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문제 정의
- 오령산의 5가지 구성 약재인 택사, 저령, 복령, 육계 및 백출 모두 체내 수분을 조절하여 부종을 제거한다고 알려져 있다.18) 본 연구에서는 오령산 정제의 제조를 통해 주요성분과 활성을 확인하고자 하였다. 정제의 제조를 위해 겉보기밀도, 탭 밀도 등으로 혼합물의 우수한 흐름성을 판단하고 제조된 정제의 경도, 마손도, 붕해도 등을 확인을 통하여 물성평가를 진행하였다.
- 논란이 빈번하게 제기되어 왔다. 이에 오령산을 기존의 탕액보다 보관 및 복용 편의성이 높은 현대적인 제형인 정제로 개발하였으며, 오령산 정제의 주요성분 및 활성을 확인하였다. 본 연구의 결과를 통해서 얻어진 오령산의 주요성분에 대한 동시분석법과 활성평가 결과는 한약제제에 대한 제형개발과 표준화 연구를 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
제안 방법
- 13-15) 본 연구는 오령산을 대상으로 보관과 복용이 편리한 현대적 제형으로 개발하고, 주요성분의 동시 분석법 개발하여 품질관리법을 확보하였으며, 항산화, 항염증 실험을 통하여 오령산 정제의 약리효능을 확인하였다.
- 16) ORS-F는 100, 200, 500, 1000 ㎍/㎖로 희석하여 96 well plate에 100 ㎕를 주입하고 0.2 mM DPPH 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시켜 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 희석 용매인 정제수를 대조군으로 하고, 활성비교를 위하여 양성대조군으로 Butylated hydroxyanisole (BHA)를 사용하였다.
- DPPH 및 ABTS assay를 이용하여 라디칼 소거능을 확인하였고, 또한 항산화 물질인 polyphenol과 flavonoid 함량을 확인하였다. DPPH 라디칼 소거능에서 ORS-F의 EC50값은 396.
- HPLC-PDA를 이용하여 오령산 구성 한약재 중 백출의 atractylenolide Ⅲ, 육계의 coumarin, cinnamic acid 및 cinnamaldehyde, 저령의 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, polyporusterone A 및 polyporusterone B, 그리고 택사의 alisol B 23-acetate 등 총 8종의 지표물질에 대한 동시분석법을 확립하였다(Fig. 1). 이동상인 water와 acetonitrile에 0.
- ratio에 의해 평가하였다. Hausmer ratio는 Excellent (1.00~1.11), Good (1.12~1.18), Fair (1.19~1.25), Passible (1.26~1.34), Poor (1.35~1.45), Very poor (1.46~1.59), Very very poor (>1.60)의 총 7개 등급으로 나누어 흐름성을 평가하였다. 또한 오령산 정제의 첨가제 혼합비에 따른 경도, 마손도 및 붕해도를 측정한 결과는 Table 4와 같다.
- 정제의 제조를 위해 겉보기밀도, 탭 밀도 등으로 혼합물의 우수한 흐름성을 판단하고 제조된 정제의 경도, 마손도, 붕해도 등을 확인을 통하여 물성평가를 진행하였다. Hausner ratio값의 측정을 통해 정제 제조에 적합한 흐름성의 혼합물을 제조하였으며, 경도, 마손도 및 붕해도의 확인으로 제제학적으로 우수한 물성을 가지는 배합비의 정제를 제조하였다. 오령산의 주요성분인 atractylenolide Ⅲ, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, polyporusterone A, polyporusterone B 및 alisol B 23-acetaterk 8종의 분석을 위해 HPLC-PDA를 이용하여 다른 성분들에 영향을 주지 않으면서 동시에 효과적으로 확인할 수 있는 동시 분석법을 확립하였다.
- 이 후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 24시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하고 배양 상층액을 취해 각 실험에 사용하고 세포는 cell extraction을 위하여 사용하였다. NO 측정을 위해서 배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent (Sigma, USA)를 넣고 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Tecan Infinite M200)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 standard curve와 비교해 계산하였다.
- Sodium nitrite의 standard curve와 비교해 계산하였다. PGE2 사이토카인 분비측정을 위해 ELISA kit (BD, USA)를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다. 양성 대조군으로 Dexamethasone을 사용하였다.
