[논문]함초 추출물의 세포사멸 유도에 의한 난소암세포에서 항암 효과

라유리; 이유림; 이동석; 김수환; 이형선

doi:10.9721/kjfst.2021.53.1.34

[국내논문] 함초 추출물의 세포사멸 유도에 의한 난소암세포에서 항암 효과
Anti-cancer effects of Salicornia herbacea extract in OVCAR-3 cells by induction of apoptosis pathway 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.53 no.1, 2021년, pp.34 - 39

라유리 (인제대학교 일반대학원 식의약생명공학과) , 이유림 (인제대학교 일반대학원 식의약생명공학과) , 이동석 (인제대학교 일반대학원 식의약생명공학과) , 김수환 (김천대학교 헬스케어대학 임상병리학과) , 이형선 (중원대학교 의료보건대학 임상병리학과)

초록
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본 연구에서는 천연유래 물질로부터 apoptosis를 유도하여 항암 활성이 있는지에 관한 실험으로 사람 난소암 세포주인 OVCAR-3 세포에 함초의 유기용매별 추출물을 처리하여 결과를 확인하였다. MTS 측정으로 세포 생존율을 확인한 결과 DCM 분획물에서 농도별로 유의적인 세포수의 감소를 보였으며, annexin V/FITC-PI 염색에 의해 apoptosis 유도로 세포가 사멸함을 확인하였다. DCM 분획물 처리는 세포주기에서 Sub-G1기의 증가로 세포증식이 억제됨을 보여준다. 세포의 내인성 경로에 관여하는 Bcl-2 family에 속하는 Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL의 상호작용을 mRNA 수준에서 확인한 결과, DCM 분획물처리에서 Bax, Bak가 증가하고, Bcl-2의 감소를 동반하여 세포사멸의 신호전달 경로가 진행됨을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과를 바탕으로 함초를 이용하여 여성의 난소암에 예방적 기능성 식품을 개발할 수 있을 것으로 판단되며, 함초의 DCM 분획물에 대해 깊이 있는 심층적 연구가 요구된다.

Abstract ▼ AI-Helper

This study investigated the anti-cancer effects of Salicornia herbacea L. fractions in human ovarian cancer cells (OVCAR-3). S. herbacea powder was extracted with 95% EtOH and sequentially fractionated with hexane, dichloromethane (DCM), ethyl acetate, butanol, and H2O. Further, the growth inhibitory effects of the six fractions were determined using the MTS assay. The DCM fraction dramatically decreased cell viability. Similarly, the cell cycle was arrested at the subG1 phase in DCM-treated cells. To confirm apoptosis, the cells were stained with annexin V/FITC-PI solution. Total, early, and late apoptotic cells were significantly increased in the DCM fraction. The mRNA expression of Bcl-2 was reduced, whereas the pro-apoptotic factors Bax and Bak were increased in DCM fraction-treated cells. These results indicated that the DCM fraction in S. herbacea exhibited strong apoptotic effects through the p53-dependent signaling pathway.

Keyword

표/그림 (5)

$Fig. 1. The effect of O. japonicus on viability of OVCAR-3 cells by MTS assay. The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H2O) and different concentration (0, 25, 50, 100, and 150 μg/mL) for 24 h. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).$ 그림 Fig. 1. The effect of O. japonicus on viability of OVCAR-3 cells by MTS assay. The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H₂O) and different concentration (0, 25, 50, 100, and 150 μg/mL) for 24 h. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).
$Fig. 2. The effect of O. japonicus on apoptotic activity of OVCAR-3 cells by annexin V-PI stain. The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H2O) respectively by 100 μg/mL for 15 h. (B) and (C) Percent of early, late and total apoptosis was indicated using bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p <0.05).$ 그림 Fig. 2. The effect of O. japonicus on apoptotic activity of OVCAR-3 cells by annexin V-PI stain. The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H₂O) respectively by 100 μg/mL for 15 h. (B) and (C) Percent of early, late and total apoptosis was indicated using bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p <0.05).
$Fig. 3. The effect of O. japonicus on cell cycle analysis of OVCAR-3 cells by PI stain. (A) The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H2O) respectively by 100 μg/mL for 15 h. (B) and (C) Cell cycle and sub-G1 phase arrest present were indicated using bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).$ 그림 Fig. 3. The effect of O. japonicus on cell cycle analysis of OVCAR-3 cells by PI stain. (A) The cells were treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H₂O) respectively by 100 μg/mL for 15 h. (B) and (C) Cell cycle and sub-G1 phase arrest present were indicated using bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).
$Fig. 4. The effect of O. japonicus fractions on mRNA level analysis of OVCAR-3 cells. The cells were measured mRNA level of Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-xL treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H2O) respectively by 100 μg/mL.$ 그림 Fig. 4. The effect of O. japonicus fractions on mRNA level analysis of OVCAR-3 cells. The cells were measured mRNA level of Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-xL treated with various fractions (EtOH, Hex, DCM, EtOAc, BuOH, H₂O) respectively by 100 μg/mL.
$Fig. 5. The effect of O. japonicus DCM fraction on mRNA level analysis of OVCAR3 cells. (A and C) The cells were measured mRNA level of Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-xL treated with DCM fraction (0, 50, 100, and 150 μg/mL). (B and D) And, density of mRNA band was indicated by bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).$ 그림 Fig. 5. The effect of O. japonicus DCM fraction on mRNA level analysis of OVCAR3 cells. (A and C) The cells were measured mRNA level of Bax, Bak, Bcl-2, and Bcl-xL treated with DCM fraction (0, 50, 100, and 150 μg/mL). (B and D) And, density of mRNA band was indicated by bar charts. Significant evaluation was indicated from control by t-test (*p<0.05).

