[논문]산수유(Cornus officinalis)로부터 혈전용해물질의 확인 및 특성 연구

김준호

doi:10.7732/kjpr.2020.33.4.237

산수유(Cornus officinalis)로부터 혈전용해물질의 확인 및 특성 연구
Identification and Characterization of Fibrinolytic Compound from Cornus officinalis S. et Z 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.33 no.4, 2020년, pp.237 - 244

초록
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산수유 열수추출물의 혈전용해활성을 탐색하고, 유기용매로 분획화한 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획물에서 1.36 plasmin units/mL의 강한 혈전용해활성을 확인하였다. Amberlite IRA-400, Sephadex LH-20 column, active charcoal column과 재결정으로 정제한 혈전용해화합물을 HPLC로 분석 비교한 결과, 표준물질인 malic acid와 같은 retention time (RT)을 나타내고, LC/MS/MS 분석의 Negative mode 측정 시 m/z 133에서 같은 peak를 나타내어 정제한 화합물이 분자량 134 Da인 malic acid 임을 확인하였다. 정제한 화합물은 0.69 plasmin units/mL의 혈전용해활성을 보이고, 14.62%의 트롬빈 저해활성을 나타냈으며, 6.42%의 항산화 효과와 17.28%의 항당뇨 효과를 나타냈다. 분리한 화합물은 섬유소원의 Aα chain, Bβ chain과 반응하지 않았지만 γ chain을 분해하는 것으로 나타났다. 위 연구 결과를 바탕으로 산수유에서 분리한 혈전용해화합물은 혈관계 질환의 치료제 개발과 기능성 식품 개발을 위한 우수한 소재로 이용 가능할 것으로 예상된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The objective of this study was to identify and characterize fibrinolytic compound from Cornus officinalis. Cornus officinalis. Hot water extract was fractionated into hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, and water fractions. Assays for fibrinolytic activity indicated that only the ethyl acetate fraction had significant efficacy at 1.36 plasmin units/mL. Isolation of fibrinolytic compound was carried out on Amberlite IRA-400, Sephadex LH-20 and active charcoal column chromatography. HPLC analysis of the purified fibrinolytic compound showed retention time (RT) same as authentic malic acid. LC / MS / MS in negative mode showed the same peak at m/z 133, confirming that the purified compound was malic acid with a molecular weight 134 Da. The compound showed fibrinolytic activity of 0.69 plasmin units/mL, 14.62% of thrombin inhibitory activity, 6.42% of antioxidative activity, and 17.28% of α-glucosidase inhibitory activity. The purified compound hydrolyzed γ subunits of human fibrinogen. In conclusion, malic acid isolated from Cornus officinalis might have potential to be developed as ingredient for biofunctional foods to prevent cardiovascular diseases.

주제어

표/그림 (8)

$Fig. 1. Fibrinolytic activity of solvent fractions obtained from hot water extract of Cornus officinalis S. et Z by fibrin plate method.$ 그림 Fig. 1. Fibrinolytic activity of solvent fractions obtained from hot water extract of Cornus officinalis S. et Z by fibrin plate method.
그림 Fig. 2. Elution profiles of fibrinolytic compound with Sephadex LH-20 column.
$Table 1. The fraction yields of Cornus officinalis S. et Z extract<sup>z</sup>$ 표 Table 1. The fraction yields of Cornus officinalis S. et Z extract^z
그림 Fig. 3. HPLC profile of the purified fibrinolytic compound and five standard acids.
그림 Fig. 4. LC/MS/MS spectra of the purified fibrinolytic compound (A) and authentic malic acid (B).
그림 Fig. 5. Fibrinolytic activity of various concentrations of the purified fibrinolytic compound.
그림 Fig. 6. Degradation of human fibrinogen by purified fibrinolytic compound.
표 Table 2. Electron donating, thrombin inhibitory, and α- glucosidase inhibitory activities of the purified fibrinolytic compound from hot water extract of cornus officinalis^z

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구는 혈전용해물질을 함유하고 있는 것으로 확인된 산수유를 이용하여 혈전용해제와 기능성 식품을 개발하기 위한 기초 자료를 확보하기 위해 산수유 열수추출물을 유기 용매로분획화하고, column chromatography를 이용하여 정제 후 HPLC와 LC/MS 분석을 통해 동정한 혈전용해화합물의 혈전용해활성, 트롬빈 저해활성, 항산화활성, 항당뇨 효과를 측정하고, 그 결과를 제시하고자 한다.

