[논문]LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포주에서 내소황련탕(內疎黃連湯)의 항염증 기전 및 항산화 효능 연구

전선홍; 김태준; 김용민

doi:10.6114/jkood.2020.33.2.100

LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포주에서 내소황련탕(內疎黃連湯)의 항염증 기전 및 항산화 효능 연구
Anti-inflammatory mechanism and Anti-oxidant Effects of Naesohwangryun-tang in LPS-Stimulated RAW 264.7 Macrophage Cells 원문보기

韓方眼耳鼻咽喉皮膚科學會誌 = The journal of Korean Medicine Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology, v.33 no.2, 2020년, pp.100 - 111

전선홍 (세명대학교 화장품학과) , 김태준 (세명대학교 한의과대학 한방안이비인후피부과) , 김용민 (세명대학교 화장품학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : The aim of experiment is to examine anti-inflammatory effect and anti-oxidant effect of Naesohwangryun-tang (NSHRT) in LPS-stimulated RAW264.7 macrophage cells. Methods : In the present study, The cell viability was performed by MTT assay. Nitric oxide (NO) production and prostaglandin E2 (PGE2) synthesis were performed by NO assay and ELISA KIT. The anti-oxidant effect was performed by DPPH and ABTS radical scavenging activity. The inhibitory effects of pro-inflammatory mediators and cytokines were confirmed by realtime PCR and western blotting. Results : NSHRT was no cytotoxicity at treated group. NO and PGE2 production were inhibited compared to the LPS treated group and also mRNA and protein expressions were significantly decreased compared to the LPS treated group. Conclusions : According to the above experiments, we confirmed that NSHRT has anti-inflammatory and anti-oxidant effects. It is suggested that NSHRT is potential ingredient of skin diseases.

주제어

표/그림 (8)

표 Table 1. Contents of NSHRT
표 Table 2. Gene Name and Assay ID Number in Real-time PCR Analysis
그림 Fig. 1. The Effects of NSHRT on Cell Viability in RAW 264.7 Macrophage Cells.
그림 Fig. 2. The Effects of NSHRT on NO Production in LPS-induced RAW264.7 Macrophage Cells.
그림 Fig. 3. The Effects of NSHRT on PGE2 Synthesis in LPS-induced RAW264.7 Macrophage Cells.
그림 Fig. 4. The Effects of NSHRT on DPPH and ABTS Radical Scavenging.
그림 Fig. 5. Effect of NSHRT on LPS-induced iNOS, COX-2, TNF-α, IL-6 and IL-1β, mRNA Expressions in RAW 264.7 Macrophage Cells.
그림 Fig. 6. Inhibition of iNOS, COX-2, MAPKs (ERK, JNK, P38) Protein Expressions of NSHRT by Western Blotting in LPS-induced RAW 264.7 Macrophage Cells.

AI 본문요약
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문제 정의

MAPKs는 ERK, JNK, P38로 이루어져있으며, ERK 및 P38은 IL-1β 방출에 관여하고, P38은 TNF-α, IL-6 방출에 관여하고, JNK는 iNOS, COX-2 발현에 관여한다³¹⁾. 따라서 본 연구에서 LPS로 유도된 대식세포에서 NSHRT의 항염증 기전 및 항산화 효과를 평가하였다. NSHRT의 세포 독성을 파악하고자 MTT assay를 진행하였고 62.
본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 NSHRT의 항염증 기전 및 항산화 효과를 연구하였으며, 다음과 같은 결론을 얻었다.
이 있으나, 항염 효과와 항염증의 기전에 대한 연구는 미비한 실정이었다. 이에 본 연구는 LPS로 유도된 RAW264.7 cells에서 열수 추출된 NSHRT의 항염증 효과 및 기전과 항산화 효과를 평가하였다.
NSHRT에 대해 지금까지의 국내연구동향은 staphylococcus aureus 등에 대한 항균효과에 대한 천 등⁹⁾, 항산화, 항암, 항균에 대한 안 등¹⁰⁾, LPS로 염증을 유발한 흰쥐의 혈액에서 WBC count, IL-6 감소를 통한 소염에 대한 안 등¹¹⁾이 있으나, 항염증 기전에 관한 연구는 미비한 실정이다. 하지만 본원 외래에서 구내염을 호소하는 환자들에게 사용하여 증상 개선이 있었던 1-2례를 바탕으로 이 처방에 대한 항염의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것을 인지하였고, 이에 본 연구에서는 LPS로 유도된 RAW264.7 대식세포에서 NSHRT의 항염증 기전 및 염증반응에서 생성되는 자유기의 소거능을 밝히고자 한다.

