[논문]지방간 유도 세포모델에서 황금(黃芩), 목향(木香), 시호(柴胡) 복합 추출물의 이상지질혈증에 대한 효과

도현주; 김경호; 오태우

doi:10.6116/kjh.2020.35.5.23.

지방간 유도 세포모델에서 황금(黃芩), 목향(木香), 시호(柴胡) 복합 추출물의 이상지질혈증에 대한 효과
Anti-hyperlipidemic Effects of Scutellariae Radix, Aucklandiae Radix and Bupleuri Radix (SAB) extract in FL83B cells 원문보기

大韓本草學會誌 = The Korea journal of herbology, v.35 no.5, 2020년, pp.23 - 31

도현주 (대구경북첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터) , 김경호 (한국한의학연구원 한의기술응용센터) , 오태우 (한국한의학연구원 한의기술응용센터)

Abstract ▼ AI-Helper

Objectives : This study was conducted to evaluate the anti-hyperlipidemia effect of Scutellariae Radix, Aucklandiae Radix and Bupleuri Radix(SAB). Methods : FL83B cells were mouse liver hepatocytes, and we used this cell line. FL83B cells were treated with 0.5 mM oleic acid(OA) for 24 h, SAB extract was treated. After OA treatment, intracellular triglyceride (TG) and free fatty acid contents were measured with AdiopoRed™ assay and Free Fatty Acid Quantitation assay kit, respectively. Further, we evaluated several lipogenesis and metabolic markers such as sterol regulatory element-binding transcription factor-1c (SREBP-1c), acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS), 3-hydroxy3-methyl-glutaryl CoA reductase (HMGCR), hormone-sensitive lipase (HSL), carnitine palmitoyltransferase (CPT-1), peroxisome proliferator activated receptor alpha (PPARα), and cluster of differentiation (CD36) using RT-PCR and Western-blot analysis. Results : OA markedly increased intracellular TG and free fatty acid, which plays a key role in reducing hepatic lipid accumulation, in FL83B cells. These increases were alleviated by SAB extract. The mRNA and protein expression of Fatty acid(FA) oxidation factors (CPT-1, PPARα), lipolysis factor(HSL), FA transporter(CD36), cholesterol synthesis factors (HMGCoA) and Lipodenesis (SREBP-1c, FAS, and ACC-1) were significantly increased by treatment of SAB extract in the OA-induced fatty liver cell model. Conclusions : In summary, the treat of SAB extract showed a significant reduction of the influx of fatty acids into hepatocytes, promoted the oxidation of fatty acids, and regulated fat synthesis-related factors, thereby regulating the accumulation of TG and free fatty acids.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. The compositions of SAB
표 Table 2. Specific primer sequences for PCR
그림 Fig. 1. Cell viability of FL83B cells treated SAB extract. (A) Cytotoxic effects of SAB in FL83B cell. (B) FL83B cells were induced with OA (0.5 mM) effects of SAB.
그림 Fig. 2. The Effect of SAB on TG accumulation in FL83B Cells. FL83 cells were treated with OA (0.5 mM) with various concentration of SAB (0,25, 50 and 100 ㎍/㎖) for 24h. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ***p < 0.001 vs. CTL ; ^###p < 0.001 vs. OA group.
그림 Fig. 3. The Effect of SAB on free fatty acid contents in FL83B Cells. FL83 cells were treated with OA (0.5 mM) with various concentration of SAB (0, 25, 50 and 100 ㎍/㎖) for 24h. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ***p < 0.001 vs. CTL ; ^##p < 0.01 and ^###p < 0.001 vs. OA group.
그림 Fig. 4. OA regulates the expression of lipid metabolism-related genes in FL83B hepatocytes. Total RNAs were extracted using Trizol reagent and mRNA was measured using qRT-PCR. The fold changes relative to the control were calculated using the ΔΔCT method for mRNA expression levels of fatty acid oxidation genes: CPT-1 and PPARα; Lipoiysis genes: HSL; fatty acid transporter genes: CD36; cholestrol synthesis genes: HMGCoA; lipogenic genes: ACC1, FAS and SREBP-1c. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. **p < 0.01 and ***p < 0.001 vs. CTL ; ^#p < 0.05, ^##p < 0.01 and ^###p < 0.001 vs. OA group.
그림 Fig. 5. OA regulates the expression of lipid metabolism-related proteins in FL83B hepatocytes. FL83 cells were treated with OA (0.5 mM) with various concentration of SAB (0, 25, 50 and 100 ㎍/㎖) for 24h. The intensity of the protein band was normalized against the internal control β-actin. Values are means SEM of two different preparations with quadruplicate experiments. ***p < 0.001 vs. CTL ; ^#p < 0.05, ^##p < 0.01 and ^###p < 0.001 vs. OA group.

AI 본문요약
AI-Helper

* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.