- RAW 264.7세포를 12 well plate에 5×104 cell/well로 분주하고 ORS-F를 50, 100, 200 ㎍/㎖로 1시간 전처리를 하였다. 이 후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 24시간동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하고 배양 상층액을 취해 각 실험에 사용하고 세포는 cell extraction을 위하여 사용하였다.
- RAW264.7 세포에 약물을 처리하고 LPS를 처리하여 약물의 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 발현 억제를 통한 NO 및 PGE2 생성억제 효과를 확인하였다. 그 결과 ORS-F는 농도 의존적으로 NO (Fig 3A)와 PGE2 (Fig 3B)의 생성을 억제하였으며, 대조군 DEX보다 더 높은 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다.
- RNA 분리를 위해 RAW 264.7세포를 12 well plate에 5×104 cell/well로 분주하고 ORS-F를 50, 100, 200 ㎍/㎖로 1시간 전처리를 하였다. 이후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 2시간 및 6시간 동안 배양하고 이 후, RNA iso reagent를 이용해 제조사의 방법에 따라 Total RNA를 취하였다.
- NO 측정을 위해서 배양액 100 ㎕에 동량의 Griess reagent (Sigma, USA)를 넣고 10분간 반응시킨 후 microplate reader (Tecan Infinite M200)를 이용하여 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. Sodium nitrite의 standard curve와 비교해 계산하였다. PGE2 사이토카인 분비측정을 위해 ELISA kit (BD, USA)를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다.
- 이후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 2시간 및 6시간 동안 배양하고 이 후, RNA iso reagent를 이용해 제조사의 방법에 따라 Total RNA를 취하였다. Total RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 유전자 증폭을 위해 특정 primer를 넣고 각 primer에 따른 PCR 조건에 따라 실시하였다. 사용한 primer는 다음과 같다.
- 각 DNA는 1.5% agarose gel에 전기 영동시킨 후 UV 검출기로 확인하였다.
- 모든 평가는 3회 측정값의 평균으로 계산하였다. 마손도는 10개의 정제를 Friability Tester (TAR 120, Ereweka, Germany)에서 25 rpm으로 4분 동안 회전시킨 후, 손실된 무게를 측정하여 다음의 수식으로 계산하였다.
- 붕해도 시험은 Disintegration Tester (Disintegration 3100, DISTEK, USA)를 사용하여 37 ± 0.5℃의 정제수에서 시험하였고, 붕해시간은 검체의 잔여물이 유리관 안에 존재하지 않거나 남아있더라도 원형을 나타내지 않는 연질의 물질이 존재할 때까지의 시간으로 하였다.
- 각각의 건조엑스는 Table 1의 비율대로 혼합하여 정제 제조에 사용하였다. 오령산 정제 (ORS-F)는 Table 2의 비율에 따라 각각의 건조엑스와 첨가제를 칭량한 후 균일하게 혼합한 다음 단발타정기(TRB 16, Ereweka, Germany)를 사용하여 직접 타정법을 통해 제조하였으며, 제조된 정제는 데시케이터에 보관하였다.
- 오령산 정제(ORS-F) 의 주요성분의 확인을 위해 HPLC-DAD를 이용하여 오령산의 8가지 지표성분인 atractylenolide Ⅲ, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, popyporusterone A, popyporusterone B 및 alisol B 23-acetate 의 동시분석법을 확립하였다.
- 오령산의 구성은 Table 1과 같다. 오령산 정제를 제조하기 위해 오령산을 구성하는 한약재 즉, 백출, 육계, 저령, 복령 및 택사를 각각 단일 칭량한 후 중량의 10배에 해당하는 정제수를 넣고 100℃에서 3시간 동안 추출, 여과 및 농축한 다음 진공 건조하여 단일 건조엑스를 얻었다. 각각의 건조엑스는 Table 1의 비율대로 혼합하여 정제 제조에 사용하였다.
- 오령산을 구성하는 각 한약재의 건조엑스와 첨가제를 혼합한 후 물성평가를 위해 겉보기 밀도(Bulk density, ρbulk)와 탭 밀도 (Tap density, ρtapped)를 측정하였고, 그 측정값으로 Hausner ration 값을 구하여 흐름성을 평가하였다.
- 오령산의 정제(ORS-F) 제조를 위하여 겉보기 및 탭 밀도를 측정하여 흐름성이 우수한 혼합물을 제조하고, 경도, 마손도 및 붕해도 등 제제학적 물성평가를 통해 제제학적으로 우수한 정제의 배합비를 설정하였다.