제안 방법

7 대식세포에서 NSHRT의 항염증 및 항산화 관련 유전자들의 단백질 발현 수준을 확인하기 위해 1×10⁶ cells/well로 6 well-plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 24시간 후 상등액을 걷어내고 LPS (1㎍/㎖)와 농도 별 NSHRT (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)를 처리하고 24시간 배양하였다. 상등액을 걷어내고 PBS로 2-3회 세척 후 Halt™ Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail kit (Thermo fisher, USA)를 첨가한 RIPA Lysis and Extraction Buffer (Thermo fisher, USA)로 세포를 용해시켰다.
DPPH 소거능은 각각의 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 소거능을 나타내었으며, 대조군으로 Ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였다. 각각의 농도별(62.
NSHRT의 PGE₂ 생성을 측정하기 위해 ELISA kit (abcam, UK)를 사용하여 측정하였다. RAW 264.
이 결과 LPS로 유도된 대식세포에서 NSHRT의 항염증 효과를 확인했으며, MAPKs 신호 전달 경로를 통해 염증 반응을 억제하는 것으로 밝혀냈다. NSHRT의 추가 적인 효능 확인을 위해 대표적 항산화 실험인 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 실시했으며. 항염증에서 설정된 농도에서 radical 소거능을 확인했다.
NSHRT의 항산화 효과를 측정하기 위해 ABTS radical 소거능을 측정하였다. 양이온 형성을 위해 7mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt 와 2.
NSHRT의 항산화 효과를 측정하기 위해 DPPH radical 소거능을 측정하였다. 메탄올과 증류수를 동일한 비율로 섞은 용액을 용매로 사용하여 250μM의 DPPH용액과 농도별 NSHRT를 (62.
NSHRT의 항산화 효능을 확인하기 위해 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 측정하였다.
RAW 264.7 세포에서 염증성 지표인 nitric oxide (NO)의 함량을 측정하기 위해 LPS (1㎍/㎖)와 농도별 NSHRT를 (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 처리하고 24 시간 배양하였다. 이후 Griess reagent (Sigma, USA)와 상층액을 동일한 비율로 하여 상온에서 반응시키고 spectrophotometer를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
Trizol reagent (Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였고, diethylpyrocarbonate (DEPC treated-water; Sigma, USA)로 용해하고 정량하였다. cDNA 합성 kit (Revetra ACE-A-;Toyobo, Japan)를 사용해 정량된 RNA를 cDNA로 합성 후 Tagman master mix (Thermo-fisher, USA) 10㎕, 멸균수 4 ㎕, primer 1㎕, cDNA 5㎕를 혼합하여 실시간으로 중합반응을 수행하였다.
Gel을 membrane으로 transfer하고 5%의 skim milk로 50분-1시간동안 blocking한 후 1차 항체와 over night하였다. 그 후 Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBST)로 5분 단위로 3회 반복 세척한 후 2차 항체와 2시간동안 반응 시킨 다음 단백질 발현을 확인하였다.
5). 또한 단백질 발현정도를 확인하고자, 상위 신호전달 경로인 MAPKs (ERK, JNK, P38)의 인산화 정도를 확인했으며, NSHRT의 62.5-500㎍/㎖ 농도에서 인산화 억제능을 확인했다. 이 결과 LPS로 유도된 대식세포에서 NSHRT의 항염증 효과를 확인했으며, MAPKs 신호 전달 경로를 통해 염증 반응을 억제하는 것으로 밝혀냈다.
메탄올과 증류수를 동일한 비율로 섞은 용액을 용매로 사용하여 250μM의 DPPH용액과 농도별 NSHRT를 (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 제조하고 96well-plate에 250μM DPPH 용액과 농도별 NSHRT (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)를 동일한 비율로 혼합하고 spectrophotometer를 이용하여 517㎚에서 흡광도를 측정하였다.
NSHRT 처방의 구성약재들은 ㈜HMAX(제천, 한국)에서 구입하였으며, 처방된 약재들의 구성비는 아래의 표에 표기하였다(Table 1). 배합된 약재 192g과 3차 증류수 2000㎖를 heating mantle(MS-DM607, M-TOPS, Korea)을 이용하여 100℃에서 4시간동안 환류 추출하였다. 추출물을 2회에 걸쳐 여과 후 감압농축기(CH-9230 Flawil 1, BUCHI Switzerland)로 농축시켜 100㎖의 농축액을 얻었으며, 동결건조를 위해 초저온냉동고에 보관 후 동결건조기를 이용하여 동결건조를 시켰다.