문제 정의

본 연구는 Oleic acid(OA)로 유도된 지방간 FL83B hepatocyte cell 모델에서 황금, 목향, 시호 3가지 배합 추출물(SAB)의 간 세포 내 지방대사에 미치는 영향을 일부 규명하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
또한 Triglyceride의 분해 형태인 free fatty acid는 혈중 농도가 높아질 경우 고지혈증을 유발하고, 혈관 내 지질의 산화량이 늘어나면 죽상동맥경화증으로 진행될 가능성이 증가된다³²⁾. 본 연구에서는 0.5 mM OA를 24시간 처리한 후 유도된 지방간 세포 모델에서 SAB가 TG 및 free fatty acid의 생성량을 농도의존적으로 감소시키는 것을 확인함으로써 (Fig.2, Fig.3) 이상지질혈증에 대한 효능을 갖는 것으로 사료된다.
본 연구에서는 SAB 추출물에 대하여 이상지질혈증에 대한 치료효능을 확인해보고자, FL83B cell에 Oleic acid(OA)를 처리하여 유도한 지방간 세포 모델에서, SAB 추출물이 세포 내 중성지방(TG) 함량에 미치는 변화 및 지질 합성 관련 조절 인자들에 대하여 관찰하였다. SAB 추출물에 대한 세포 독성을 25, 50 100 ㎍/㎖ 농도에서 살펴본 봐, 각각 106.
이에 따라 최근 복합처방 및 단방으로 이상지질혈증을 개선하는 연구가 다양하게 이루어지고 있으며 인진위령탕²⁷⁾, 삼황사삼탕²⁸⁾, 방풍통성산²⁹⁾, 황련해독탕³⁰⁾등 한약으로 이상지질혈증의 개선에 유의한 효과를 확인할 수 있음을 밝혔다. 본 연구에서는 이러한 한의학적 처방을 바탕으로 단미재를 스크리닝하여 그 중 효능이 있는 황금(黃芩), 목향(木香), 시호(柴胡) 3가지 약재를 배합하여 SAB라 칭하였고, 이 추출물에 대해 현대 과학적으로 증명해 보고자 하였다.
지방산의 세포내 과다 유입은 간 세포내 지방축적의 주요한 요인 중 하나로서, SAB 추출물이 CD36의 mRNA 발현을 억제하여 유리지방산의 세포 내 유입을 감소시킴으로써 지방 축적 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과는 SAB 추출물이 향후 동물모델에서의 효능 평가 및 추가적인 연구를 통해 이상지질혈증의 예방 또는 개선을 위한 치료제 및 건강기능식품용 식품 신소재로 개발될 수 있는 가능성을 시사하였다.
최근에는 항산화 및 이상지질혈증의 개선에 한의학적 처방을 바탕으로 복합물이 갖는 효능에 대한 연구가 활발하게 이뤄지고 있으며, 본 연구에서는 이상지질혈증에 대하여 한의학적 처방의 다양한 구성약물의 예비실험을 통하여 도출된 후보약물 중 황금, 목향, 시호 세 가지 약재를 배합한 추출물(SAB)이 이상지질혈증에 미치는 영향을 살펴보고자 간세포주에 Oleic acid로 유도하여 이상지질혈증 세포모델을 제작하였으며, 지질대사 개선 효과를 연구하였고, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

