO (dimethylsulfoxide)를 가해 용해시킨 후, 실험실에서 NaH와 DMSO로 합성한 methylsulfinyl carbanion (MSCA)을 500μL씩 가하여 4시간 동안 반응시켰다.
다당이 완전하게 polyalkoxide로 전환될 수 있도록 필요한 경우 MSCA를 수차례 반복하여 첨가하였고 그 잔존량은 triphenylmethane으로 확인하였다. Methyl화 다당은 Sep-Pak C18 cartridge (Waters Associates, Milford, MA, USA)를 이용하여 여러 단계에 거쳐 회수하였다. Methyl화 된 시료는 2M TFA를 1mL을 가하여 121 C, 90분간 반응시켜 가수분해 후 건조하였다.
05-2M NaCl 용액으로 흡착획분을 각각 용출시켜 분리하였다. 각각 용출된 획분은 anion exchange chromatography column에서 fraction collector (1200 series, EYELA, Tokyo, Japan)를 연결하여 분획하고, 각각의 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 측정하여 용출 peak를 작성하였다. 본 이온교환 수지를 통해 조다당 획분 CE으로부터 얻은 1개의 비흡착획분(CE-1)과 7개의 흡착획분(CE-2~8)들은 농축, 투석 및 동결건조 과정을 거쳐 이후의 실험에 사용하였다(Fig.
7):acetonitrile=82:18을 flow rate1mL/min로 60분, 컬럼온도 30 C로 설정하여 분석하였다. 구성당의 정량 분석은 glucosamine을 internal standard (ISTD)로 두어 peak의 면적비로 계산한 표준물질곡선을 이용하여 정량분석을 하였으며, mole%는 peak의 면적비, UV detector에 대한 반응계수 및 유도체화 된 각 구성당의 분자량으로부터 계산하였다.
Methyl화 된 시료는 2M TFA를 1mL을 가하여 121 C, 90분간 반응시켜 가수분해 후 건조하였다. 그 후, 환원과정 및 acetyl화 과정을 통해 partially methylated alditol acetate로 전환하였으며, 이는 2상 용매계(chloroform, H2O)로 분리, 추출하여 acetone에 용해시켜 GC 및 GC-MS로 분석하였다. GC 분석은 capillary column (SP-2380, 0.
의 방법을 일부 변형하여 실험을 진행하였다(Honda 등, 1989). 다당 시료를 2M trifluoroacetic acid (TFA; Sigma AldrichCo. St. Louise, MO, USA)로 121 C, 90분간 가수분해한 후, 알칼리 조건에서 0.5M 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP)를 첨가하여 70 C에서 1시간 반응시킨 이후, DIW (Deionized water)와 chloroform을 이용하여 PMP-labeled monosaccharide를 회수하고membrane filtration을 거쳐 Acclaim 120 C₁₈ (4.6×250mm, Thermo Scientific, Sunnyvale, CA, USA) 컬럼이 장착된 Shimazu HPLC-UVD (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)를 이용하여 0.1M phosphate buffer (pH 6.7):acetonitrile=82:18을 flow rate1mL/min로 60분, 컬럼온도 30 C로 설정하여 분석하였다. 구성당의 정량 분석은 glucosamine을 internal standard (ISTD)로 두어 peak의 면적비로 계산한 표준물질곡선을 이용하여 정량분석을 하였으며, mole%는 peak의 면적비, UV detector에 대한 반응계수 및 유도체화 된 각 구성당의 분자량으로부터 계산하였다.
동결건조된 다당 시료 1mg에 1mL의 무수 DMSO (dimethylsulfoxide)를 가해 용해시킨 후, 실험실에서 NaH와 DMSO로 합성한 methylsulfinyl carbanion (MSCA)을 500μL씩 가하여 4시간 동안 반응시켰다. 다당이 완전하게 polyalkoxide로 전환될 수 있도록 필요한 경우 MSCA를 수차례 반복하여 첨가하였고 그 잔존량은 triphenylmethane으로 확인하였다. Methyl화 다당은 Sep-Pak C18 cartridge (Waters Associates, Milford, MA, USA)를 이용하여 여러 단계에 거쳐 회수하였다.