- Hausner ratio값의 측정을 통해 정제 제조에 적합한 흐름성의 혼합물을 제조하였으며, 경도, 마손도 및 붕해도의 확인으로 제제학적으로 우수한 물성을 가지는 배합비의 정제를 제조하였다. 오령산의 주요성분인 atractylenolide Ⅲ, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, polyporusterone A, polyporusterone B 및 alisol B 23-acetaterk 8종의 분석을 위해 HPLC-PDA를 이용하여 다른 성분들에 영향을 주지 않으면서 동시에 효과적으로 확인할 수 있는 동시 분석법을 확립하였다. 오령산의 주요성분 동시분석법은 기존 지표 성분들을 개별적으로 분석하는 것보다 효율적으로 분석이 가능하여 품질관리를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 붕해도 측정결과 F3과 F4에서의 15분 이내에 모두 붕해되는 것으로 나타났다. 이상의 측정결과 우수한 제제학적 특성을 나타낸 F4를 오령산 정제 제조를 위한 최적 배합비로 설정하였다.
- 7세포를 12 well plate에 5×104 cell/well로 분주하고 ORS-F를 50, 100, 200 ㎍/㎖로 1시간 전처리를 하였다. 이후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 2시간 및 6시간 동안 배양하고 이 후, RNA iso reagent를 이용해 제조사의 방법에 따라 Total RNA를 취하였다. Total RNA는 Maxime RT PreMix Kit (iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였고, 유전자 증폭을 위해 특정 primer를 넣고 각 primer에 따른 PCR 조건에 따라 실시하였다.
- 18) 본 연구에서는 오령산 정제의 제조를 통해 주요성분과 활성을 확인하고자 하였다. 정제의 제조를 위해 겉보기밀도, 탭 밀도 등으로 혼합물의 우수한 흐름성을 판단하고 제조된 정제의 경도, 마손도, 붕해도 등을 확인을 통하여 물성평가를 진행하였다. Hausner ratio값의 측정을 통해 정제 제조에 적합한 흐름성의 혼합물을 제조하였으며, 경도, 마손도 및 붕해도의 확인으로 제제학적으로 우수한 물성을 가지는 배합비의 정제를 제조하였다.
- 항산화능은 희석 용매인 정제수를 대조군으로 하고, 활성비교를 위하여 양성대조군으로 Butylated hydroxyanisole (BHA)를 사용하였다. 총 폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Aldrich, USA)가 추출물의 폴리 페놀성 화합물에 의해 환원되어 청자색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma Aldrich, USA) 를 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 표준물질로는 tannic acid (Sigma Aldrich, USA) 를 이용하여 검량선을 작성하였다. 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등의 방법17)을 변형하여 측정하였고, 표준물질로 quercetin (Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 항산화 활성을 평가하기 위하여 Blios의 방법을 변형하여 DPPH (1-1-diphenyl-2- picrylhydrazyl, Sigma Aldrich, USA) radical 소거능을 측정하였다.16) ORS-F는 100, 200, 500, 1000 ㎍/㎖로 희석하여 96 well plate에 100 ㎕를 주입하고 0.
- 2 mM DPPH 50 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 실온에서 30분 동안 반응시켜 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 항산화능은 희석 용매인 정제수를 대조군으로 하고, 활성비교를 위하여 양성대조군으로 Butylated hydroxyanisole (BHA)를 사용하였다. 총 폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Aldrich, USA)가 추출물의 폴리 페놀성 화합물에 의해 환원되어 청자색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다.
대상 데이터
- 0 ㎖/min으로 하였고 시료 주입량은 10 ㎕였다. 8종 지표성분의 검출은 PDA 검출기를 이용하여 210 ㎚, 254 ㎚ 및 280 ㎚의 파장에서 분석하였다. 이동상은 Table 3에서와 같이 기울기 용매 조건으로 최적의 분리조건을 확립하였다.