제안 방법

8 mL/min로 사용하였다. Malic acid의 동정은 준비한 시료와 산수유에 포함되어 있는 것으로 알려진 5가지 유기산 표준물질(10 ㎎/mL) 용액의 HPLC 결과와 비교하고, 준비한 시료와 표준물질인 malic acid 용액의 LC/MS/MS 분석 결과와 비교하여 동정하였다. LC/MS/MS 분석은 기초과학 지원 연구소의 Agilent사의 LC/Q-TOF Mass Spectrometer로 UHPLC/1290 infinity (Agilent)와 MS Q-TOF/ G6550A(Agilent)로 구성되어 있고, 사용한 HPLC column은 Agilent EclipsePlusC18 RRHD (50 ㎜ × 2.
산수유로부터 분리한 혈전용해화합물의 섬유소원 분해과정을 확인하기 위해, 분리한 화합물(1 ㎎/mL)과 섬유소원(2 ㎎/mL)를 36℃에서 4시간 반응시킨 후 반응액을 취하여 4.5%의 stacking gel과 7.5% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis로 이루어진 SDS-PAGE에서 전기영동을 하여 섬유소원의 분해과정을 분석하였다.
6 mL을 가하여 6 mL이 되도록 하였다. 이 혼합액을 4분간 반응시키고 다시 여과한 다음, 총 반응시간이 10분이 되면 525 ㎚에서 흡광도를 측정하였다(UV-1201; Shimadzu). 전자공여능은 다음 식에 의해 산출하였다.

대상 데이터

본 실험에 사용한 산수유는 국내산으로 제천약초시장에서(자연인; 경북 영천 생산지) 구입하여 사용하였으며, 생리활성 측정에 사용한 fibrinogen, plasmin, thrombin, 1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl (DPPH), α-glucosidase, p-nitrophenylα-D-glucopyranoside, Amberlite IRA-400 chloride form, Sephadex LH-20, malic acid, gallic acid는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO. USA)에서 구입하였고, H-D-phenyl-alanineL-pipecolyl-L-arginine-paranitroaniline dihydrochloride는 Chromogenix (Orangeburg, NY, USA)에서 구입하였으며, 그 밖의 시약은 모두 일등급 제품을 사용하였다.

데이터처리

3회 반복 실험을 통하여 얻은 결과는 mean ± SD로 나타내었으며, 각 실험군 간의 통계학적 분석은 Student t-test를 실시하여 유의한 결과를 얻었다(p ＜ 0.05).

이론/모형

Haverkate and Trass (1974)의 fibrin plate법에 따라 2% gelatin 용액에 녹인 0.5%(w/v) fibrinogen 용액 10 mL와 0.05 M barbital buffer (pH 7.5)에 녹인 thrombin (100 NIH units) 50 μL를 잘섞고 petri dish에 부어 fibrin 막을 만들었다. 준비한 물 분획물과 유기용매 분획물 20 μL을 fibrin plate 위에 점적하고 36℃에서 18시간 방치한 후 용해면적을 측정하였으며, 대조구로는 플라스민(1.
α-glucosidase에 대한 저해활성은 Watanabe et al. (1997)의 실험 방법을 이용하였다. 즉, 100 mM phosphate buffer (pH 7.
트롬빈에 대한 저해활성은 Doljak et al. (2001)의 실험 방법을 이용하였다. 즉, 10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.