분자량 및 정제도 측정을 위해 사용한 HPLC는 Asahipak GS520, GS320, GS220 (각 0.76×30cm, Showa Denko Co., Tokyo, Japan)을 Agilent 1260 Infinity LC system (Agilent Technologies Co., Ltd, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 50mM ammonium formate buffer (pH 5.5; Duksan Pure Chemicals Co., Ltd, Ansan, Korea)를 용매로 0.5mL/min로 용출하였으며 정제 다당의 분자량은 standard pullulans (P-800, P-400, 200, 100, 50, 20, 10 및 5; Showa Denko Co., Tokyo, Japan)를 표준물질로 하여 얻어진 표준곡선과 비교하여 측정하였다. 구성당 분석은 Honda S.
1987). 연속적인 효소처리를 행하여 가수분해를 하였다. 이때 사용한 endo-α-(1→4)-polygalacturonase, exo-α-galactosidase 및 endo-β-mannanase 효소는, 제조사가 제공한 처리조건을 실험실 조건에 맞게 응용하여 사용하였다.
, Ansan, Korea)로 평형화된 Sephadex G-100 column (4×120cm; GE Healthcare)을 이용, gel permeation chromatography (GPC)를 수행하였다. 용출액은 7mL 씩 100개의 획분으로 분획하였으며, 각 획분의 중성당 함량을 측정하여 분자량이 상이한 2개의 획분 CE-4a과 CE-4b를 얻을 수있었다.
, Wicklow, Ireland)를 가하여 40ºC 항온수조에서 5일간 가수분해를 행하고, 100ºC에서 15분간 중탕하여 잔존효소를 실활시켰다. 이 반응물을 원심분리한 상등액은 50mM ammonium formate buffer (pH 5.5; Duksan Pure Chemicals Co., Ltd.)로 평형화된 Superdex 75 GL column (GE Healthcare BioSciences, Piscataway, NJ, USA)을 이용하여 HPLC상에서 분획하고, 분자량 및 구성 성분이 상이한 PG-I과 PG-II 두 개의 획분을 얻었다.
niger, Megazyme)를 가하여 45ºC 항온수조에서 72시간 가수분해를 행하고, 100ºC 에서 15분간 중탕하여 잔존효소를 실활시켰다. 이 반응물을 원심분리한 상등액은 Enzymatic hydrolysis I과 동일한 조건의 column을 이용하여 HPLC상에서 분획하고, 분자량 및 구성 성분이 상이한 AG-I과 AG-II 두 개의 획분을 얻었다.
연속적인 효소처리를 행하여 가수분해를 하였다. 이때 사용한 endo-α-(1→4)-polygalacturonase, exo-α-galactosidase 및 endo-β-mannanase 효소는, 제조사가 제공한 처리조건을 실험실 조건에 맞게 응용하여 사용하였다.
1). 이온교환수지로 분리된 토란 유래 다당체 8종 중 고면역활성 물질을 선별하기 위하여 인체의 감염에 있어 초기 면역 반응에 관여하는 보체계 활성을 측정하였다. 시판중인 운지 버섯 유래 면역활성 다당체 (PSK)를 양성대조군으로 하여 항보체 활성을 비교·분석한 결과, 흡착획분 CE-5, CE-6 및 CE-7에서 양성대조군인 PSK에 준하는 우수한 활성이 확인되었으며, CE-4는 이들 보다는 약간 낮지만 우수한 항 보체 활성을 나타내었다(Fig.
1). 이온교환수지를 이용한 정제과정 중 수율과 면역활성이 양호했던 CE-4 획분 0.5g을 소량의 물에 녹인 후 50mM ammonium formate buffer (pH 5.5; Duksan Pure Chemicals Co., Ltd., Ansan, Korea)로 평형화된 Sephadex G-100 column (4×120cm; GE Healthcare)을 이용, gel permeation chromatography (GPC)를 수행하였다. 용출액은 7mL 씩 100개의 획분으로 분획하였으며, 각 획분의 중성당 함량을 측정하여 분자량이 상이한 2개의 획분 CE-4a과 CE-4b를 얻을 수있었다.
전남 곡성에서 수확한 토란을 껍질을 제거하고 절편한 후 냉수추출 하고, 에탄올 침전, 투석 및 동결건조를 행하여 토란 조다당 CE를 얻었다. 토란에서 분리한 조다당을 소량의 증류수에녹인 후, 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose FF (Cl form, 5.
하지만, CE-4b는 수율이 매우 낮아 CE-4a만을 선택하여 이 후 실험에 사용하였다. 토란유래 정제다당 CE-4a의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 Asahipak GS-520+GS-320+ GS-220 컬럼이 장착된 HPLC로 분석하였다. Fig.
