[논문]카드뮴으로 유발된 산화 스트레스에 대한 진피의 간세포 보호 및 항산화 효과

노규표; 변성희; 정대화; 이종록; 박숙자; 김상찬

doi:10.14374/hfs.2020.28.4.327

카드뮴으로 유발된 산화 스트레스에 대한 진피의 간세포 보호 및 항산화 효과
Hepatocyte protection and antioxidant effect of Citri Unshius Pericarpium against cadmium-induced oxidative stress 원문보기

大韓韓醫學方劑學會誌 = Herbal formula science, v.28 no.4, 2020년, pp.327 - 337

노규표 (대구한의대학교 한의과대학) , 변성희 (대구한의대학교 한의과대학) , 정대화 (디앤비바이오) , 이종록 (대구한의대학교 제약공학과) , 박숙자 (대구한의대학교 제약공학과) , 김상찬 (대구한의대학교 한의과대학)

Abstract ▼ AI-Helper

Objective : Citri Unshius Pericarpium is the dried peel of mature fruit of Citrus unshiu Markovich and has been used to treat indigestion, vomiting, and removal of phlegm. This study investigated the hepatoprotective and antioxidant effect of CEE (Ethanol extract of Citri Unshius Pericarpium) in cadmium (CdCl2)-treated HepG2 cells. Methods : Component analysis of Citri Unshius Pericarpium was analyzed by UPLC with C18 column. Cell viability was determined by MTT assay. The enzyme activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of reactive oxygen species (ROS) and reduced glutathione (GSH) were analyzed using commercially available kits. Results : Cadmium caused severe HepG2 cell death. Cadmium also increased ROS production, consistent with depletion of GSH and inhibition of the SOD enzyme. However, CEE treatment reduced cell death and relieved oxidative stress caused by cadmium toxicity. CEE lowered ROS levels and improved depletion of GSH levels. CEE also enhanced the enzymatic activity of SOD. In component analysis, hesperidin was the most abundant of the five marker compounds (Narigenin, Narigin, Narirutin, Hesperidin and Hesperidin), which assumes that hesperidin partially contributed to the antioxidant activity of CEE. Conclusion : These results suggested that CEE could be a potential substance to solve heavy metal-related health problems. In particular, inhibition of oxidative stress by CEE can be a way to treat liver damage caused by cadmium.

주제어

표/그림 (7)

표 Table 1. Gradient profile for the analysis of UPLC
그림 Fig. 1. Chemical structures and UPLC chromatogram of five marker compounds in CEE (A) Chemical structures of five marker compounds, narigenin, narigin, narirutin, hesperidin and hesperitin. (B) UPLC chromatograms of standard compounds (left) and five marker compounds in CEE (right).
표 Table 2. UPLC retention time and content of 5 marker compounds in CEE
그림 Fig. 2. Effect of CEE on cadmium-induced cytotoxicity in HepG2 cells Various concentrations (100, 200, 300 μM) of cadmium were treated into the cells for 1 h (A) or 3 h (B) to determine the optimum experimental condition of cadmium in HepG2 cells. (C) HepG2 cells were treated with CEE (10, 30, 100 ㎍/㎖) alone for 24 h. (D) HepG2 cells were pre-treated with CEE (10, 30, 100 ㎍/㎖) for 24 h and then exposed to 100 μM of cadmium for 3 h. (significant as compared to control, **p < 0.01; significant as compared to cadmium alone, ##p ＜ 0.01; N.S, not significant; C, control).
그림 Fig. 3. Effect of CEE on cadmium-induced ROS production Cells were exposed with cadmium for 1 h after CEE treatment for 24 h. ROS level was measured by DCFH-DA staining and the fluorescence intensity was expressed as percentage of control. (significant as compared to control, **p < 0.01; significant as compared to cadmium alone, ##p ＜ 0.01; C, control).
그림 Fig. 4. Effect of CEE on GSH levels altered by cadmium treatment Cells were exposed with cadmium for 3 h after CEE treatment for 24 h. GSH contents were measured in cell homogenates as described in material and method section. Data were expressed as percentage of control. (significant as compared to control, **p < 0.01; significant as compared to cadmium alone, ##p ＜ 0.01; C, control).
그림 Fig. 5. Effect of CEE on SOD activity altered by cadmium treatment Cells were exposed with cadmium for 3 h after CEE treatment for 24 h. SOD activity was measured as described in material and method section. (significant as compared to control, **p < 0.01; significant as compared to cadmium alone, ##p ＜ 0.01; C, control).