- Santa Cruze (USA)에서 구입하였다. Total RNA extraction을 위해 사용한 RNAiso는 TaKaRa (Japan)에서, cDNA 합성과 PCR에 사용한 모든 시약은 Intron (Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 단백질 분석을 위해 사용한 1차 항체인 iNOS는 BD Bioscience (USA), β-actin과 2차 항체인 goat anti-Mouse IgG-HRP는 Santa Cruze (USA)에서 구입하였다. Total RNA extraction을 위해 사용한 RNAiso는 TaKaRa (Japan)에서, cDNA 합성과 PCR에 사용한 모든 시약은 Intron (Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 세포배양을 위해 Fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s modified eagle’s medium (DMEM), Penicillin-streptomycin, Posphate buffered saline (PBS)는 Hyclone (USA), Lipopolysaccharide (LPS), Ehtanol, Chloroform, 2, 2-diphenyl-1- picrylhygrazy (DPPH)은 Sigma-Aldrich (USA), TNF-α, IL-1β 및 IL-6에 대한 Enzyme-Linked Immunosorbent assay (ELISA) kit는 R&D Systme (USA) 에서 구입하여 사용하였다.
- 시료 전처리 및 HPLC 분석을 위한 아세토니트릴과 메탄올은 액체크로마토그래피용(J.T. Baker, USA)으로 구입하였고, phosphoric acid는 Junsei (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 표준물질로 사용한 3, 4-Dihydroxybenzaldehyde, Coumarin, polyporusteron B, Cinnamic acid, Polyporusterone A, Cinnamaldehyde, Atractylenolide Ⅲ 및 Alisol B 23-acetatee Sigma Chemical Co.
- 실험에 사용된 오령산의 구성 한약재 중 백출(白朮), 육계(肉 桂), 저령(豬苓), 복령(茯苓) 및 택사(澤瀉)는 ㈜휴먼허브 (Gyeongsan, Korea)에서 구입하여 전문가 감별 후 사용하였다. 각각의 구성 한약재들의 표본은 한국한의약진흥원 한의기술 R&D2팀의 한약재보관실에 보관하였다.
- PGE2 사이토카인 분비측정을 위해 ELISA kit (BD, USA)를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다. 양성 대조군으로 Dexamethasone을 사용하였다.
- 정제 제조를 위한 첨가제인 Lactose, Starch, Vivasol, SiO2, Magnesium stearatesms ㈜화원약품(seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
- Baker, USA)으로 구입하였고, phosphoric acid는 Junsei (Japan)에서 구입하여 사용하였다. 표준물질로 사용한 3, 4-Dihydroxybenzaldehyde, Coumarin, polyporusteron B, Cinnamic acid, Polyporusterone A, Cinnamaldehyde, Atractylenolide Ⅲ 및 Alisol B 23-acetatee Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였으며, 각 표준물질의 순도는 95% 이상이었다. HPLC는 Agilent 1260 series를 사용하였고, YMC C18 (5㎛, 4.
- 총 폴리페놀함량은 Folin-Ciocalteu reagent (Sigma Aldrich, USA)가 추출물의 폴리 페놀성 화합물에 의해 환원되어 청자색으로 발색하는 것을 원리로 분석하였다. 표준물질로는 tannic acid (Sigma Aldrich, USA) 를 이용하여 검량선을 작성하였다. 플라보노이드 함량은 Singleton VL 등의 방법17)을 변형하여 측정하였고, 표준물질로 quercetin (Sigma Aldrich, USA)를 이용하여 검량선을 작성하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의성 검사는 one way ANOVA test를 실시한 후 Turkey test로 사후 검증하였다. P<0.
- 제조된 오령산 정제는 무게, 직경, 두께, 경도를 Hardness Tester (TBH 325, Ereweka, Germany)를 통해 측정하였으며, 이때 모든 평가는 3회 측정값의 평균으로 계산하였다. 마손도는 10개의 정제를 Friability Tester (TAR 120, Ereweka, Germany)에서 25 rpm으로 4분 동안 회전시킨 후, 손실된 무게를 측정하여 다음의 수식으로 계산하였다.
이론/모형
- 1. Simultaneous analysis used HPLC method. (A) Standard mixture and (B-D) Oryeong-san tablets (ORS-F) are HPLC chromatogram.
- 오령산 정제 제조를 위하여 첨가제의 비율별로 혼합하여 혼합물의 흐름성을 겉보기 밀도, 탭 밀도(Table 4)를 측정하여 Hausner ratio에 의해 평가하였다. Hausmer ratio는 Excellent (1.