1). 세포 독성이 없는 농도에서 실험을 진행하여 염증성 매개인자인 NO와 PGE₂ 생성량을 확인 했으며(Fig. 2, 3), pro-inflammatory cytokines 및 iNOS ,COX-2의 유전자 발현을 확인하였다(Fig. 5). 또한 단백질 발현정도를 확인하고자, 상위 신호전달 경로인 MAPKs (ERK, JNK, P38)의 인산화 정도를 확인했으며, NSHRT의 62.
NSHRT의 항산화 효과를 측정하기 위해 ABTS radical 소거능을 측정하였다. 양이온 형성을 위해 7mM 2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt 와 2.45mM potassium persulfate를 혼합하고 빛을 차단한 조건에서 24시간 반응시켰다. 이후 ABTS의 흡광도 값이 0.
5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Bio basic, Canada)를 처리하고 4시간 반응시켰으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Bio basic, Canada)를 넣고 반응시킨 후 spectrophotometer (Synergy HT, bio-TEK, USA)를 이용하여 570㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
45mM potassium persulfate를 혼합하고 빛을 차단한 조건에서 24시간 반응시켰다. 이후 ABTS의 흡광도 값이 0.7-0.8 사이의 값이 되도록 맞추고 농도별 NSHRT (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)를 제조하여 ABTS 용액 100㎕와 농도별 시료를 20㎕를 빛이 차단된 상온에서 30분간 반응시킨 후 spectrophotometer를 이용하여 734㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 처리하고 24 시간 배양하였다. 이후 Griess reagent (Sigma, USA)와 상층액을 동일한 비율로 하여 상온에서 반응시키고 spectrophotometer를 이용하여 540㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
7 대식세포에서 NSHRT의 항염증 관련 유전자들의 mRNA 발현 수준을 확인하기 위해 5×10⁵ cells/well 농도로 6 well-plate에 분주하고 37℃, 5% CO₂ incubator에서 24시간 배양하였다. 이후 상등액을 걷어내고 NSHRT를 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 처리하고 다시 24시간 반응시켰다. Trizol reagent (Ambion, USA)를 사용하여 RNA를 추출하였고, diethylpyrocarbonate (DEPC treated-water; Sigma, USA)로 용해하고 정량하였다.
7 세포를 96 well plate에 7×10⁴ cells/well로 분주하고 37℃, 5% CO₂ 조건의 배양기에서 24시간 배양하였다. 이후 상층액을 걷어내고 NSHRT를 농도별로 (62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT; Bio basic, Canada)를 처리하고 4시간 반응시켰으며, dimethyl sulfoxide (DMSO, Bio basic, Canada)를 넣고 반응시킨 후 spectrophotometer (Synergy HT, bio-TEK, USA)를 이용하여 570㎚에서 흡광도 측정을 하였다.
5, 125, 250 및 500㎍/㎖) 처리하고 24시간 반응시켰다. 이후 상층액을 수집하여 원심 분리 후 ELISA kit의 방법대로 진행하였으며, 최종적으로 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
그 후 20분간 4℃, 12000$rpm$의 조건으로 원심 분리하고 단백질을 얻었다. 추출된 단백질을 BCA assay (Thermo fisher, USA)로 정량 하였고, 정량된 단백질을 10% polyacrylamide gel에 loading하고 전기영동 시켰다. Gel을 membrane으로 transfer하고 5%의 skim milk로 50분-1시간동안 blocking한 후 1차 항체와 over night하였다.
배합된 약재 192g과 3차 증류수 2000㎖를 heating mantle(MS-DM607, M-TOPS, Korea)을 이용하여 100℃에서 4시간동안 환류 추출하였다. 추출물을 2회에 걸쳐 여과 후 감압농축기(CH-9230 Flawil 1, BUCHI Switzerland)로 농축시켜 100㎖의 농축액을 얻었으며, 동결건조를 위해 초저온냉동고에 보관 후 동결건조기를 이용하여 동결건조를 시켰다. 동결건조 후 건조 분말은 40g을 얻었으며, 수율은 20.
NSHRT의 추가 적인 효능 확인을 위해 대표적 항산화 실험인 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 실시했으며. 항염증에서 설정된 농도에서 radical 소거능을 확인했다.

