[논문]블루베리 열수 추출물의 근아세포의 근분화에 미치는 영향

최영수; 김은미; 최선경; 이웅희; 한효상; 김기광

doi:10.6116/kjh.2020.35.3.25.

블루베리 열수 추출물의 근아세포의 근분화에 미치는 영향
Investigation of the effect of Blueberry hydrothermal extracts on myoblast differentiation 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.35 no.3, 2020년, pp.25 - 32

최영수 (충남대학교 생화학과) , 김은미 (안전성평가연구소 예측독성연구본부) , 최선경 (충남대학교 생화학과) , 이웅희 (충남대학교 생물공학연구소) , 한효상 (중부대학교 보건행정학과) , 김기광 (충남대학교 생화학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : At present, aging-related degenerative muscle diseases are considered a serious problem. However, the effects on muscles regarding the efficacy of blueberry have not been studied. In this study, we tried to find out the correlation between blueberry and muscle. Methods : 2,2'-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid (ABTS) assay was performed to confirm the antioxidant efficacy of blueberry hydrothermal extract. To determine the effect of blueberry hydrothermal extracts (BHE) on myoblast activity, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay was performed. To confirm the effect of blueberry hydrothermal extracts on the differentiation of myoblast into myotubes, protein expression levels of myosin heavy chain 3 (Myh3) and paired box 3/7 (pax3/7) were confirmed by immunoblot analysis. In addition, immunofluorescence microscopy was performed to confirm the effect on myotube formation of blueberry hydrothermal extracts. Results : Antioxidative efficacy and low toxicity were confirmed through ABTS assay and MTS assay of blueberry extract for myoblasts. As a result of immunoblot analysis and immunofluorescence analysis, the decrease in myogenic marker Pax3/7 was not confirmed, but myotubes The specific expression inhibitory activity of the forming protein Myh3 was confirmed. Through this, it was confirmed that the blueberry extract has a negative activity against myoblast differentiation. Conclusion : This experiment confirmed that blueberry hydrothermal extract has excellent antioxidant efficacy and negative results in inhibiting the differentiation and proliferation of myoblast. This requires deep study of certain ingredients and requires reassessment of the dietary intake of blueberries.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig. 1. Free radical scavenging activities of the resveratrol and BHE by ABTS assay.
그림 Fig. 2. Cytotoxicity of BHE on myoblasts.
그림 Fig. 2. Cytotoxicity of BHE on myoblasts.
그림 Fig. 4. Effect of BHE on the myotube formation.

AI 본문요약
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문제 정의

이에 본 연구는 블루베리 열수 추출물 (blueberry hydrothermal extract, BHE)을 이용하여 근세포의 분화와 증식에 미치는 영향과 근아세포의 분화와 활성에 있어서 유의미한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.