제안 방법

FL83 cell에 0.5mM OA를 처리하여 세포 내 지질 축적을 유도하였으며, SAB 추출물이 세포 내 free fatty acid에 영향을 미쳤는지 확인해 보았다. 그 결과, OA로 유도된 세포에서 free fatty acid의 생성이 정상세포에 비해 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, SAB 추출물 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 정상군 대비 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig.
FL83 cell에 0.5mM OA를 처리하여 세포 내 지질 축적을 유도하였으며, SAB 추출물이 세포 내 지방 생성 및 지질 대사에 영향을 미쳤는지 확인해 보고자 mRNA를 살펴보았다. Fig.
FL83 cell에 0.5mM OA를 처리하여 세포 내 지질 축적을 유도하였으며, SAB 추출물이 세포 내 지질 축적에 감소하였는지 살펴보기 위하여 중성지방 생성량을 확인해 보았다. 그 결과, OA로 유도된 세포에서 TG의 생성이 정상세포에 비해 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, SAB를 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 TG의 생성량이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다.
배양한 FL83B cell를 96well plate에 1×10⁵ cell/㎖ 농도로 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. FL83B cell에 각각 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도의 SAB 추출물을 처리한 후 12시간 반응시켰다. 5 ㎎/㎖ (DPBS)의 MTT 시약을 media에 5배 희석한 용액 100 ㎕씩 분주 한 후 1시간 incubator에서 반응시켰다.
Membrane에 다시 anti-IgG conjugated HRP 항체를 넣은 후 1시간 동안 실온에서 반응시키고 0.05% Tween이 포함된TBS (1×TTBS)로 3회 세척하여 ECL용액을 이용하여 ChemiDocTM touch imaging system (BioRad, California, USA)를 이용하여 분석하였다.
추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. PCR bio syGreen blue Mix(PCR Biosystems, Pennsylvania, USA) 10 ㎕와 primer 2 ㎕가 포함된 혼합물 19 ㎕와 cDNA 1 ㎕를 polymerase chain reaction (PCR) 사이클을 40회 수행하였다. 중합 효소 반응에 쓰인 primer의 정보는 Table 2에서 나타내었다.
SAB 추출물에 대한 세포 독성을 25, 50 100 ㎍/㎖ 농도에서 살펴본 봐, 각각 106.24 ± 4.1%, 108.13 ± 3.9%, 106.95 ± 3.2으로 100 ㎍/㎖ 농도까지 독성이 나타나지 않았으며(Fig. 1A), 독성이 없는 범위 내에서 실험을 진행하였다.
SAB 추출물의 지질 대사 및 지질합성 조절 기전을 확인하기 위하여 FL83 cell에 0.5mM OA를 처리한 지방간 세포모델에서 protein의 발현양을 확인하였다(Fig. 5). 그 결과, 지방 합성 관련 인자인 ACC-1 및 FAS의 발현의 경우 지방간을 유도하기 위한 OA 처리군에서는 현저히 증가되었지만, SAB 추출물을 처리한 군에서는 유의적으로 감소됨을 확 인 할 수 있었다.
5mM OA를 24시간 처리한 후 SAB를 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도까지 농도별로 처리하였다. SAB가 처리된 media를 제거한 뒤 PBS를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다.
FL83B cell로부터 지방 생성 관련 단백질의 발현을 Western blot으로 측정하였다. 먼저, FL83B cell에 독성이 없는 농도 범위에서 0.5mM OA를 24시간 처리한 후 SAB를 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도까지 농도별로 처리하였다. 각 세포를 1× PBS로 3회 세척 후 lysis buffer(50 mM HEPES, pH 7.
FL83B cell을 6 well plate에 106 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 normal을 제외한 모든 well에 0.5 mM OA가 포함된 새로운 배양액으로 교체하여 24시간 동안 지방증을 유도하였고, SAB 추출물을 각각 25, 50, 100 (㎍/㎖)의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 시료가 처리된 FL83B cell은 1% TritonX-100이 포함된 chloroform 200 ㎕를 넣어 균질화 시킨 후 13,000 g에서 10분 동안 원심분리 한 뒤 상등액을 사용하였다.
탈착된 세포는 10% FBS가 첨가된 F-12K 배양액 10 ㎖에 부유시킨 다음 새로운 culture flask에 옮겨 1 : 2의 split ratio로 CO2 배양기(37℃, 5% CO2)에서 배양하였다. 세포에 지방간을 유도하기 위하여 0.5 mM oleic acid(OA)를 24시간동안 처리하여 지질축적을 유도한 다음, SAB 약물을 모든 실험분석을 위해 24시간 동안 처리하였다.
유도 후 SAB 추출물을 농도별로 처리하여 AdiopoRed™ assay reagent (Lonza, MD, USA)를 이용하여 TG생성량을 측정하였다.
cells/well로 6-well culture dish에 분주해 24 시간 동안 배양하였다. 이후 각 well에 지방간을 유도하기 위하여 0.5mM OA를 24시간 처리한 후 SAB를 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도까지 농도별로 처리하였다. SAB가 처리된 media를 제거한 뒤 PBS를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다.
유도 후 SAB 추출물을 농도별로 처리하여 AdiopoRed™ assay reagent (Lonza, MD, USA)를 이용하여 TG생성량을 측정하였다. 즉, SAB 추출물을 24시간 처리한 뒤, DPBS를 이용하여 washing하였으며, Adipo red reagent를 40배 희석한 후(DPBS) 각 well 당 200 ㎕씩 처리한 후 암실 조건에서 10분간 배양하였다. spectrophotometer(SpectraMax i3, Molecular devices, CA, USA)로 excitation 485nm, emission 572nm에서 측정하였다.
SAB가 처리된 media를 제거한 뒤 PBS를 이용하여 세척하고 RNeasy^Ⓡ mini kit(Aiagen, Hilden, Gerbany)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA를 Spectrophotometer(Nanodrop)을 통하여 정량해, 1 ㎍ RNA를 Maxima frist strand cDNA synthesis kit for RT-qPCR(Thermo scientific, Waltham, USA)를 이용하여 complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. PCR bio syGreen blue Mix(PCR Biosystems, Pennsylvania, USA) 10 ㎕와 primer 2 ㎕가 포함된 혼합물 19 ㎕와 cDNA 1 ㎕를 polymerase chain reaction (PCR) 사이클을 40회 수행하였다.

대상 데이터

FL83B cells은 mouse liver hepatocyte으로, ATCC^Ⓡ를 통하여 구입하였으며, 세포배양은 이미 보고된 선행연구의 방법에 따라 다음과 같이 시행되었다. FL83B cell은 37℃, 5% CO₂ 조건에서 10% FBS, penicillin(100 U/㎖), streptomycin(100 ㎍/㎖)이 첨가된 Ham’s F-12K(Kaighn’s) 배지로 배양되었다.
본 연구에서는 전통적으로 사용되는 한약재의 혼합추출물로 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi), 목향 (Aucklandia lappa Decne), 시호 (Bupleurum falcatum Linne)로 구성하여 사용하였다. 황금(黃芩, Scutellariae Radix)은 대한약전에 속썩은풀(꿀풀과 Labiatae)의 뿌리로서 그대로 또는 주피를 제거한 것으로 수재되어있으며¹³⁾, 향균효과¹⁴⁾, 염증성 장질환에서의 효능¹⁵⁾, 항암효과¹⁶⁾ 및 항산화효과¹⁷⁾, 혈중 지질강하작용¹⁸⁾을 보고하였으며, 목향(木香, Aucklandiae Radix)은 국화과에 속한 다년생 본초인 운목향의 뿌리이며 성(性)은 온(溫)하고 미(味)는 신고(辛苦)하다.
약재의 구성은 Table 1과 같으며, 3종의 약재는 옴니허브(대구, 한국)를 통하여 구입하였으며, 각각의 약재에 대하여 30 g에 정제수 1.8L를 가하여 열탕추출기에서 3시간 씩 2회 가열하여 얻은 추출물을 여과지(Whatman NO. 1)로 여과한 후 회전식 감압농축기로 감압 농축하여 동결 건조함으로써 SAB물 추출물을 제조하였으며 수득율은 50.6%였으며, 건조분말 상태로 냉장보관하면서 실험 직전 생리식염수에 희석하여 사용하였다.