대상 데이터

NSHRT 처방의 구성약재들은 ㈜HMAX(제천, 한국)에서 구입하였으며, 처방된 약재들의 구성비는 아래의 표에 표기하였다(Table 1). 배합된 약재 192g과 3차 증류수 2000㎖를 heating mantle(MS-DM607, M-TOPS, Korea)을 이용하여 100℃에서 4시간동안 환류 추출하였다.
대조군으로 200μM Ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였다.
본 연구에서는 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, USA)에서 구입한 RAW 264.7 마우스 대식세포를 사용하였으며, 1% Penicillin/Streptomycin (Gen DEPOT, USA)과 10% fetal bovine serum (FBS; GenDEPOT, USA)을 함유한 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gen DEPOT, USA) 배양액에서 37℃, 5% CO2 조건의 배양기로 배양하였다.

데이터처리

Student t-test를 통하여 비교 분석하였으며, 모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다.

이론/모형

NSHRT의 세포 독성을 측정하기 위해 MTT assay를 실시하였다. RAW 264.

성능/효과

1. NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 농도에 따른 생존율을 확인한 결과, (62.5-500㎍/㎖)에서 독성이 없음을 확인하였다.
2. NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 NO 및 PGE2 생성 저해 효과를 확인한 결과, 농도 의존적으로 저해함을 확인하였다.
3. NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 iNOS, COX-2 및 pro-inflammatory cytokine(IL-6, IL-1β, TNF-α)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과, TNF-α는 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며, TNF-α를 제외한 나머지 인자들은 농도 의존적으로 감소하였다.
4. NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 protein 발현을 확인한 결과, iNOS, COX-2는 농도 의존적으로 감소하였으며, MAPKs (ERK, JNK, P38)의 인산화 또한 유의적으로 감소하였다.
5. NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 항산화 실험 결과, DPPH 및 ABTS radical 소거능 평가에서 농도 의존적으로 radical 소거능이 있음을 확인하였다.
NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 NO 생성 저해 효과를 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 확인한 결과, 대조군의 값은 98.46±3.79%로 나타났으며 LPS만 처리한 군은 812.05±4.96%로 나타나 NO생성량이 상당히 많은 것을 확인했으며, NSHRT을 농도 별로 처리한 군에서는 741.74±5.46%, 657.38± 3.08%, 392.54±5.08%, 202.03±19%로 나타나 LPS 처리군에 비하여 농도 의존적으로 저해됨을 확인 하였다(Fig. 2).
NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 PGE2 생성 저해 효과를 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 확인한 결과, 대조군의 값은 52.02±0.5%로 나타났으며 LPS만 처리한 군은 100으로 나타나 PGE2 생성량이 상당히 많은 것을 확인했다.
NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 iNOS, COX-2 및 pro-inflammatory cytokine (IL-6, IL-1β, TNFα)의 mRNA 발현 수준을 확인한 결과, LPS 처리군과 비교하였을 때 TNF-α는 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였으며, TNF-α를 제외한 나머지 인자들은 농도 의존적으로 감소하였다.
NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 iNOS, COX-2 및 pro-inflammatory cytokine (IL-6, IL-1β, TNFα)의 protein 발현 수준을 확인한 결과, iNOS와 COX-2는 농도가 증가함에 따라 유의적으로 감소하였으며, 상위 신호전달 경로인 MAPKs (ERK, JNK, P38) 의 인산화는 유의성 있게 감소하였다.
NSHRT에 대한 RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 확인한 결과, 처리한 농도(62.5-500㎍/㎖)에서 독성이 없음을 확인 하였다. 이때의 세포 생존율은 각각 102.
NSHRT을 농도별로 처리한 군에서는 86.74±1.75%, 80.80±1.88%, 66.37± 1.99%, 50.80±2.3%로 나타나 LPS 처리군에 비하여 농도 의존적으로 저해됨을 확인하였다(Fig. 3).
5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 소거능을 나타내었으며, 대조군으로 Ascorbic acid (Sigma, USA)를 사용하였다. 각각의 농도별(62.5, 125, 250 및 500㎍/㎖)로 처리했을 때, DPPH 소거능은 각각 18%, 39%, 56%, 59%의 radical 소거능을 나타냈으며, ABTS 소거능은 각각 5%, 15%, 24%, 35%의 radical 소거능을 나타내었다.(Fig.
5-500㎍/㎖ 농도에서 인산화 억제능을 확인했다. 이 결과 LPS로 유도된 대식세포에서 NSHRT의 항염증 효과를 확인했으며, MAPKs 신호 전달 경로를 통해 염증 반응을 억제하는 것으로 밝혀냈다. NSHRT의 추가 적인 효능 확인을 위해 대표적 항산화 실험인 DPPH 및 ABTS radical 소거능을 실시했으며.