제안 방법

1. Resveratrol 대비 블루베리 열수 추출물의 농도 의존적ROS 제거능을 ABTS assay를 통해 항산화 효능을 확인하였다.
2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) (ABTS) assay의 수행을 통해 블루베리 추출물의 ROS 제거 효능을 확인하였다. 항산화 활성이 잘 알려진resveratrol을 양성 대조군 (positive control)로 사용하여 25, 50, 100 μM에서 각각 63.
앞선 실험에서 블루베리 추출물의 높은 항산화 효능과 세포활성도 실험 결과를 토대로 블루베리 추출물의 근아세포(myoblast)의 근관세포 (myotube)로의 분화 과정에 있어서의 활성을 확인하고자 Pax3/7과 Myh3 단백질의 발현을 면역블롯을 실시하였다. 근아세포 (myoblast)를 분화 배양 조건에서 48시간 동안 분화를 유도하였으며, 이 과정에 블루베리 추출물을 처리하지 않은 대조군과 농도별로 블루베리 추출물을 처리한 실험군을 면역 블롯 분석을 통하여 근분화 관련 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과 농도별 블루베리 추출물 처리에 의한 Pax3/7의 발현량은 변화가 관찰되지 않았으나, 근관형성에 있어서 가장 중요한 단백질로 알려진 Myh3의 발현량은 대조군에 비해 50 ㎍/㎖에서 82%, 100 ㎍/㎖에서 43% , 200 ㎍/㎖에서 39%로 현저한 농도 의존적 감소가 확인되었다(Fig.
5 ㎍/㎖ fibroblast growth factor(FGF)를 첨가한 growth medium에서 실시하였다. 근아세포 분화는Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM, WELGENE, Korea)에 1% fetal bovine serum (FBS, WELGENE, Korea)과 1% antibiotic antimycotic (WELGENE, Korea;100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin)를 첨가한differentiation medium에서 표준 세포 배양 방법인 37℃, 5% CO₂조건으로 배양하였다.
본 연구에서 블루베리 열수 추출물의 항산화 효능, 근아세포 (myoblast)의 세포활성도와 면역 블롯 분석을 통하여 블루베리 열수 추출물의 처리에 의한 근아세포 (myoblast)의 근분화 마커 단백질의 발현 변화를 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
블루베리 추출물의 Myh3 단백질 발현 억제 활성에 대한 결과를 토대로 근관세포 (myotube) 형성 억제 기능 검증을 시각화하기 위해 면역형광법 (immunofluorescence microscopy)을 이용하여 블루베리 추출물을 200 ㎍/㎖ 처리하여 48시간 배양하였다. 그 결과 블루베리 추출물 없이 분화를 진행한 대조군 근관세포 (myotube)의 형성에서는 예상대로 현저한 Myh3의 단백질 발현 증가 및 근관세포 (myotube)의 특징인 세포융합을 통한 다핵성 (multi-nucleation) 세포가 확인되었고, 실험군은 블루베리 추출물 처리에 의해 Myh3의 단백질 발현이 현저히 감소되었을 뿐만 아니라 다핵성 근관세포(myotube)의 형성이 현저한 저해가 확인되어 근원세포의 근분화를 유도하지 못 하는 것을 확인하였다 (Fig.
근분화를 확인하는 기준은 세포의 융합인 다핵성의 형태와 그 두께를 판단하여 근관세포(myotube)로의 분화 정도를 판단한다²⁶⁾. 블루베리 추출물의 Myh3 단백질 발현 억제 활성을 시각화하기 위해 면역형광법(immunofluorescence microscopy)을 이용하였으며, 근아세포 (myoblast)의 분화유도는 분화배양 조건에서 블루베리 추출물의 200 ㎍/㎖ 농도를 48시간 처리하여 배양하였다. 그결과 블루베리 추출물 없이 분화를 진행한 대조군 (control)에서 근관세포 (myotube)의 형성은 Myh3의 단백질 발현 증가 및 근관세포 (myotube)의 특징인 세포융합을 통한 다핵성(multi-nucleation) 세포가 확인되었다.
블루베리 추출물의 근분화 과정에서의 영향을 확인하기 위하여 블루베리 추출물 처리 최적 농도를 근아세포 (myoblast)에 대한 세포활성도 측정을 MTS assay 수행을 통해 확인하였다. 블루베리 추출물을 근아세포에 36시간 동안 처리한 후 측정된세포 활성도 결과는 100 ㎍/㎖에서 97.
블루베리 추출물이 근분화와 성장에 미치는 영향을 확인하기 이전에 블루베리 추출물 처리 최적 농도를 알기 위해 근아세포(myoblast)에 대한 세포독성 평가는 살아있는 세포의 정량적측정이 가능한 MTS assay 수행을 통해 확인하였다. 근육의 발생과 분화에 있어 중요한 세포인 근아세포 (myoblast)에 블루베리 추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 1,600 μ의 농도에서 36시간 동안 처리한 후 세포활성도의 측정 결과는 1,600 μ까지 91.
Secondary antibody로 Mouse IgG Alexa Fluor 488-conjugated goat antibody(Thermo Fisher scientic, USA)를 사용하였고 45분간 실온에서 반응시켰다. 세포핵은 DAPI로 staining 실시하였으며, LSM 510 Live Configuration Vario Two VRGB confocallaser-scanning microscope(Carl Zeiss, Germany)를 통해 면역 형광 이미지를 얻은 후 분석하였다.
앞선 실험에서 블루베리 추출물의 높은 항산화 효능과 세포활성도 실험 결과를 토대로 블루베리 추출물의 근아세포(myoblast)의 근관세포 (myotube)로의 분화 과정에 있어서의 활성을 확인하고자 Pax3/7과 Myh3 단백질의 발현을 면역블롯을 실시하였다. 근아세포 (myoblast)를 분화 배양 조건에서 48시간 동안 분화를 유도하였으며, 이 과정에 블루베리 추출물을 처리하지 않은 대조군과 농도별로 블루베리 추출물을 처리한 실험군을 면역 블롯 분석을 통하여 근분화 관련 단백질의 발현을 확인하였다.
따라서 이러한 ROS에 의한 질병의 예방을 위해서는 ROS 경감효능을 가지고 있는 항산화 물질의 연구가 매우 중요하다. 이러한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여 블루베리 추출물의 ROS 제거 효능을 ABTS assay를 통하여 실시하였다. ROS 제거 효과가 잘 알려진 resveratrol을 양성 대조군 (positive control)로 사용하였으며, 블루베리 추출물 처리결과는 0.