데이터처리

모든 실험 결과는 GraphPadprism 5.0 통계 프로그램(GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)을 이용하여 각 실험군의 평균과 표준편차(mean±SD)로 계산하였으며 각 그룹 간 비교를 위해 one-way ANOVA로 분석하였으며, 사후 검정은 LSD를 통해 검증하였으며, p<0.05 수준에서 각 실험군 간의 유의성을 평가하였다.

이론/모형

FL83B cell로부터 지방 생성 관련 단백질의 발현을 Western blot으로 측정하였다. 먼저, FL83B cell에 독성이 없는 농도 범위에서 0.
약물에 의한 세포독성을 알아보기 위해 MTT assay 방법을 이용하였다¹⁰⁾. 배양한 FL83B cell를 96well plate에 1×10⁵ cell/㎖ 농도로 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다.

성능/효과

1. SAB 추출물은 OA로 유도된 지방간 세포모델에서 중성지방(TG) 및 free fatty acid의 생성량을 유의적으로 감소시켰다.
2. SAB 추출물은 OA로 유도된 지방간 세포모델에서 FA oxdaition 인자인 CPT-1, PPARα, Lipolysis 인자인 HSL의 mRNA 및 protein 발현을 유의적으로 증가시켰다.
3. SAB 추출물은 OA로 유도된 지방간 세포모델에서 지질합성 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 CD36, HMGCoA, SREBP-1c, FAS, ACC-1의 mRNA 및 protein 발현을 유의적으로 감소시켰다.
Fig. 4는 FA oxdaition에 관여하는 인자인 CPT-1, PPARα 및 Lipolysis에 관여하는 HSL의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과로, SAB 추출물을 처리시, 대조군 대비 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었으며, FA trans porter인 CD36 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMGCoA, 간 내 지방 축적요인 중 지방 합성 (lipogenesis)에 관여하는 ACC-1, FAS, SREBP1c의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, SREBP1c의 경우 oleic acid 처리시 대조군 대비 야 200%로 크게 증가하였고, SAB 추출물 처리시 100 ㎍/㎖ 농도에서 mRNA 발현량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.
SAB 추출물에 대한 세포 독성을 알아보기 위하여 FL83B cell에 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 처리한 후 24시간 배양하여 MTT assay 방법으로 세포독성을 측정한 결과, 각각 100.38 ± 6.4%, 106.24 ± 4.1%, 108.13 ± 3.9%, 106.95 ± 3.2으로 100 ㎍/㎖ 농도까지 독성이 나타나지 않았다(Fig. 1A).
결론적으로 이상의 본 연구의 결과를 종합해 봤을 때, SAB 추출물은 CD36 mRNA 발현량을 감소시켜 지방산의 간 세포내 유입을 감소시키고, PPARα와 CPT-1의 mRNA 발현 및 ptrotein 발현을 증가시켜 지방산의 산화를 촉진하는 동시에 HMGCoA, SREBP-1c, FAS, ACC-1 등의 지방 합성 관련 인자의 mRNA 또는 단백질의 발현 감소 및 HSL의 mRNA 발현을 증가시킴으로써 지방 분해를 증가시켜 간 세포 내 중성지방(TG) 및 free fatty acid의 축적되는 것을 예방 또는 개선 하는 효과가 있다고 사료된다.
5mM OA를 처리하여 세포 내 지질 축적을 유도하였으며, SAB 추출물이 세포 내 지질 축적에 감소하였는지 살펴보기 위하여 중성지방 생성량을 확인해 보았다. 그 결과, OA로 유도된 세포에서 TG의 생성이 정상세포에 비해 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, SAB를 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 TG의 생성량이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 대조군인 Atrovastatin 10 uM보다 뛰어난 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig 2).
5mM OA를 처리하여 세포 내 지질 축적을 유도하였으며, SAB 추출물이 세포 내 free fatty acid에 영향을 미쳤는지 확인해 보았다. 그 결과, OA로 유도된 세포에서 free fatty acid의 생성이 정상세포에 비해 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, SAB 추출물 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 정상군 대비 유의성 있는 감소가 나타났다(Fig. 3).