성능/효과

, 2004). Doljak et al. (2001)의 방법에 따라 산수유로부터 분리한 화합물(10 ㎎/mL)의 트롬빈 저해활성을 측정한 결과 14.62%의 트롬빈 저해효과를 나타냈는데(Table 2), 이는 황기와 산사 열수 추출물의 트롬빈 저해활성인 32.33%와 78.73%에 비해 상대적으로 작은 활성이었다(Kim, 2012).
ESI/Ion Trap MS를 Negative와 Positive mode로 분석하여 [M-H]- 값과 [M+Na]⁺값을 확인하였다. Negative mode로 분석할때 양성자(proton) 하나가 빠진 형태의 molecular ion인 m/z 133에서 강한 peak가 관측되어 분자량 134인 malic acid로 추정되었으며(Fig. 3), Positive mode로 분석할 경우 분자에 Na⁺ 이온이 붙을수 있어 분자량이 M+Na⁺[M-Na⁺(23)]의 값인 m/z 157에서 강한 peak가 관측되어 분자량 134인 malic acid로 재 확인할 수 있었다(미발표). Malic acid의 분자량은 정확히 134.
, 2019). 분리한 화합물(10 ㎎/mL)로 라디칼형태인 DPPH를 환원시키는 능력을 측정하여 항산화 효과를 조사한 결과 6.42%의 낮은 항산화활성을 나타냈다(Table 2). 그러나 이는 100 ㎎/mL의 농도로 측정한 산사 열수추출물의 항산화활성 78.
그러나 소화불량, 복부팽만, 설사 등의 부작용을 나타내, 치료효과는 크면서 부작용이 작은 새로운 치료제 개발이 필요하다. 산수유로부터 분리한 화합물 시료(10 ㎎/mL)의 αglucosidase 저해활성을 측정한 결과 17.28%의 낮은 저해활성을 나타냈다(Table 2). 이는 65.

후속연구

새로운 혈전용해물질을 식용 가능한 약용식물, 해양식물, 버섯, 미생물 등에서 찾는 연구가 진행되고 있는데 이는 미량의 효과라도 식자재로 장기간 공급이 가능하여 큰 효과를 기대할 수 있기 때문이다. 열수추출물로부터 얻은 혈전용해물질은 열에 강한 장점이 있어 기존의 열에 약한 효소계열의 혈전용해물질보다 제약과 기능성 식품 개발에 다양하게 이용 가능할 것으로 기대된다.
2%의 순도를 나타내었다. 좀 더 확실한 구조 규명을 위해서는 NMR과 IR 등의 실험적인 데이터가 뒷받침되어야 할 것으로 보인다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	산수유는 무엇인가?	예로부터 약용으로 사용되는 산수유(Corni fructus)는 층층나무과의 낙엽교목인 산수유나무(Cornus officinalis)의 열매로 온화하며 떫고 신맛이 나며 씨는 독성이 있어 제거한 후 말려서 사용한다. 산수유의 약리효과로는 항암효과(Kim et al.
	산수유의 약리효과로는 무엇이 있는가?	예로부터 약용으로 사용되는 산수유(Corni fructus)는 층층나무과의 낙엽교목인 산수유나무(Cornus officinalis)의 열매로 온화하며 떫고 신맛이 나며 씨는 독성이 있어 제거한 후 말려서 사용한다. 산수유의 약리효과로는 항암효과(Kim et al., 2004), 항산화 효과(Park et al., 2012), 혈전용해 효과(Oh and Kim, 2006), 항균효과(Lee et al., 2006), 항당뇨 효과(Kim, 2005), 혈액내 cholesterol 감소효과(Joo and Jang, 1989) 등이 보고 되었으며, 성분으로는 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid와 morroniside, loganin, sweroside와 같은 iridoid 배당체 등이 보고 되었으며(Kim, 1999), 산수유 내 gallic acid와 malic acid의 함량에 대한 결과도 보고되고 있다(Kim et al, 2003).
	산수유나무의 열매인 산수유는 어떤 성분들을 함유하고 있는가?	, 2012), 혈전용해 효과(Oh and Kim, 2006), 항균효과(Lee et al., 2006), 항당뇨 효과(Kim, 2005), 혈액내 cholesterol 감소효과(Joo and Jang, 1989) 등이 보고 되었으며, 성분으로는 gallic acid, malic acid, tartaric acid, ursolic acid와 morroniside, loganin, sweroside와 같은 iridoid 배당체 등이 보고 되었으며(Kim, 1999), 산수유 내 gallic acid와 malic acid의 함량에 대한 결과도 보고되고 있다(Kim et al, 2003).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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