- 이 후 LPS를 100 ng/㎖로 처리한 후 24시간 동안 배양하고 배양 상층 액을 실험에 사용하였다. 전 염증성 사이토카인의 염증매개물질은 배양 상층액에서 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)법으로 사용하였으며, 사이토카인 분비측정을 위해 ELISA kit (BD, USA)를 사용하였고, 제조사의 방법에 따라 그 양을 측정하였다. 양성 대조군으로 Dexamethasone을 사용하였다.
성능/효과
- 19) 오령산 정제를 전 처리한 후 LPS를 대식세포에 처리한 군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α와 같은 전염증성 사이토카인 유전자의 발현 및 생성이 억제되어 오령산 정제가 염증 반응 억제에 유효한 반응을 나타냄을 확인하였다.
- 24) 대식세포에서 LPS 자극은 iNOS의 발현으로 다량의 NO를 생성시켜 대식세포의 종양, 박테리아 파괴능력과 같은 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 24) 또한, PGE2는 COX-2에 의해 형성되어 염증반응에 중요한 역할을 하게 되며, 혈관 생성을 유도로 종양 생성에 기여한다.25) 이러한 다양한 염증 질환 및 병리학적 상태에 관여하는 염증매개인자들은 오령산 정제를 전 처리한 후 LPS로 대식세포를 자극하였을 때 개선되었음을 확인하였다.
- DPPH 라디칼 소거능에서 ORS-F의 EC50값은 396.69 ㎍/㎖이고, 대조군으로 사용한 BHA의 EC50값은18.31 ㎍/㎖로 ORS-F가 대조군과 비교하였을 때 약 22배 낮은 라디칼 소거능을 보였고, ABTS 라디칼 소거능에서 ORS-F의 EC50값은 277.99 ㎍/㎖, BHA 의 EC50값은 19.68 ㎍/㎖으로 약 14배 낮은 라디칼 소거능을 보였다(Fig. 2). 또한 ORS-F의 총 폴리페놀 함량은 10.
- 또한 오령산 정제의 첨가제 혼합비에 따른 경도, 마손도 및 붕해도를 측정한 결과는 Table 4와 같다. F1~F4 혼합물의 Hausner ratio 값은 각각 1.16, 1.15, 1.15 및 1.15로 흐름성은 모두 우수한 것으로 나타났으며, 제조된 정제의 경도는 21.44, 15.77, 8.56 및 11.42 KP로 F3을 제외한 정제에서 10 KP 이상의 경도를 보여주었다. 붕해도 측정결과 F3과 F4에서의 15분 이내에 모두 붕해되는 것으로 나타났다.
- 7 세포에서의 염증반응 유도로 인한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 및 생성이 증가되었고, ORS-F에 의해 농도의존적으로 이들 사이토카인의 발현 및 생성을 억제시켰다. IL-1β의 생성과 유전자 발현 또한 ORS-F 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 나타내었고, 200 ㎍/㎖에서 급격한 유전자 발현 억제 효과를 나타내었다. IL-6의 생성은 ORS-F 200 ㎍/㎖에서 DEX보다 뛰어난 억제율을 나타내었으며, 유전자 발현에서는 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 확인하였다.
- IL-1β의 생성과 유전자 발현 또한 ORS-F 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 나타내었고, 200 ㎍/㎖에서 급격한 유전자 발현 억제 효과를 나타내었다. IL-6의 생성은 ORS-F 200 ㎍/㎖에서 DEX보다 뛰어난 억제율을 나타내었으며, 유전자 발현에서는 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 확인하였다. TNF-α의 생성과 유전자 발현의 경우 ORS-F 100 ㎍/㎖에서 DEX 와 유사한 억제율을 나타냄을 확인하였다.
- -1 β, IL-6에 대한 유전자 발현(Fig 4A) 및 생성(Fig 4B) 억제 효과를 확인하였다. LPS를 처리한 RAW264.7 세포에서의 염증반응 유도로 인한 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현 및 생성이 증가되었고, ORS-F에 의해 농도의존적으로 이들 사이토카인의 발현 및 생성을 억제시켰다. IL-1β의 생성과 유전자 발현 또한 ORS-F 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 나타내었고, 200 ㎍/㎖에서 급격한 유전자 발현 억제 효과를 나타내었다.