5). 그 결과, 지방 합성 관련 인자인 ACC-1 및 FAS의 발현의 경우 지방간을 유도하기 위한 OA 처리군에서는 현저히 증가되었지만, SAB 추출물을 처리한 군에서는 유의적으로 감소됨을 확 인 할 수 있었다. 또한 세포내 지방산 유입에 관여하는 CD36의 단백질 발현양 역시 OA에 의해 증가되었으며, SAB 추출물에 의하여 유의적으로 감소함을 알 수 있었다.
중성지방(TG)는 adipose triglyceride lipase (ATGL)에 의해 분해되어 diacylglycerol과 지방산 분자를 생성 할 수 있으며, diacylglycerol은 hormone-sensitive lipase (HSL) 인산화에 의해 분해되어 monoacylglycerol과 유리지방산 분자를 생성한다³⁴⁾. 따라서 SAB 추출물이 HSL의 mRNA 발현을 증가시킴으로써 지방 분해를 증가시켜 지방간 세포의 지질 축적을 줄일 수 있는 것을 확인하였다(Fig.4). 하지만, 유리지방산은 간세포 및 대식세포, 혈관 내피세포의 염증반응을 유도할 수 있는데 많은 연구에서 간의 대식세포가 유리지방산에 의해 활성화되어 더 심한 염증을 일으키게 되고, 간 세포에서는 지질 및 탄수화물 대사 이상을 유발하여 더 많은 염증성 사이토카인을 생성한다는 보고가 있다³⁵⁾.
본 연구에서도 SAB 추출물은 간세포에서 PPARα의 mRNA 및 protein 발현을 상당히 촉진하였다. 따라서 SAB 추출물이 지방산의 분해를 증가시키는 것을 알 수 있었다. 한편, Fatty acid translocase(FAT/CD36)은 간 세포에서 지방산의 원형질 내 유입을 담당하며, 지방분해로부터의 지방산 흡수는 주로 세포막에서 CD36을 통하여 발생한다³⁶⁾.
1A). 또한 FL83B cell에 지방간을 유도하기 위하여 0.5mM oleic acid(OA)를 24시간동안 처리하여 지질축적을 유도한 다음, 위의 SAB 추출물을 처리하여 세포생존도를 측정한 결과, SAB 추출물을 처리한 세포에서 독성이 없는 것을 확인하였다(Fig. 1B).
4는 FA oxdaition에 관여하는 인자인 CPT-1, PPARα 및 Lipolysis에 관여하는 HSL의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과로, SAB 추출물을 처리시, 대조군 대비 농도 의존적으로 증가함을 알 수 있었으며, FA trans porter인 CD36 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMGCoA, 간 내 지방 축적요인 중 지방 합성 (lipogenesis)에 관여하는 ACC-1, FAS, SREBP1c의 mRNA 발현량 변화를 검토한 결과, SREBP1c의 경우 oleic acid 처리시 대조군 대비 야 200%로 크게 증가하였고, SAB 추출물 처리시 100 ㎍/㎖ 농도에서 mRNA 발현량이 유의적으로 감소됨을 확인하였다. 또한 SAB 추출물과 FAS 및 ACC-1의 mRNA 발현 간의 연관성을 검토한 결과, Fig. 4와 같이 oleic acid 처리에 의해 대조군 대비 약 200% 발현되었고, SAB 추출물에서 25, 50, 100 ㎍/㎖ 농도에서 mRNA 발현량이 농도 의존적으로 대폭 감소하였으며, CD36 및 HMGCoA의 mRNA 역시 SAB 추출물에서 농도 의존적으로 감소됨을 확인하였다.
그 결과, 지방 합성 관련 인자인 ACC-1 및 FAS의 발현의 경우 지방간을 유도하기 위한 OA 처리군에서는 현저히 증가되었지만, SAB 추출물을 처리한 군에서는 유의적으로 감소됨을 확 인 할 수 있었다. 또한 세포내 지방산 유입에 관여하는 CD36의 단백질 발현양 역시 OA에 의해 증가되었으며, SAB 추출물에 의하여 유의적으로 감소함을 알 수 있었다. 한편, FA oxdation에 관여하는 인자인 PPARα 및 PPARα의 downstream effecter인 CPT-1 경우 SAB 추출물에서 유의적으로 단백질의 발현 양을 증가함으로써 지방산의 베타 산화를 촉진함으로써 지방간을 억제함을 확인할 수 있었다.
본 연구에서도 SAB 추출물은 간세포에서 PPARα의 mRNA 및 protein 발현을 상당히 촉진하였다.
우리는 앞서 결과에서 SAB 추출물이 중성지방(TG)를 감소시키는 것을 확인하였으며 (Fig.2), 이러한 간세포의 지질 축적감소에 대한 결과는 지방 분해에 의한 지질대사를 향상 시킬것이라고 생각되었다. 중성지방(TG)는 adipose triglyceride lipase (ATGL)에 의해 분해되어 diacylglycerol과 지방산 분자를 생성 할 수 있으며, diacylglycerol은 hormone-sensitive lipase (HSL) 인산화에 의해 분해되어 monoacylglycerol과 유리지방산 분자를 생성한다³⁴⁾.
즉, 간세포 lipogenesis의 핵심적 조절인자인 SREBP-1c 및 타겟 효소인 ACC, FAS 및 HMGCoA를 본 실험에서 확인해 본 결과 SAB 추출물이 OA로 유도된 지방간 세포에서 FAS 및 ACC-1의 mRNA 및 protein 발현을 감소시켰으며, 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMGCoA의 mRNA 발현도 감소시켰다. 이러한 결과는 간세포에서 지질 축적을 감소시키기 위한것으로 그 상위 단계인 SREBP-1c의 mRNA의 발현 역시 억제시키는 것을 확인하였다.