토란의 껍질을 제거하고 절편한 후 냉수추출 하고, 에탄올 침전, 투석 및 동결건조를 행하여 분리한 조다당 CE를 소량의 증류수에 녹인 획분을 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose FF (Cl form, 5.5×25cm; GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column에 흡착시키고, 증류수를 용출하여 비흡착획분을 분리하였으며 이후 단계적으로 0.05-2M NaCl 용액으로 흡착획분을 각각 용출시켜 분리하였다. 각각 용출된 획분은 anion exchange chromatography column에서 fraction collector (1200 series, EYELA, Tokyo, Japan)를 연결하여 분획하고, 각각의 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 측정하여 용출 peak를 작성하였다.
5mL/min로 조정하였다. 한편 GC-MS는 SP-2380 capillary column을 장착한 Agilent 6890N GC system과 5973N mass spectrophotometer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)를 이용하여 GC 분석과 동일한 최적온도 조건에서 splitless injection mode (He flow rate: 1.5mL/min)로 분석하였다. Methyl화 된 시료의 유도체는 GC-MS에 의한 fragment ion 분석과 GC의 상대보유 시간을 조합하여 동정하였으며 각 peak의 mole%는 peak의 면적 및 분자응답계수로부터 환산하였다(Sweet 등, 1975).

대상 데이터

GS520, GS320, and GS220 columns were used in this analysis.
본 실험에서 사용된 토란(Colocasia esculenta)은 2019년도에 경남 곡성 지역에서 수확한 것을 껍질을 제거한 후, −20 C 냉동상태에서 보관하면서 실험 재료로 사용하였다.
각각 용출된 획분은 anion exchange chromatography column에서 fraction collector (1200 series, EYELA, Tokyo, Japan)를 연결하여 분획하고, 각각의 중성당, 산성당, 단백질 및 KDO 함량을 측정하여 용출 peak를 작성하였다. 본 이온교환 수지를 통해 조다당 획분 CE으로부터 얻은 1개의 비흡착획분(CE-1)과 7개의 흡착획분(CE-2~8)들은 농축, 투석 및 동결건조 과정을 거쳐 이후의 실험에 사용하였다(Fig. 1). 이온교환수지를 이용한 정제과정 중 수율과 면역활성이 양호했던 CE-4 획분 0.

데이터처리

0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다. 시료 및 처리 농도간 유의성은 분산분석(ANOVA)를 실시한 후, Duncan’s multiple range test로 사후검정을 실시하여 p<0.05~p<0.001 수준에서 유의성을 검증하였다.
실험결과는 SPSS 20.0 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 사용하여 통계처리 하였으며 평균값과 표준편차로 나타내었다. 시료 및 처리 농도간 유의성은 분산분석(ANOVA)를 실시한 후, Duncan’s multiple range test로 사후검정을 실시하여 p<0.

이론/모형

보체계의 활성(anti-complementary activity)은 기존의 Mayer법(Kabat과 Mayer, 1971)을 이용하여 시료로 보체를 활성화시킨 후, 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈활성에 근거를 둔 complement fixation test로 측정하였다. 즉, 1차 반응인 정상인의 혈청, 2%2+ 2+ 2+gelatin, 3mM Ca 과 10mM Mg 이 함유된 GVB 완충용액(gelatin veronalbuffered saline, pH 7.

성능/효과

7%가 미량 검출되었다. CE-4a의 구성당 결과를 미루어보아 mannogalactan 또는 galactomannan에 산성당이 결합되어 존재하는 것으로 추정되었다 (Table 2). 이러한 galactomannan은 주로 콩과 식물, 호로파(Trigonella foenum-graecum L.
할 수 있다. CE-4a의 구성당을 분석한 결과, CE-4a는 4 개의 구성당이 확인되었으며 galactose (Gal) 43.5%, mannose (Man) 18.2%, galacturonic acid (GalA) 35.5%가 주로 높은 비율로 함유되었으며, 그 이외에도 arabinose (Ara) 2.7%가 미량 검출되었다. CE-4a의 구성당 결과를 미루어보아 mannogalactan 또는 galactomannan에 산성당이 결합되어 존재하는 것으로 추정되었다 (Table 2).