대상 데이터

근아세포(myoblast)는 생후 3일 된 C57BL/6의 뒷다리 골격근에서 분리하여 배양한 것으로 실험에 사용하였다. 이후 근아세포의 증식은 Ham's F –10 medium에 10% Calf serum, 1% antibiotic antimycotic (100 U/㎖ penicillin, 100 ㎍/㎖ streptomycin), 2.
실험에 사용된 블루베리는 한약 제약 회사 (Jeong-SeongDrugstore, Korea)로부터 2019년 9월에 구매 (NO:2019-0910)하여 기원의 진위와 품질의 우열을 가천대학교 한의과 대학 본초학교실에서 감정하였고, 약재는 ultrasonic cleaner를 이용하여 불순물을 제거하여 실험에 사용하였다.

데이터처리

대조군에 관한 실험군의 유의성은 Student’s t-test를 이용하여 p < 0.05 일 때 유의한 것으로 판단하였다.

이론/모형

블루베리 추출물이 근아세포 활성도에 미치는 영향을 측정하기 위해 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS) assay를 수행하였다. 근아세포를 96 wellplate에 3,000 cells/well로 분주하여 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 동안 배양한 뒤 각각의 well에 농도별 블루베리 추출물을 처리하고 36시간 동안 배양하였다.
항산화 효능은 블루베리 농도 (0.02, 0.2, 2 ㎎/㎖)와 resveratrol 농도(25, 50, 100 μM)에서 ABTS (2,2'-azinobis-3-ethylbenzothi`azoline-6-sulphonic acid) assay를 이용하여 측정하였다. ABTS (sigma, USA) 7 mM 용액과 Potassium persulfate (sigma, USA) 2.