한편, Sterol regulatory element binding protein 1c (SREBP-1c)는 지질 합성 조절 및 세포 항상성 유지에 필수적인 전사인자이며, 간세포 내에서 지질 합성에 관여하는 효소인 acetyl-CoA carboxylase (ACC), fatty acid synthase (FAS) 및 콜레스테롤 합성에 관여하는 3-hydroxy3-methylglutaryl CoA reductase (HMGCR)를 조절한다33). 즉, 간세포 lipogenesis의 핵심적 조절인자인 SREBP-1c 및 타겟 효소인 ACC, FAS 및 HMGCoA를 본 실험에서 확인해 본 결과 SAB 추출물이 OA로 유도된 지방간 세포에서 FAS 및 ACC-1의 mRNA 및 protein 발현을 감소시켰으며, 콜레스테롤 합성에 관여하는 HMGCoA의 mRNA 발현도 감소시켰다. 이러한 결과는 간세포에서 지질 축적을 감소시키기 위한것으로 그 상위 단계인 SREBP-1c의 mRNA의 발현 역시 억제시키는 것을 확인하였다.
한편, Fatty acid translocase(FAT/CD36)은 간 세포에서 지방산의 원형질 내 유입을 담당하며, 지방분해로부터의 지방산 흡수는 주로 세포막에서 CD36을 통하여 발생한다³⁶⁾. 지방산의 세포내 과다 유입은 간 세포내 지방축적의 주요한 요인 중 하나로서, SAB 추출물이 CD36의 mRNA 발현을 억제하여 유리지방산의 세포 내 유입을 감소시킴으로써 지방 축적 개선 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과는 SAB 추출물이 향후 동물모델에서의 효능 평가 및 추가적인 연구를 통해 이상지질혈증의 예방 또는 개선을 위한 치료제 및 건강기능식품용 식품 신소재로 개발될 수 있는 가능성을 시사하였다.
그 결과, OA로 유도된 세포에서 TG의 생성이 정상세포에 비해 현저히 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, SAB를 농도별로 처리하였을 때 농도 의존적으로 TG의 생성량이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 특히 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 때 대조군인 Atrovastatin 10 uM보다 뛰어난 효과를 나타내는 것을 알 수 있었다(Fig 2).
한편, FA oxdation에 관여하는 인자인 PPARα 및 PPARα의 downstream effecter인 CPT-1 경우 SAB 추출물에서 유의적으로 단백질의 발현 양을 증가함으로써 지방산의 베타 산화를 촉진함으로써 지방간을 억제함을 확인할 수 있었다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	한의학에서 이상지질혈증에 대한 처방의 장점은 무엇인가?	즉 한의학에서는 이상지질혈증의 개념을 비(脾)의 운화실조(運化失調)와 간(肝)의 소설기능장애(疏泄機能障礙)로 나타나는 것으로 보고 어혈(瘀血), 습탁(濕濁)이 혈맥(血脈)에 발생하는 것과 유사하다고 보았다9). 또한 한의학에서 사용되는 처방은 이미 수백년 이상 임상을 통하여 안전성이 증명된 것이기 때문에, 한방처방에 사용되는 한약재로 치료제를 개발할 경우 효능 뿐만 아니라 부작용에 대하여 장점이 될 수 있다. 최근에는 다양한 한약 추출물의 이상지질혈증 개선 효과를 전통 한의학 및 현대 약리학적 관점에서 분석한 연구가 진행 중이다10-12).
	황금은 무엇인가?	본 연구에서는 전통적으로 사용되는 한약재의 혼합추출물로 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi), 목향 (Aucklandia lappa Decne), 시호 (Bupleurum falcatum Linne)로 구성하여 사용하였다. 황금(黃芩, Scutellariae Radix)은 대한약전에 속썩은풀(꿀풀과 Labiatae)의 뿌리로서 그대로 또는 주피를 제거한 것으로 수재되어있으며13), 향균효과14), 염증성 장질환에서의 효능15), 항암효과16) 및 항산화효과17), 혈중 지질강하작용18)을 보고하였으며, 목향(木香, Aucklandiae Radix)은 국화과에 속한 다년생 본초인 운목향의 뿌리이며 성(性)은 온(溫)하고 미(味)는 신고(辛苦)하다. 현대의 연구에서는 목향(木香)에서 추출된 물질이 혈관을 확장시키고 염증을 억제하며 고지방식이 마우스에서 인슐린 및 염증에 효능이 있다고 알려져있다19-20).
	황금은 어떠한 효능이 있는가?	본 연구에서는 전통적으로 사용되는 한약재의 혼합추출물로 황금 (Scutellaria baicalensis Georgi), 목향 (Aucklandia lappa Decne), 시호 (Bupleurum falcatum Linne)로 구성하여 사용하였다. 황금(黃芩, Scutellariae Radix)은 대한약전에 속썩은풀(꿀풀과 Labiatae)의 뿌리로서 그대로 또는 주피를 제거한 것으로 수재되어있으며13), 향균효과14), 염증성 장질환에서의 효능15), 항암효과16) 및 항산화효과17), 혈중 지질강하작용18)을 보고하였으며, 목향(木香, Aucklandiae Radix)은 국화과에 속한 다년생 본초인 운목향의 뿌리이며 성(性)은 온(溫)하고 미(味)는 신고(辛苦)하다. 현대의 연구에서는 목향(木香)에서 추출된 물질이 혈관을 확장시키고 염증을 억제하며 고지방식이 마우스에서 인슐린 및 염증에 효능이 있다고 알려져있다19-20).