4 kDa의 고분자 다당체임을 확인할 수 있었다. CE-4a의 항보체 활성을 반복 확인한 결과, CE-4a는 농도 의존적으로 우수한 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, CE-4a가 토란의 활성 본체임을 확인할 수 있었다 (Fig. 4).
Endo-α-(1→4)-polygalacturonase 처리 후, 고분자로 남아있던 PG-I에 exo-α-galactosidase를 처리하고 Superdex 75 GL column 을 이용하여 HPLC로 분획한 결과, Fig. 7(B)에 나타난 바와 같이 AG-I 및 AG-II의 2개 획분으로 분리할 수 있었다. Endo-α-(1→4)-polygalacturonase 처리 후의 획분인 PG-I이 exo-α-galactosi-dase 처리에 의해 단편이 생성했다는 사실은 토란 유래의 정제 다당인 CE-4a 중에 side chain이 α-galactan으로 존재하고 있음을 확인하였으며 앞선 당쇄 결합 양식에서 3-linked galactose가 다량 검출된 것과 종합하여 볼 때 α-(1→3)-galactan형태로 존재하고 있음을 추정할 수 있었다.
7(B)에 나타난 바와 같이 AG-I 및 AG-II의 2개 획분으로 분리할 수 있었다. Endo-α-(1→4)-polygalacturonase 처리 후의 획분인 PG-I이 exo-α-galactosi-dase 처리에 의해 단편이 생성했다는 사실은 토란 유래의 정제 다당인 CE-4a 중에 side chain이 α-galactan으로 존재하고 있음을 확인하였으며 앞선 당쇄 결합 양식에서 3-linked galactose가 다량 검출된 것과 종합하여 볼 때 α-(1→3)-galactan형태로 존재하고 있음을 추정할 수 있었다. 그러나 PG-I은 exo-α-galactosidase를 처리하였음에도 불구하고 다량의 galactose가 제거되지 않고 존재함을 확인할 수 있었다.
7(B)에 나타난 바와 같이 PG-I 및 PG-II의 2개 획분으로 분리할 수 있었다. PG-I의 구성당 분석결과(Table 2), 미처리 획분인 CE-4a와 비교했을 때 다른 구성 당 조성은 비슷하지만, GalA가 줄어든 것을 확인할 수 있었고, PG-II의 경우는 GalA만으로 구성된 특성을 보여 CE-4a의 일부가 GalA로 치환되어 있음을 추정케 하였다(data not shown).
5%의 높은 비율로 함유하고 있었다. 따라서 토란이 갖는 면역활성은 고도로 분지된 galactomannan에 산성당이 결합되어 있는 구조로 시사됨을 알 수 있었다.
4%)로 검출되어 Man는 주쇄를, Gal는 측쇄를 이루고 있는 것으로 추정되었다. 또한, 3-linked-Galp와 2, 3-branched-Galp 및 3, 6-branched-Galp가 검출된 것으로 보아 galactan 형태로 존재하는 side chain은 13결합으로 연결된 galactose core에 C(O)2 또는 C(O)6 위치에서 또 다른 Gal가 분지되어 비환원 말단을 구성함을 추정할 수 있었다. 그러나 galactan core에 side chain이 뻗어져 나간 branching point보다 비환원 말단인 terminal의 비율이 높은 것으로 보아 galactan 사슬의 길이가 짧은 oligo당 형태일 것으로 추정되었다.
이온교환수지로 분리된 토란 유래 다당체 8종 중 고면역활성 물질을 선별하기 위하여 인체의 감염에 있어 초기 면역 반응에 관여하는 보체계 활성을 측정하였다. 시판중인 운지 버섯 유래 면역활성 다당체 (PSK)를 양성대조군으로 하여 항보체 활성을 비교·분석한 결과, 흡착획분 CE-5, CE-6 및 CE-7에서 양성대조군인 PSK에 준하는 우수한 활성이 확인되었으며, CE-4는 이들 보다는 약간 낮지만 우수한 항 보체 활성을 나타내었다(Fig. 3). 항보체 활성은 CE-5, CE-6 및 CE-7이 가장 우수하였으나 수율이 매우 낮아 토란의 활성 물질로 선별하기에는 부적합하며, 우수한 활성뿐만 아니라 높은 수율을 나타낸 CE-4 시료가 토란의 주된 활성 물질로 사용하기 적합할 것으로 판단되었다.