성능/효과

2. MTS assay를 통하여 근아세포 (myoblast)에 블루베리 열수 추출물의 처리하여 수행한 결과 농도에 관계 없이 세포생존률의 변화는 없었으며, 이를 통해 블루베리 열수추출물이 근아세포 (myoblast)의 증식과 세포활성도 변화에 영향이 없음을 확인하였다.
3. 근아세포 (myoblast)의 근분화 단백질의 발현을 확인하기위해 면역 블롯 분석법을 실시한 결과 Pax3/7의 감소는확인할 수 없었으며 근관세포 형성 단백질인 Myh3의특이적 발현 억제 활성을 확인하였다.
4. 면역 블롯 분석의 결과를 토대로 면역형광법을 수행하여 시각화한 결과 근아세포 (myoblast)의 분화에 있어서 분화배양액에서 블루베리 열수 추출물과 함께 48시간동안 처리한 실험군이 블루베리 열수 추출물을 처리하지 않은 대조군에 비해 Myh3의 현저한 감소와 긴 다핵성의근관세포 (myotube)의 형성을 관찰할 수 없음을 확인하였다.
이러한 산화적 스트레스에 미치는 영향을 확인하기 위하여 블루베리 추출물의 ROS 제거 효능을 ABTS assay를 통하여 실시하였다. ROS 제거 효과가 잘 알려진 resveratrol을 양성 대조군 (positive control)로 사용하였으며, 블루베리 추출물 처리결과는 0.02 ㎎/㎖에서 14.7 ± 1.52%, 0.2 ㎎/㎖에서 19.6± 0.60%, 2 ㎎/㎖에서 86.9 ± 0.20%로 농도 의존적인 ABTSradical 소거능을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 통해 블루베리 추출물은 우수한 항산화 효능을 보유한 것을 확인하였다.
근아세포 (myoblast)를 분화 배양 조건에서 48시간 동안 분화를 유도하였으며, 이 과정에 블루베리 추출물을 처리하지 않은 대조군과 농도별로 블루베리 추출물을 처리한 실험군을 면역 블롯 분석을 통하여 근분화 관련 단백질의 발현을 확인하였다. 그 결과 농도별 블루베리 추출물 처리에 의한 Pax3/7의 발현량은 변화가 관찰되지 않았으나, 근관형성에 있어서 가장 중요한 단백질로 알려진 Myh3의 발현량은 대조군에 비해 50 ㎍/㎖에서 82%, 100 ㎍/㎖에서 43% , 200 ㎍/㎖에서 39%로 현저한 농도 의존적 감소가 확인되었다(Fig. 3).
블루베리 추출물의 Myh3 단백질 발현 억제 활성에 대한 결과를 토대로 근관세포 (myotube) 형성 억제 기능 검증을 시각화하기 위해 면역형광법 (immunofluorescence microscopy)을 이용하여 블루베리 추출물을 200 ㎍/㎖ 처리하여 48시간 배양하였다. 그 결과 블루베리 추출물 없이 분화를 진행한 대조군 근관세포 (myotube)의 형성에서는 예상대로 현저한 Myh3의 단백질 발현 증가 및 근관세포 (myotube)의 특징인 세포융합을 통한 다핵성 (multi-nucleation) 세포가 확인되었고, 실험군은 블루베리 추출물 처리에 의해 Myh3의 단백질 발현이 현저히 감소되었을 뿐만 아니라 다핵성 근관세포(myotube)의 형성이 현저한 저해가 확인되어 근원세포의 근분화를 유도하지 못 하는 것을 확인하였다 (Fig. 4).
블루베리 추출물의 Myh3 단백질 발현 억제 활성을 시각화하기 위해 면역형광법(immunofluorescence microscopy)을 이용하였으며, 근아세포 (myoblast)의 분화유도는 분화배양 조건에서 블루베리 추출물의 200 ㎍/㎖ 농도를 48시간 처리하여 배양하였다. 그결과 블루베리 추출물 없이 분화를 진행한 대조군 (control)에서 근관세포 (myotube)의 형성은 Myh3의 단백질 발현 증가 및 근관세포 (myotube)의 특징인 세포융합을 통한 다핵성(multi-nucleation) 세포가 확인되었다. 하지만 블루베리 추출물을 처리하여 분화를 진행한 실험군은 Myh3의 단백질 발현이 현저히 감소되었을 뿐만 아니라 다핵성의 근관세포(myotube)의 형성이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.
이러한 결과들은 블루베리 추출물이 근분화 억제 효과를 가지고 있을 가능성을 말해준다. 그러므로 근감소증에서의 블루베리 추출물은 결과적으로 근아세포 (myoblast)의 분화와 근관세포 (myotube)의 형성을 억제하여 근육의 감소를 촉진 시킬 수 있으므로 근감소증의 예방과 치료에 있어 블루베리의 섭취는 이 질병에서 부정적인 영향을 끼칠 수 있을 것으로 사료된다.