참고문헌 (36)

M Benedict, X Zhang. : Non-alcoholic fatty liver disease: an expanded review. World Journal of Hepatology. 2017 ; 9(16) : 715-32.

상세보기
Reccia I, Kumar J, Akladios C, Virdis F, Pai M, Habib N, Spalding D. Nonalcoholic fatty liver disease: a sign of systemic disease. Metabolism. 2017 ; 72 : 94-108.

상세보기
Dongguk University Industry-Academia Collaboration Foundation. "Obesity Management Committee" Research Report. Development of comprehensive strategy for obesity management. 2015 : 10-12.
Jo JJ, Lee SH. A Comparison of Lovastatin and Simvastatin in Treatment of Hyperlipidemia. Korean Journal of Clinical Pharmacy. 2002 ; 12 : 39-50.
Kim YK, Jo MJ, Moon YH. Review of Clinical Research about Herbal Medicine Treatment Containing Diuretic Herbs on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease - Research on China Academic Journal. J Int Korean Med. 2019 ; 40(1) : 38-57.

원문보기 상세보기
Kim JS, Park MJ, Kim SJ, Shin MR, Lee AR, Park HJ, Roh SS, Seo YB. Studies on Antioxidant and Antihyperlipidemic Effects in Induced Hypercholesterolemic Rats of Steamed Achyranthis Bidentatae Radix. Kor J Herbol. 2018 ; 33(6) : 43-60.
Habukuihakwon. youngchu-kyungkyosuk. Beijing: Inminwisheng publisher; 1982:161.
Bang HJ, Tak US, Hong Y, Kang YH, Korean medicine approach to hyperlipidemia. Dongseomedicine. 1995 ; 20(1) : 25-36.
Cha JY, Yoo HR, Kim YS, Seol IC, Jo HK. Inhibition of gene associated with Dyslipidemia and Antioxidative Effect of Artemisia iwayomogi, Curcumae Radix and Raphani Semen(ACR) on HepG2 cell model. J Korean Med. 2017 ; 38(3) : 43-58.

원문보기 상세보기
Jeong MJ, Kim SY, Do EJ, Yun JG, Kim DI, Han KS, Kim MR. The effect of herbal mixture on alcohol metabolism in Sprague Dawley rats. Kor J Herbol. 2019 ; 34(1) : 67-74.
Lee JM, Seo BI, Park JH, Roh SS. Effects of water extracts from Phyllostachys Folium on hyperlipidemia and liver damage induced by alcohol. Kor J Herbology. 2011 ; 26(3) : 31-36.
Yeh YT, Cho YY, Hsieh SC, Chiang AN. Chinese olive extract ameliorates hepatic lipid accumulation in vitro and in vivo by regulating lipid metabolism. Scientific Report. 2018 ; 8 : 1057.

상세보기
Korean Food and Drug Adminstration Notification 2007-89. The Korean Pharmacopoeia. 2007 : 993-4.
Kim EN, Paek JY, Kim YH, Han MD. Antibacterial Activities of a Aqueous Extract form Scutellaria baicalensis against Pathogenic Bacteria. Journal of Natural Sciences of Soonchunhyang University. 2008 ; 14(1) : 11-8.
Lee SH, Lim BO, Choue RW. Immunoregulatory Effects of Water Extracts of Scutellariae Radix in DSS-Induced Inflammatory Bowel Disease Animal Model. The Korean Journal of Nutrition. 2004 ; 37(6) : 431-9.
Lee YY, You KH, Kim SY, Ahn BZ. Augmentation of the Cytotoxic Effects of Anticancer Drugs by ( $\pm$ )-ar-Turmerone and Extracts of the Lithosperma and Scutellaria Roots against Human Leukemia Cell Lines. Yakhak Hoeji. 1991 ; 35(3) : 203-15.
Cho SU, Oh WW. Anti-Oxidative Effects of Scutellariae Radix. Kor J Herbology. 2005 ; 20(3) : 67-74.
Kim KS, Cha MH, Lee SW, Yoon YS. A Study on the Inhibitory Effects of Scutellariae Radix on Fat Accumulation. Korean Journal Of Oriental Medicine. 2003 ; 9(2) : 45-54.
The Textbook Compilation Committee of Herbalogy of Oriental Medical Schools in Nation. Herbalogy. Seoul. Younglim Publisher. 2011 ; 395-6.
Oh JS, MA YH, Choi SB, Kim JH, Kim KK, Jeon SY. Effects of Inula helenium on Inflammation and Insulin Resistance in Obesity-induced Insulin Resistance Mouse by High Fat Diet. J Int Korean Med. 2014 ; 35(4) : 428-38.
Textbook Compilation Committee of college of Korean Medicine. Herbology. Seoul : Younglim. 2007 : 186-8.
Korea national health and nutrition examination survey. 2014 National health statistics. Seajong : Ministry of Health and Welfare. 2015 : 36-57.
Kim SH. Drug treatment of dyslipidemia. J of the Korean Medical Association. 2016 ; 59(5) : 366-73.

