[논문]인간 대장암 세포에 대한 먹넌출 추출물의 GSK3β 의존성 threonine-286 인산화를 통한 Cyclin D1 분해

강연경; 어현지; 김다솜; 박영기; 송정호; 박광훈

doi:10.7732/kjpr.2020.33.4.271

[국내논문] 인간 대장암 세포에 대한 먹넌출 추출물의 GSK3β 의존성 threonine-286 인산화를 통한 Cyclin D1 분해
Berchemia floribunda-mediated Proteasomal Degradation of CyclinD1 via GKS3β-dependent Threonine-286 Phosphorylation in Human Colorectal Cancer Cells 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.33 no.4, 2020년, pp.271 - 278

강연경 (국립산림과학원 산림약용자원연구소) , 어현지 (국립산림과학원 산림약용자원연구소) , 김다솜 (국립산림과학원 산림약용자원연구소) , 박영기 (국립산림과학원 산림약용자원연구소) , 송정호 (국립산림과학원 산림소득자원연구과) , 박광훈 (국립산림과학원 산림약용자원연구소)

초록
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이상의 연구 결과로 먹넌출 열매 추출물은 GSK3β 의존성 Cyclin D1 단백질의 분해를 통해 대장암세포의 생육 억제와 관련이 있는 것으로 확인된다. 본 결과는 대장암의 항암제 개발을 위한 소재로 먹넌출 열매의 활용이 가능할 것으로 판단된다.

In this study, we evaluated the anti-cancer activity and potential molecular mechanism of 70% ethanol extracts of the Berchemia floribunda (BF) which belongs to Rhamnaceae against human colorectal cancer cells. The treatment of BF decreased the cell proliferation in HCT116 cell and suppressed cellular accumulation of Cyclin D1 protein. Inhibition of proteasomal activity by MG132 attenuated BF-mediated Cyclin D1 downregulation and Cyclin D1 was decreased in the cell treated with BF. These findings indicates that BF-mediated Cyclin D1 downregulation may be result from Cyclin D1 proteasomal degradation. Additionally, BF-mediated Cyclin D1 degradation was blocked in the presence of LiCl, a GSK3β inhibitor, but not PD98059, SP600125, SB203580, Bay11-7082, LY294002 an ERK1/2 inhibitor, JNK inhibitor, p38 inhibitor, IκK inhibitor and PI3K inhibitor. Furthermore, BF phosphorylated Cyclin D1 at threonine-286 (Thr286), and LiCl-induced GSK3β inhibition reduced the BF mediated phosphorylation of Cyclin D1 at Thr286. These results suggested that BF may downregulate Cyclin D1 expression as a potential anti-cancer target through GSK3β dependent Cyclin D1 degradation. Therefore, this study provides that the extract of BF has anticancer activity against human colorectal cancer cells.

Keyword

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Effect of BF on the cell viability of HCT116 cells.
표 Table 1. Sequence of oligonucleotide primers used for RT-PCR
그림 Fig. 2. Downregulation of Cyclin D1 by BF-F (Fruit of Berchemia floribunda) in HCT116 cells.
그림 Fig. 3. Determination of the upstream kinases involved in BF-F mediated Cyclin D1 degradation in human colorectal cancer cells.
그림 Fig. 4. HCT116 cells were pretreated with LiCl (20 μM) as a GSK3β inhibitor for 2 hours, and then co-treated with BF-F (100 ㎍/mL) for 6 hours.

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

, 2006). 따라서 본 연구에서는 대장암세포에 대한 먹넌출 추출물의 항암 활성 및 작용기전을 구명하고자 하였다.

제안 방법

먹넌출 열매, 잎 및 가지의 70% 에탄올 추출물을 이용하여 대장암 세포주인 HCT116의 세포생육억제 활성을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다. 먹넌출 열매, 잎 및 가지 추출물을 0, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도로 처리한 결과 먹넌출 열매에서 HCT116세포의 생육을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig.
2A and B). 먹넌출 열매 추출물이 Cyclin D1 단백질 수준 감소가 전사조절에 기인하는 것인지 확인하기 위해 먹넌출 열매 추출물이 처리된 대장암 세포주 HCT116에서 RT-PCR 을 이용하여 Cyclin D1 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 먹넌출 열매 추출물은 Cyclin D1 단백질 수준을 감소시키지만 mRNA 수준은 감소시키지 않음을 확인하였다(Fig.
또한 먹넌출 열매 추출물이 Cyclin D1 단백질 분해를 유도하는지 확인하기 위해 대장암 세포주 HCT116에 단백질 분해효소 억제제인 MG132를 2시간 전 처리 후 100 ㎍/mL 농도에서 먹넌출 열매 추출물을 10시간 동안 처리 후 Western blot을 통해 Cyclin D1 단백질을 확인하였다(Fig. 2C). 그 결과 MG132가 처리된 세포에서는 먹넌출 열매 추출물에 의해 유도되는 Cyclin D1 단백질의 감소가 억제되었다.
, 2006). 먹넌출 열매 추출물의 Cyclin D1 Thr286 인산화와 LiCl에 의한 GSK3β 억제의 먹넌출 열매 추출물 유도 Cyclin D1 Thr286 인산화에 대한 영향을 평가하였다. 그 결과, 먹넌출 열매 추출물은 처리 6시간에 Cyclin D1의 Thr286을 인산화시켰으며(Fig.