블루베리 추출물이 근분화와 성장에 미치는 영향을 확인하기 이전에 블루베리 추출물 처리 최적 농도를 알기 위해 근아세포(myoblast)에 대한 세포독성 평가는 살아있는 세포의 정량적측정이 가능한 MTS assay 수행을 통해 확인하였다. 근육의 발생과 분화에 있어 중요한 세포인 근아세포 (myoblast)에 블루베리 추출물을 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖, 400 ㎍/㎖, 800 ㎍/㎖, 1,600 μ의 농도에서 36시간 동안 처리한 후 세포활성도의 측정 결과는 1,600 μ까지 91.9±3.67%의 활성도를 나타내 근아세포 (myoblast)의 생존률에 미치는 부정적 영향이 없음을 확인하였다.
62%의 항산화 활성을 확인할 수 있었으며, 이러한 결과를 통해 실험 과정의 신뢰성을 확보할 수 있었다. 블루베리 추출물은 0.02 ㎎/㎖에서 14.7±1.52%, 0.2 ㎎/㎖에서 19.6 ± 0.60%, 2 ㎎/㎖에서 86.9 ± 0.20%로 농도 의존적 ABTS radical 소거능을 확인할 수 있었으며, 이 결과를 통해 블루베리 추출물은 우수한 항산화 효능을 보유한 것을 확인할수 있었다(Fig. 1).
블루베리 추출물의 근분화 과정에서의 영향을 확인하기 위하여 블루베리 추출물 처리 최적 농도를 근아세포 (myoblast)에 대한 세포활성도 측정을 MTS assay 수행을 통해 확인하였다. 블루베리 추출물을 근아세포에 36시간 동안 처리한 후 측정된세포 활성도 결과는 100 ㎍/㎖에서 97.9 ± 2.49%, 200 ㎍/㎖에서 97.0 ± 2.91%, 400 ㎍/㎖에서 93.4 ± 4.99%,800 ㎍/㎖에서 95.7 ± 5.89%, 1,600 ㎍/㎖에서 91.9 ±3.67% 이었다. 이러한 결과는 1,600 ㎍/㎖ 농도까지 블루베리 추출물의 처리는 근아세포의 활성도에 대한 영향이 없음을 확인할 수 있었다 (Fig.
이처럼 근분화에 있어서 Pax3/7, Myh3은 중요한 마커로써 사용된다^23)-28). 블루베리 추출물의 높은 항산화 효능과 세포활성도 실험 결과를 토대로 48시간 동안 근아세포 (myoblast)의 근분화를 유도하여 Pax3/7과 Myh3 단백질의 발현을 확인하기 위해 면역 블롯을실시하였을 때, 농도별 블루베리 추출물 처리에 의한 Pax3/7의 발현량은 변화가 관찰되지 않았으나, 근관세포 (myotube)의 형성에 있어서 가장 중요한 단백질로 알려진 Myh3의 발현량은 대조군 (control)에 비해 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 82%, 43%, 39%로 현저한 농도 의존적 감소를보였다. 이러한 결과는 블루베리 추출물이 근분화 과정에서 Myh3 특이적 발현 억제 활성의 갖고 있고, 블루베리 추출물이 근아세포 (myoblast)의 근관세포 (myotube)로의 근분화 과정에 부정적 활성을 가지고 있을 가능성을 확인하였다.
블루베리 추출물의 높은 항산화 효능과 세포활성도 실험 결과를 토대로 48시간 동안 근아세포 (myoblast)의 근분화를 유도하여 Pax3/7과 Myh3 단백질의 발현을 확인하기 위해 면역 블롯을실시하였을 때, 농도별 블루베리 추출물 처리에 의한 Pax3/7의 발현량은 변화가 관찰되지 않았으나, 근관세포 (myotube)의 형성에 있어서 가장 중요한 단백질로 알려진 Myh3의 발현량은 대조군 (control)에 비해 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖, 200 ㎍/㎖ 농도에서 각각 82%, 43%, 39%로 현저한 농도 의존적 감소를보였다. 이러한 결과는 블루베리 추출물이 근분화 과정에서 Myh3 특이적 발현 억제 활성의 갖고 있고, 블루베리 추출물이 근아세포 (myoblast)의 근관세포 (myotube)로의 근분화 과정에 부정적 활성을 가지고 있을 가능성을 확인하였다.
그결과 블루베리 추출물 없이 분화를 진행한 대조군 (control)에서 근관세포 (myotube)의 형성은 Myh3의 단백질 발현 증가 및 근관세포 (myotube)의 특징인 세포융합을 통한 다핵성(multi-nucleation) 세포가 확인되었다. 하지만 블루베리 추출물을 처리하여 분화를 진행한 실험군은 Myh3의 단백질 발현이 현저히 감소되었을 뿐만 아니라 다핵성의 근관세포(myotube)의 형성이 현저하게 감소되는 것을 확인하였다.