우수한 수율과 높은 항보체 활성을 나타낸 흡착 획분 CE-4의 정제도를 높이기 위하여 Sephadex G-100 column을 이용하여 재차 분리한 결과, 분자량이 상이한 두개의 획분 CE-4a와 CE-4b를 얻을 수 있었다. 하지만, CE-4b는 수율이 매우 낮아 CE-4a만을 선택하여 이 후 실험에 사용하였다.
위 결과로 부터 CE-4a의 주쇄(main chain)는 (1→4)-mannan 형태로 존재하며, (1→4)-mannan main chain의 C(O)6 위치에서 다시 한가닥의 측쇄가 뻗어져 나가거나 C(O)2 및 C(O)6 위치에서 동시에 두가닥의 측쇄로 뻗어져 나가있는 형태로 존재할 가능성이 확인되었다. 특히 토란에서 유래한 CE-4a 정제 다당에는 2, 4, 6-linked Manp 잔기가 특히 높은 비율로 검출되었는데, 이러한 사실은 (1→4)-mannan 주쇄에 두가닥으로 galactan 측쇄가 연결된 형태로, 타 식물체 유래의 다당에서는 잘 발견되지 않는 특이한 결합으로써 고도로 분지된 형태임을 확인할 수 있었다.
CE를 얻었다. 토란에서 분리한 조다당을 소량의 증류수에녹인 후, 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose FF (Cl form, 5.5 ×25 cm) column에 흡착시켜 분획한 결과, 비흡착획분 CE-1은 6%의 수율로 회수되었고 흡착획분 CE-2~8은 각각 8.7, 7.2, 24.3, 1.8, 1.5, 0% 및 1.3% 수율로 분리되었으며 흡착획분 CE-4의 수율이 가장 우수함을 확인하였다(Fig. 1). 이온교환수지로 분리된 토란 유래 다당체 8종 중 고면역활성 물질을 선별하기 위하여 인체의 감염에 있어 초기 면역 반응에 관여하는 보체계 활성을 측정하였다.
Table 1에서 보는 바와 같이 CE-4a는 총 10종의 당쇄 결합이 검출되었으며 Gal 결합 및 Man 결합이 높은 비율로 확인되었다. 특히 Man의 비환원 말단은 검출되지 않았으나 Gal 잔기의 경우 비환원성 말단에 존재함을 의미하는 Terminal Galp가 높은 비율(48.4%)로 검출되어 Man는 주쇄를, Gal는 측쇄를 이루고 있는 것으로 추정되었다. 또한, 3-linked-Galp와 2, 3-branched-Galp 및 3, 6-branched-Galp가 검출된 것으로 보아 galactan 형태로 존재하는 side chain은 13결합으로 연결된 galactose core에 C(O)2 또는 C(O)6 위치에서 또 다른 Gal가 분지되어 비환원 말단을 구성함을 추정할 수 있었다.
확인되었다. 특히 토란에서 유래한 CE-4a 정제 다당에는 2, 4, 6-linked Manp 잔기가 특히 높은 비율로 검출되었는데, 이러한 사실은 (1→4)-mannan 주쇄에 두가닥으로 galactan 측쇄가 연결된 형태로, 타 식물체 유래의 다당에서는 잘 발견되지 않는 특이한 결합으로써 고도로 분지된 형태임을 확인할 수 있었다. 일반적으로 토란에서 관찰되는 높은 점질류와 생리활성은 이처럼 고도로 분지된 galactomannan구조에 기인하는 것으로 판단된다.
그러나 galactan core에 side chain이 뻗어져 나간 branching point보다 비환원 말단인 terminal의 비율이 높은 것으로 보아 galactan 사슬의 길이가 짧은 oligo당 형태일 것으로 추정되었다. 한편 주쇄를 이루고 있는 추정된 Man 잔기의 경우 4-linked Manp와 4, 6-linked Manp, 2, 4, 6-linked Manp가 검출되었으며, 특히 2, 4, 6-linked Manp가 월등히 높은 비율로 검출된 것으로 확인되었다.
3). 항보체 활성은 CE-5, CE-6 및 CE-7이 가장 우수하였으나 수율이 매우 낮아 토란의 활성 물질로 선별하기에는 부적합하며, 우수한 활성뿐만 아니라 높은 수율을 나타낸 CE-4 시료가 토란의 주된 활성 물질로 사용하기 적합할 것으로 판단되었다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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