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 함초가 함유한 성분을 다양한 유기용매로 추출 ·분리하여 난소암 세포 사멸에 대한 생리활성을 평가하고자 하였다. 난소암 세포의 증식에 미치는 영향과 세포주기조절과 내인성신호전달 경로를 통한 세포사멸 유도 작용의 기전을 조사하였다.

제안 방법

난소암 세포의 증식에 미치는 영향과 세포주기조절과 내인성신호전달 경로를 통한 세포사멸 유도 작용의 기전을 조사하였다.
1)로 여과 후 회전식 감압농축기(Laborata 4000, Heidolph Instruments, Schwabach, Germany)로 에탄올을 최대한제거하였다. 추출물은 다시 물에 용해시켜 핵산(Hex), 디클로로메탄(DCM), 에틸아세테이트(EtOAc), 부탄올(BuOH), 물(H₂O) 순으로 계층 분획 하고 유기용매를 감압농축기로 완전히 제거하여건조하였다. 세포실험에 시용하기 위해 dimethyl sulfoxide (DMSO) 에 150 mg/mL로 제조하여 −20 C에 보관하였다.
OVCAR-3 세포주에 함초 용매별 추출물의 세포독성을 확인하기 위해 세포 생존율을 측정하였다. 96-well plate에 2.
5×10 /mL의 밀도로 세포를 분주하여 24시간 부착시킨 후 SFM (serum free media)를 처리하여 안정화시켰다. 용매별 함초 추출물을 농도별 (0, 25, 50, 100, 150µg/mL) 로 24시간 처리하여 반응시켰다. 반응이 끝난 배지에 MTS 시약을 10 µL씩 분주하고 3시간 후 490 nm 파장의 흡광도를 측정하였다(FilterMax F5 Multi-Mode microplate reader, Molecular devices, San Jose, CA, USA).
세포를 회수하여 1×cell cycle assay (CCA) buffer 로 처리 후 70% 에탄올로 30분간 고정시켰다. 고정된 세포에 PI 시약으로 어두운 곳에서 30분간 염색하여 20 µL를 슬라이드 챔버에 적하시켜 Cellometer K2 장비(Nexelom bioscience, Lawrence, MA, USA)로 결과를 측정하였다.
세포사멸은 annexin V/FITC-PI staining kit (Biovision, Milpitas, CA, USA)를 이용해 측정하였다. 6-well plate에 2.
세포를 회수하여 1×PBS로 2번 씻어낸 후 70% 에탄올로 30분간 고정시켰다. 고정된 세포에 annexin V/FITC-PI 시약으로 어두운 곳에서 30분간 염색하여 20 µL를 슬라이드 챔버에 적하시켜 Cellometer K2 장비(Nexelom bioscience)로 결과를 측정하였다.
5×10 /mL의 밀도로 세포를 분주하여 24시간 부착시킨 후 SFM 를 처리하여 안정화시켰다. 용매별 함초 추출물을 농도별(0, 50, 100, 150µg/mL) 로 24시간 처리하여 반응시킨 후 1mL의 TRIzol 시약(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA)으로 세포를 회수하였다. TRIzol 시약에 회수된 세포는 10분간 실온에서 반응시킨 후 200µL의 클로로포름을 첨가하여 강하게 진탕 반응하여 14, 000×g로 15분간 원심분리 하여 맑은 상층을 새로운 시험관으로 옮겼다.
TRIzol 시약에 회수된 세포는 10분간 실온에서 반응시킨 후 200µL의 클로로포름을 첨가하여 강하게 진탕 반응하여 14, 000×g로 15분간 원심분리 하여 맑은 상층을 새로운 시험관으로 옮겼다. 상층액과 500µL의 이소프로판올을 섞어 10분간 반응시키고 다시 원심분리하여 얻은 pellete 70% 에탄올로 2번 씻어내고 DEPC-DW에 부유시켜 총 RNA를 얻었다. 1µg 농도의 RNA 는 AccuPower RT Premix kt (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 AccuPower Taq PCR Premix kit (Bioneer) 와 타겟 프라이머(Bax; Bcl-2-associated X protein (Bax), Bcl-2 homologous antagonist killer (Bak), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), B-cell lymphoma-extra large (BclxL))를 이용하여 증폭하였다.
상층액과 500µL의 이소프로판올을 섞어 10분간 반응시키고 다시 원심분리하여 얻은 pellete 70% 에탄올로 2번 씻어내고 DEPC-DW에 부유시켜 총 RNA를 얻었다. 1µg 농도의 RNA 는 AccuPower RT Premix kt (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 AccuPower Taq PCR Premix kit (Bioneer) 와 타겟 프라이머(Bax; Bcl-2-associated X protein (Bax), Bcl-2 homologous antagonist killer (Bak), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), B-cell lymphoma-extra large (BclxL))를 이용하여 증폭하였다. 증폭이 끝난 생성물은 EtBr이 첨가된 1-2% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 결과를 이미지 장치(Davinch-Western Imaging System, Seoul, Korea)로 확인하였다.
1µg 농도의 RNA 는 AccuPower RT Premix kt (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 AccuPower Taq PCR Premix kit (Bioneer) 와 타겟 프라이머(Bax; Bcl-2-associated X protein (Bax), Bcl-2 homologous antagonist killer (Bak), B-cell lymphoma 2 (Bcl-2), B-cell lymphoma-extra large (BclxL))를 이용하여 증폭하였다. 증폭이 끝난 생성물은 EtBr이 첨가된 1-2% 아가로즈 겔에 전기영동 하여 결과를 이미지 장치(Davinch-Western Imaging System, Seoul, Korea)로 확인하였다.
있음이 보고되고 있다. 함초가 OVCAR-3 세포주의 증식에 미치는 영향을 알아보기 위해 OVCAR-3 세포에 함초 용매별 추출물을 농도 별로 24시간 처리하여 MTS assay를 통해 결과를 확인하였다(Fig. 1). 다른 용매 분획물과 달리 DCM 분획물에서 세포의 생존율이 농도의존적으로 감소하였다.
또한, EtOAc 분획물의 150µg/mL의 고농도에서도 세포의 생존율이 50% 이하로 급격히 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 이러한 DCM과 EtOAc 분획물 처리에 의한 현상이 apoptosis 활성에 의한 것인지 annexine V/FITC-PI 염색 실험을 추가적으로 실시하여 확인하였다.
MTS 측정을 통해 확인된 결과가 apoptosis에 의해 나타난 결과인지 확인하기 위해 annexin V/FITC-PI staining을 이용하여 세포를 측정하였다. Apoptosis 현상에 의해 세포 사멸이 유도되면 표면에 phospatidylserine 이 노출되어 annexin V/FITC에 의해 강하게 염색되고, PI는 사멸된 세포내로 들어가 핵을 염색한다(Guon 과 Chung, 2014; Kim 등, 2013).
세포사멸의 유도는 이들 인자의 상호작용에 의해서 미토콘드리아 외막에 이상을 초래하여 cytochrome c가 세포질로 방출되어 일어난다(Park과 Kang, 2015). 함초 유기 용매별 추출물을 100µg/mL로 처리하고 24시간 배양 후 RT-PCR을 통해 Bax, Bak, Bcl-2, Bcl-xL의 발현 정도를 확인하였다. 실험 결과 Bax는 정상군에 비해 증가하였으나 용매별 추출물에서 뚜렷한 차이를 확인하기 어려웠다.