상세보기
Chang R, Chou MC, Hung LY, Wang ME, Hsu MC, Chiu CH. Study of Valproic Acid-Enhanced Hepatocyte Steatosis. Biomed Res Int. 2016 : 9576503.
Kim HY, Lim SH, Kwon CJ, Park YH, Lee KJ, Park DS, Kim KH, Kim SM and Park CB. Effect of Lythrum salicaria L. ethanol extract on lipid metabolism and anti-obesity in rat fed high fat diet. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 2011 ; 19 : 319-24.

원문보기 상세보기
Lee JH, Cho CW, Han XF, Hwang JY, Kang MJ, Joo HJ, Kim ME, Seo YJ and Kim JI. Amelioration of plasma glucose and cholesterol levels in Db/db mice by a mixture of chinese herbs. Korean Journal of Medicinal Crop Science. 2008 ; 16 : 225-30.
Hwang WK, Kim DH. Study on the Effect of Injinwieryungtang(IJWRT) on hyperlipidemia. J of Korean medicine research institute, Daejeon University. 2005 ; 14(2) : 71-85.
Kim CY. Anti-hyperlipidemic Effect of Samhwangsasim-tanggamibang in Highcholesterol Diet induced Rat Model. Sangji University. Wonju, Korea. 2016.
Jung SH, Lee KT, Ann HS, Lee JY, Choi JW, Kim DG. Hypolipidemic and Antioxidative Effects of Bangpoongtongsungsankamibang on Diet-Induced Obesity Rats. Kor J Pharmacogn. 2006 ; 37(3) : 190-5.
Cha JY, Kim DJ, Kim SH, Kim YK, Cho YS. Pharmacological Effect of Hawangyeonhaedoktang on Experimental Triglyceride Accumulated HepG2 Cells. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2003 ; 32(4) : 586-90.

원문보기 상세보기
Ducharme NA, Bickel PE. Lipid droplets in lipogenesis and lipolysis. Endocrinol. 149 2008 ; 149 : 942e949.

상세보기
Wang Y, Viscarra J, Kim SJ, Sul HS, Transcriptional regulation of hepatic lipogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2015 ; 16(11) : 678e689.

상세보기
Kang OH, Kim SB, Mun SH, Seo YS, Hwang HC, Lee YM, Lee HS, Kang DG, Kwon DY. Puerarin ameliorates hepatic steatosis by activating the PPARalpha and AMPK signaling pathways in hepatocytes. Int J Mol Med. 2015 ; 35 : 803-9.

상세보기
Liao CC, Ou TT, Huang HP, Wang, CJ. The inhibition of oleic acid induced hepatic lipogenesis and the promotion of lipolysis by caffeic acid via upregulation of AMP-activated kinase. J Sci Food Agric. 2014 ; 94 : 1154-62.

상세보기
Malandrino MI, Fucho R, Weber M, Calderon-Dominguez M, Mir JF, Valcarcel L, Escote X, Gomez-Serrano M, Peral B, Salvado L, Fernandez-Veledo S, Casals N, Vazquez-Carrera M, Villarroya F, Vendrell JJ, Serra D, Herrero L. Enhanced fatty acid oxidation in adipocytes and macrophages reduces lipid-induced triglyceride accumulation and inflammation. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2015 ; 308 : E756-eE769.

상세보기
Kawano Y, Cohen DE. Mechanisms of hepatic triglyceride accumulation in non-alcoholic fatty liver disease. J. Gastroenterol. 2013 ; 48 : 434-41.

상세보기

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

내보내기 구분	파일저장 인쇄 메일전송
구성항목	기본정보 상세정보 관리번호, 논문명, 저널/프로시딩명, 저자 , 발행년, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, 발행기관 관리번호, 논문명, 대등논문명, 저자 , 저널/프로시딩명, 발행기관, 발행년, 발행언어, 권, 호, 시작페이지, 끝페이지, ISBN, ISSN, 주제분야, 키워드, 초록(한글), 초록(영문), 저자(소속기관)
저장형식	Text(ASCII format) Excel format RefWorks Direct Export RIS format (for Reference Manager, ProCite, EndNote), Scholar's Aids, Mendeley
메일정보	받는사람 (필수) @ 보내는사람 (선택) @ 제목 내용 KISTI 검색결과 이메일 서비스
안내	총 건의 자료가 검색되었습니다. 다운받으실 자료의 인덱스를 입력하세요. (1-10,000) 검색결과의 순서대로 최대 10,000건 까지 다운로드가 가능합니다. 데이타가 많을 경우 속도가 느려질 수 있습니다.(최대 2~3분 소요) 다운로드 파일은 UTF-8 형태로 저장됩니다. 파일의 내용이 제대로 보이지 않을실 때는 웹브라우저 상단의 보기 -> 인코딩 -> 자동선택 여부를 확인하십시오. ~ Text(ASCII format) Excel format

연합인증