AI 본문요약
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문제 정의

. 본 연구에서는 陳皮 에탄올 추출물을 사용하여 간 세포주에서 카드뮴으로 유도된 산화 스트레스에 대한 세포 보호 효과를 확인하고자 하였으며 陳皮의 주요 성분 화합물에 대한 분석을 실시하였다.
약리학 측면에서는 항궤양¹⁶⁾ 및 항알러지¹⁷⁾ 효과 등이 보고되었다. 본 연구에서는 간세포를 활용하여 카드뮴으로 세포 손상을 유발한 후에 陳皮의 세포 보호 작용을 확인하고자 하였으며, 효소적 및 비효소적인 항산화 활성을 통해 陳皮가 간세포 보호 작용을 나타냄을 확인하였다.
본 연구에서는 카드뮴을 처리한 간세포에서 진피추출물(CEE)이 항산화 작용과 세포 보호 활성을 나타냄을 확인하였다. 카드뮴에 의해 과다 생산된 ROS는 GSH의 고갈을 유발하였으나 진피에 의해 이러한 산화 스트레스가 억제되었다.

제안 방법

2C). CEE가 카드뮴으로 유도한 세포 독성에 미치는 영향은 CEE를 24 시간 전 처치 후, 카드뮴을 3시간 처치하여 살펴보았다. 카드뮴을 단독 처치한 군에서는 대조세포 대비 49.
1×100 ㎜)과 photodiode array detector가 연결된 Waters ACQUITYTM UPLC (Milford, MA, USA)을 사용하였다. Column의 온도는 실온에서 분석하였다. Hesperidin과 hesperitin은 280 ㎚, narigenin, narigin, narirutin은 380 ㎚에서 분석하였다.
UPLC 분석에 사용된 陳皮 표준 물질은 narigenin, narigin, narirutin, hesperidin 및 hesperitin으로 각각 1 ㎍을 1 ㎖의 methanol(HPLC용, JT BAKER)에 녹여 표준원액을 만들고, 각각의 표준원액을 ㎖ 당 1, 5, 10 ng이 함유되도록 methanol로 희석하여, 표준액으로 사용하였다. UPLC 정량용 검액은 陳皮 시료를 분쇄한 후, 균질하게 혼합하여 1 g에 70% methanol 10 ㎖에 첨가하여 1시간 동안 sonification(화신테크사, power sonic 405)하여 용출하였고 0.2 ㎛이하의 멤브레인 필터로 여과하여 검액을 제조하였다. 고성능 액체크로마토그래피(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)는 BEH C₁₈ column (1.
. 陳皮 추출물에 포함되어 있는 narigenin, narigin, narirutin, hesperidin 및 hesperitin의 함유 여부 및 함유량을 UPLC를 통해 분석하였다. 본 연구에서 이용한 陳皮에는 narigenin이 0.
고성능 액체크로마토그래피(Ultra performance liquid chromatography, UPLC)는 BEH C18 column (1.7 ㎛, 2.1×100 ㎜)과 photodiode array detector가 연결된 Waters ACQUITYTM UPLC (Milford, MA, USA)을 사용하였다.
2A, B). 또한 CEE가 HepG2 cell에서 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 10-100 ㎍/㎖ CEE를 24시간 동안 처치하여 MTT assay로 분석하였다. 그 결과, CEE의 단독 처치에 의한 세포 독성은 확인되지 않았다 (Fig.
4 ㎖/min이었다. 머무름 시간에 의한 정성분석과 피크 면적법을 이용하여 陳皮 내 활성성분의 함량을 정량하였다.
회수한 상층액은 다시 원심분리(10,000 ×g, 4℃, 15 min)하여 단백질을 포함하고 있는 상층액을 취하였다. 상층액은 SOD assay kit를 사용하여 460 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 효소 활성을 측정하였다.
세척한 세포에 0.1 g/㎖ MTT 용액을 첨가하여 37℃에서 2 시간 반응시킨 후 생성된 formazan을 DMSO로 녹여 microplate reader (Tecan, Männedorf, Switzerland)를 사용하여 570 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
세포 내 ROS 측정은 활성산소 및 과산화수소와 반응하여 dichlorofluorescein 형광을 생성하는 DCFH-DA를 이용하였다. 처치가 완료된 세포에 10 μM DCFH-DA를 30분 동안 반응시키고, trypsin으로 세포를 분리하여 black plate에 100 ㎕씩 옮겨준 다음, excitation 485 ㎚, emission 530 ㎚ 파장에서 형광강도를 측정하였다.
세포 내 ROS는 HepG2 cell에 CEE를 24시간 전 처치 후, 카드뮴을 1 시간 동안 처치한 다음 DCFH-DA로 염색하여 측정하였다. 카드뮴을 단독으로 처치하였을 때, 대조세포와 비교하여 ROS가 276.
세포 생존률은 대조세포에 대한 백분율로 다음과 같은 수식에 의해 계산하였다 [cell viability (%) = 100 × (absorbance of treated sample)/(absorbance of control)].
처치가 완료된 세포에 10 μM DCFH-DA를 30분 동안 반응시키고, trypsin으로 세포를 분리하여 black plate에 100 ㎕씩 옮겨준 다음, excitation 485 ㎚, emission 530 ㎚ 파장에서 형광강도를 측정하였다.
카드뮴으로 유도된 간세포 사멸에 대한 CEE의 보호 효과를 규명하기 위해, HepG2 cell에서 카드뮴의 농도 (100, 200, 300 μM)와 처리 시간 (1, 3 h)에 따른 세포독성 조건을 MTT assay를 통해 결정하였다.