후속연구

이상의 결론을 통합하여, 향후 어떠한 블루베리 열수 추출물의 특정 성분이 노화, 활성산소제거, 근육의 분화와 합성 과정에서의 억제와 근감소증에 대해 유의미한 영향을 주는 것인지에 대하여 깊은 연구가 필요하며, 본 실험의 결과는 블루베리의 섭취가 근분화에 부정적인 영향을 미친다는 가능성을 보여주는 바이다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	블루베리의 효능은 어떠한가?	블루베리는 임상에서 근육회복 시간 단축, 뇌신경의 신호전달 촉진, 시력 회복 유도, 면역력 증강, 심혈관계 질환 예방, 항산화 등에 효능이 있어 주목 받는 천연물으로써 각광받고 있다. 블루베리에는 세포의 산화 유리기를 억제하는 flavonoid 성분인 anthocyanin이 함유되어 있으며 포도의 30배 이상 함유되어 항산화 작용을 한다4-10).
	근감소증의 원인은 무엇인가?	23-27) 근감소증은 근육 내에 근섬유들이 지방으로의 변화되거나 섬유성결합조직(fibrillar connective tissue)가 형성되어 근육이 충분하지 못하게 되어 골격근과 근력 감소가 나타나는 질환이다.39-45) 그 원인으로는 활성산소 (Reactive oxygen species)에 의한 산화적 스트레스, 호르몬 변화, 운동량의 감소, 염증성 사이토카인의 변화, 단백질 섭취 감소 등이 있지만 가장 큰 이유는 노화에 의해 발생한다31,32). 노령화가 계속 진행되면서 근감소증이 유발된 환자들의 가장 큰 불편함은 근 기능의 상실로 인해 신체적인 장애를 유발하거나, 산화적 스트레스로 근 손상을 야기하여 최종적으로 다양한 합병증에 노출되는 것이다.
	근육 형성(myogenesis)이란 무엇인가?	또한 근육의 일부는 자체적으로 호르몬을 분비하고, 근골격에 칼슘 저장을 도와 골밀도의 증가를 유도하여 골다공증을 예방하기도 한다. 근육 형성(myogenesis)은 근아세포(myoblast)의 분화의 진행을 통해 최종적으로 두꺼운 근섬유 다발을 이루는 것을 말한다.15,16) 근아세포는 위성세포(satellite cell)의 Pax3/7 유전자의 발현 조절을 통해 MyoD, MyoG, Myh3 등의 근육의 전사인자들을 차례대로 발현시키며 근분화 과정을 완성한다23-25).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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