- 그 결과 ORS-F는 농도 의존적으로 NO (Fig 3A)와 PGE2 (Fig 3B)의 생성을 억제하였으며, 대조군 DEX보다 더 높은 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다. NO와 PGE2의 생성을 유도하는 iNOS와 COX-2의 발현억제를 확인하기 위해 RT-PCR 기법을 사용하여 단백질과 유전자 발현을 조사한 결과 ORS-F는 NO와 PGE2의 생성과 유사하게 iNOS, COX-2의 단백질과 유전자 발현 모두 농도 의존적으로 억제하였다(Fig 3C and D).
- 05% phosphric acid를 첨가함으로써 분리능을 높였으며, 각 지표물질의 최대흡수 파장을 검토한 결과, atractylenoide Ⅲ, alisol B-23-acetate는 210 ㎚, coumarin, polyporusterone B, cinnamic acid, polyporusterone A는 254 ㎚, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, cinnamaldehyde는 280 ㎚를 최적분석파장으로 설정하였다. ORS-F와 표준액 8종 피크의 UV spectrum 탐색 결과, 모두 동일 스펙트럼으로 각기 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리됨을 확인하였다.
- IL-6의 생성은 ORS-F 200 ㎍/㎖에서 DEX보다 뛰어난 억제율을 나타내었으며, 유전자 발현에서는 100 ㎍/㎖에서 DEX와 유사한 억제율을 확인하였다. TNF-α의 생성과 유전자 발현의 경우 ORS-F 100 ㎍/㎖에서 DEX 와 유사한 억제율을 나타냄을 확인하였다.
- 7 세포에 약물을 처리하고 LPS를 처리하여 약물의 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 발현 억제를 통한 NO 및 PGE2 생성억제 효과를 확인하였다. 그 결과 ORS-F는 농도 의존적으로 NO (Fig 3A)와 PGE2 (Fig 3B)의 생성을 억제하였으며, 대조군 DEX보다 더 높은 억제율을 나타내는 것으로 확인되었다. NO와 PGE2의 생성을 유도하는 iNOS와 COX-2의 발현억제를 확인하기 위해 RT-PCR 기법을 사용하여 단백질과 유전자 발현을 조사한 결과 ORS-F는 NO와 PGE2의 생성과 유사하게 iNOS, COX-2의 단백질과 유전자 발현 모두 농도 의존적으로 억제하였다(Fig 3C and D).
- 2). 또한 ORS-F의 총 폴리페놀 함량은 10.20±0.09 ㎍/㎎, 플라보노이드 함량은 12.86±0.86 ㎍/㎎으로 확인되었다(Table 5).
- 1). 이동상인 water와 acetonitrile에 0.05% phosphric acid를 첨가함으로써 분리능을 높였으며, 각 지표물질의 최대흡수 파장을 검토한 결과, atractylenoide Ⅲ, alisol B-23-acetate는 210 ㎚, coumarin, polyporusterone B, cinnamic acid, polyporusterone A는 254 ㎚, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, cinnamaldehyde는 280 ㎚를 최적분석파장으로 설정하였다. ORS-F와 표준액 8종 피크의 UV spectrum 탐색 결과, 모두 동일 스펙트럼으로 각기 다른 성분들의 피크에 간섭 없이 분리됨을 확인하였다.
후속연구
- 이에 오령산을 기존의 탕액보다 보관 및 복용 편의성이 높은 현대적인 제형인 정제로 개발하였으며, 오령산 정제의 주요성분 및 활성을 확인하였다. 본 연구의 결과를 통해서 얻어진 오령산의 주요성분에 대한 동시분석법과 활성평가 결과는 한약제제에 대한 제형개발과 표준화 연구를 위한 기초자료로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
- 오령산의 주요성분인 atractylenolide Ⅲ, coumarin, cinnamic acid, cinnamaldehyde, 3, 4-dihydroxybenzaldehyde, polyporusterone A, polyporusterone B 및 alisol B 23-acetaterk 8종의 분석을 위해 HPLC-PDA를 이용하여 다른 성분들에 영향을 주지 않으면서 동시에 효과적으로 확인할 수 있는 동시 분석법을 확립하였다. 오령산의 주요성분 동시분석법은 기존 지표 성분들을 개별적으로 분석하는 것보다 효율적으로 분석이 가능하여 품질관리를 위한 기초자료로 사용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 억제하였다. 이상의 결과로 개발 제형인 오령산 정제(ORS-F)의 주요성분에 대한 동시분석법과 항염증 효과는 다양한 처방의 한약제제에 대한 제형개발 및 품질관리를 위한 연구에 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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