대상 데이터

HepG2 cell은 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였으며 10% FBS, 100 units/㎖ penicillin이 포함된 DMEM 배지를 이용하여 37℃와 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 세포는 100 ㎜의 배양접시에서 80% 이상의 confluence에 도달하도록 배양하여 실험에 이용하였다.
Penicillin-streptomycin, fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)은 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
Rhodamine 123 (Rh123)은 Calbiochem (San Diego, CA, USA)에서 구입하였고, superoxide dismutase (SOD) assay kit는 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA)에서 구입하였다. GSH determination kit는 Oxis International Inc (Tampa, FL, USA)에서 구입하였고, narigenin, narigin, narirutin, hesperitin, hesperidin, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA)는 Sigma (St.
58%였다. UPLC 분석에 사용된 陳皮 표준 물질은 narigenin, narigin, narirutin, hesperidin 및 hesperitin으로 각각 1 ㎍을 1 ㎖의 methanol(HPLC용, JT BAKER)에 녹여 표준원액을 만들고, 각각의 표준원액을 ㎖ 당 1, 5, 10 ng이 함유되도록 methanol로 희석하여, 표준액으로 사용하였다. UPLC 정량용 검액은 陳皮 시료를 분쇄한 후, 균질하게 혼합하여 1 g에 70% methanol 10 ㎖에 첨가하여 1시간 동안 sonification(화신테크사, power sonic 405)하여 용출하였고 0.
陳皮는 품질 검증이 확인된 제조품(제조번호 KJP 140603-02)으로 미륭생약(경기도 포천)에서 구입하였다. 건조 중량으로 300 g의 陳皮를 정량한 후, 100% ethanol 3 L에 침지하여 24시간 동안 상온에서 추출하였으며, 陳皮 에탄올 추출물(CEE)의 최종 수율은 17.
본 연구에서 이용한 陳皮에는 narigenin이 0.42 ± 0.040 ppm, narigin이 0.34 ± 0.045 ppm, narirutin이 105.27 ± 6.283 ppm, hesperidin이 530.84 ± 4.738 ppm, hesperitin이 0.18 ± 0.006 ppm 포함되어 있었다 (Fig. 1, Table 2).
조건에서 배양하였다. 세포는 100 ㎜의 배양접시에서 80% 이상의 confluence에 도달하도록 배양하여 실험에 이용하였다.
Hesperidin과 hesperitin은 280 ㎚, narigenin, narigin, narirutin은 380 ㎚에서 분석하였다. 이동상으로는 0.1% formic acid (FA)를 함유한 acetonitrile (JT BAKER)과 물의 혼합액을 사용하였으며, Table 1의 조건으로 분석하였다. 시료는 2 ㎕를 주입하였으며, 유속은 0.

데이터처리

23 프로그램을 사용하여 one way analysis of variance (ANOVA) 분석을 실시하였다. 사후 검증은 Tukey HSD를 사용하였으며, p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판정하였다.
로 나타내었다. 유의성 검정은 윈도우용 SPSS ver. 23 프로그램을 사용하여 one way analysis of variance (ANOVA) 분석을 실시하였다. 사후 검증은 Tukey HSD를 사용하였으며, p값이 0.

이론/모형

세포 생존율은 MTT assay 법을 통해 조사하였다. HepG2 cell을 24 well plate에 1×10⁵ cells/well로 분주하여 24 시간 배양한 후, FBS가 없는 배지에 100 ㎍/㎖의 CEE를 24 시간 전 처치하였다.