후속연구

이러한 NSHRT의 염증 억제효과는 아토피피부염 등을 포함한 다양한 염증성 피부 질환에 대한 치료 소재로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 본 연구에서는 NSHRT가 어떠한 기전으로 항산화 효과를 내는 지에 대해서는 밝히지 못하였기에, 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.
이러한 NSHRT의 염증 억제효과는 아토피피부염 등을 포함한 다양한 염증성 피부 질환에 대한 치료 소재로서 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 하지만 본 연구에서는 NSHRT가 어떠한 기전으로 항산화 효과를 내는 지에 대해서는 밝히지 못하였기에, 향후 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	활성화된 대식세포는 체내 유입된 염증의 원인을 인식하여 어떤 물질을 생성하는가?	과도한 염증 반응 시 면역을 담당하는 세포가 활성화되는데, 대표적으로 대식세포가 있다1). 대식세포는 동물 체내 모든 조직에 분포하며 침입한 세균 등을 잡아 소화시키고, 활성화 된 대식세포는 체내 유입된 염증의 원인을 인식해 prostaglandin (PG), nitric oxide (NO)와 같은 염증 매개체 및 tumor necrosis factor-α (TNF-α), Inter-leukin-1β (IL-1β), Inter-leukin-6 (IL-6)와 같은 pro-inflammatory cytokines 등의 염증 매개물 질을 생성한다. 이 때, 대식세포는 다른 면역 세포들의 활성화를 유도하고 그에 따른 염증원인을 제거하고 복구하는 조절자 역할을 한다2).
	염증반응은 무엇인가?	염증반응은 외부의 물리적 자극이나 화학적으로 유해한 물질 등에 의해 발생되는 조직 손상에 대한 방어반응으로, 생체내의 세포 및 조직이 외부에서 받은 자극을 국소화시켜 손상된 부위를 정상적으로 회복하고 유지하려는 생체의 방어기전이다. 주로 통증, 발열, 기능 상실 등과 증상이 나타난다.
	염증반응에 의해 주로 나타나는 증상에는 어떤 것들이 있는가?	염증반응은 외부의 물리적 자극이나 화학적으로 유해한 물질 등에 의해 발생되는 조직 손상에 대한 방어반응으로, 생체내의 세포 및 조직이 외부에서 받은 자극을 국소화시켜 손상된 부위를 정상적으로 회복하고 유지하려는 생체의 방어기전이다. 주로 통증, 발열, 기능 상실 등과 증상이 나타난다. 과도한 염증 반응 시 면역을 담당하는 세포가 활성화되는데, 대표적으로 대식세포가 있다1).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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