대상 데이터

실험에 사용된 대장암 세포주 HCT116과 마우스 대식세포 RAW264.7은 한국세포주은행에서 분양받았고, 대장암 세포의 배양을 위해 사용된 배지인 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)/F-12 1 : 1 modified medium (DMEM/F-12)는 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구매하였다. 특이적 효소 억제제인 MG132, PD98059, SB203580, SP600125, Bay11-7082, LY294002 및 LiCl과 대장암 세포의 생육억제효능을 평가하기 위한 3-(4,5-dimethylthizaol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma- Aldrich (St.
본 연구에 사용된 먹넌출(Berchemia floribunda)은 2018년 7월 24일에 충청남도 태안군 안면읍에서 채취하였다. 먹넌출은 국립산림과학원 송정호박사의 식물학적 동정을 거쳤으며, 확증표본(표본번호: FMCBrAMD-1807-1-3)은 국립산림과학원 산림약용자원연구소에서 보관하고 있다.

데이터처리

모든 결과는 3회 반복 측정 후 평균±표준편차로 나타내었고, 처리 간 유의성은 Student’s t-test로 검증하여 p-value 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다(Microsoft Excel 2010, Microsoft, Redmond, WA, USA).

성능/효과

먹넌출 열매, 잎 및 가지의 70% 에탄올 추출물을 이용하여 대장암 세포주인 HCT116의 세포생육억제 활성을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다. 먹넌출 열매, 잎 및 가지 추출물을 0, 50, 100, 200 ㎍/mL 농도로 처리한 결과 먹넌출 열매에서 HCT116세포의 생육을 농도 의존적으로 억제하였다(Fig. 1).
먹넌출 열매 추출물이 Cyclin D1 단백질 수준 감소가 전사조절에 기인하는 것인지 확인하기 위해 먹넌출 열매 추출물이 처리된 대장암 세포주 HCT116에서 RT-PCR 을 이용하여 Cyclin D1 mRNA 발현을 확인하였다. 그 결과 먹넌출 열매 추출물은 Cyclin D1 단백질 수준을 감소시키지만 mRNA 수준은 감소시키지 않음을 확인하였다(Fig. 2A).
2C). 그 결과 MG132가 처리된 세포에서는 먹넌출 열매 추출물에 의해 유도되는 Cyclin D1 단백질의 감소가 억제되었다. 따라서 먹넌출 열매 추출물은 Cyclin D1 단백질 분해를 유도할 수 있음을 나타내는 것으로 판단된다.
억제제 처리 시에는 2시간 전처리 후, 먹넌출 열매 추출물을 10시간 동안 처리하고 Western blot을 이용하여 Cyclin D1 단백질 발현 정도를 확인하였다. 그 결과 대장암 세포주 HCT116에 PD98059, SB203580, SP600125, Bay11-7082, LY294002 처리 시 먹넌출 열매 추출물에 의해 유도되는 Cyclin D1 단백질 수준 감소가 나타났다. 그러나 LiCl이 처리된 HCT116 세포에서는 먹넌출 열매 추출물에 의해 유도되는 Cyclin D1 단백질 감소가 억제되었다.
먹넌출 열매 추출물의 Cyclin D1 Thr286 인산화와 LiCl에 의한 GSK3β 억제의 먹넌출 열매 추출물 유도 Cyclin D1 Thr286 인산화에 대한 영향을 평가하였다. 그 결과, 먹넌출 열매 추출물은 처리 6시간에 Cyclin D1의 Thr286을 인산화시켰으며(Fig. 2B), 또한 LiCl은 Thr286 먹넌출 열매 추출물이 매개된 Cyclin D1 인산화를 억제하였다(Fig. 4A). 본 결과는 먹넌출 열매 추출물 Cyclin D1 단백질의 분해는 GSK3β 의존성 Cyclin D1 Thr286의 인산화에 영향을 미치는 것을 알 수 있다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	최근 암의 발생이 급증하고 있는 이유는 무엇인가?	최근 서구화된 식생활과 환경적 스트레스의 및 고령화의 증가로 인한 암의 발생이 급증하고 있다(Kim and Kim, 2015; Kim et al., 2019).
	가장 높은 사망원인을 차지하는 질환은 무엇인가?	, 2019). 암은 가장 높은 사망원인을 차지하는 질환으로 알려져 있으며, 암 환자들의 사망률은 전 세계적으로 매년 증가하는 경향을 나타내고 있다(Kim et al., 2012; Kim et al.
	2016년에 우리나라에서는 229,180건의 암 환자 중 1위를 차지한 암은 무슨 암인가?	그 중 대장암은 남녀를 합쳐 28,127건으로 전체의 12.3%로 위암 다음으로 2위를 차지했다(National Cancer Center, 2018). 향후 환경오염, 수명연장, 식생활의 변화 등으로 대장암 환자는 증가할 것으로 예상한다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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