성능/효과

CEE와 카드뮴을 같이 처치하였을 때 대조세포 대비 92.26 ± 6.38%로 카드뮴 단독 처치 대비 통계적으로 유의하게 감소하였고, CEE를 단독 처치하였을 때 대조세포 대비 89.88 ± 3.19%였다 (Fig. 3).
陳皮는 품질 검증이 확인된 제조품(제조번호 KJP 140603-02)으로 미륭생약(경기도 포천)에서 구입하였다. 건조 중량으로 300 g의 陳皮를 정량한 후, 100% ethanol 3 L에 침지하여 24시간 동안 상온에서 추출하였으며, 陳皮 에탄올 추출물(CEE)의 최종 수율은 17.58%였다. UPLC 분석에 사용된 陳皮 표준 물질은 narigenin, narigin, narirutin, hesperidin 및 hesperitin으로 각각 1 ㎍을 1 ㎖의 methanol(HPLC용, JT BAKER)에 녹여 표준원액을 만들고, 각각의 표준원액을 ㎖ 당 1, 5, 10 ng이 함유되도록 methanol로 희석하여, 표준액으로 사용하였다.
그 결과 카드뮴 100 μM을 3시간 동안 처치를 하였을 때 효과적으로 세포 독성이 유도되었다 (Fig. 2A, B).
대조군 세포에서 SOD 활성은 167.18 ± 37.04 U/㎖이었고, 카드뮴 3 시간 처치에 의해 SOD 활성이 68.83 ± 18.06 U/㎖으로 감소하였다.
3). 따라서 CEE에 의해 카드뮴으로 증가된 ROS가 감소함을 확인하였다.
모든 실험은 3회 이상 반복 실시하였으며 실험 결과는 mean ± S.D.로 나타내었다.
. 본 연구에 사용한 陳皮는 메탄올로 추출한 것으로 성분 분석에서 hesperidin이 가장 많이 포함되어 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 나타난 CEE의 세포 보호효과와 항산화 활성에 hesperidin이 기여하였을 것으로 사료되지만 추후 실험을 통해 hesperidin에 의한 효과를 살펴봐야 할 것이다.
간에는 카드뮴에 대해 높은 친화성을 갖는 대부분의 금속 결합 단백질(metallothionein)이 포함되어 있기 때문에 하고 있기 때문에 주로 카드뮴 축적이 간에서 발생하며²⁴⁾ 고농도의 카드뮴에 노출되었을 때 metallothionein에 결합되지 않은 카드뮴은 GSH 수준을 상당히 감소시킬 수 있는 것으로 보고되었다²⁵⁾. 본 연구에서는 세포 내 GSH의 함량을 측정한 결과 카드뮴에 의해 감소한 GSH의 함량이 CEE에 의해 증가함을 확인하였다.
초과산화 이온은 세포에 해로운 영향을 주는 자유 라디칼 음이온을 가지고 있으며, SOD는 초과산화이온을 산소와 과산화수소로 바꿔, 산화적 스트레스로부터 세포방어 작용을 나타낸다^26,27). 본 연구에서는 카드뮴으로 인해 SOD 활성이 감소되었으나 CEE에 의해 회복됨을 확인하였다.
ROS에 의한 산화 스트레스는 자외선, 전리 방사선 또는 중금속 등에 노출된 결과로 나타날 수 있으며 지질, 단백질, DNA에 대한 산화적 손상, 항산화 효소 억제 등을 통해 노화 및 세포 사멸이 일어나게 된다²⁰⁾. 본 연구에서는 카드뮴이 간세포의 사멸과 세포 내 ROS의 과다 증가를 유도하였으나 CEE의 전 처치로 인해 이러한 세포 손상과 ROS 수준의 변화가 억제됨을 확인하였다.
2D). 이 결과를 통해 CEE는 카드뮴에 의한 간세포 독성에 대해 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.
4). 이 결과를 통해 CEE는 카드뮴으로 인한 GSH 함량의 감소를 회복시킬 수 있음을 확인하였다.
5). 이 결과를 통해 카드뮴으로 인한 SOD의 활성 감소가 CEE에 의해 회복됨을 확인하였다.
이상의 결과로 카드뮴에 의해 유도된 산화적 스트레스 매개 세포 사멸에 대한 CEE의 세포 보호 효과를 확인하였다. CEE는 ROS의 증가와 GSH의 감소를 개선시키고 SOD의 효소 활성을 회복시킴으로써 카드뮴에 의한 간세포 사멸을 억제하였다.
카드뮴 3 시간 처치는 대조군 대비 GSH 함량을 78.24 ± 2.29%로 감소하였으며, CEE 전처치에 의해 GSH는 118.32 ± 1.46%로 통계적으로 유의하게 증가하였다.
카드뮴을 단독 처치한 군에서는 대조세포 대비 49.4 ± 2.9%로 세포 생존율이 감소하여 세포 독성이 확인되었다.

후속연구

본 연구에 사용한 陳皮는 메탄올로 추출한 것으로 성분 분석에서 hesperidin이 가장 많이 포함되어 있음을 확인하였다. 따라서 본 실험에서 나타난 CEE의 세포 보호효과와 항산화 활성에 hesperidin이 기여하였을 것으로 사료되지만 추후 실험을 통해 hesperidin에 의한 효과를 살펴봐야 할 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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