대상 데이터

인간 난소암 세포주인 OVCAR-3 세포는 한국 세포주 은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하여 실험하였다. OVCAR-3 세포는 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin 이 첨가된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37 C, 5% CO₂ 배양기에서 2-3일 간격으로 계대 배양하였다.
농장에서 가공하여 건조한 함초가루를 다사랑함초코리아에서직접 구입하였다. 함초가루 200g을 에탄올 2L에 침지하여 95 C 에서 3시간 3회 반복 추출하였다.
세포주기는 cell cycle kit 와 PI 시약(Biovision, Milpitas, CA, USA)을 이용해 측정하였다. 6-well plate에 2.

데이터처리

모든 실험은 3회 반복 실시하였으며 평균±표준편차로 표시하였다. 실험대상간의 통계적 유의성은 Student’s t-test를 이용하여 p-value를 구하였고, p<0.
실험대상간의 통계적 유의성은 Student’s t-test를 이용하여 p-value를 구하였고, p<0.05 이하인 경우 *로 표기하여 유의성을 표시하였다.

이론/모형

세포사멸과 관련된 타켓 mRNA는 reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)을 이용해 확인하였다. 6-well plate에 2.

성능/효과

다른 용매 분획물과 달리 DCM 분획물에서 세포의 생존율이 농도의존적으로 감소하였다. 또한, EtOAc 분획물의 150µg/mL의 고농도에서도 세포의 생존율이 50% 이하로 급격히 떨어지는 것을 볼 수 있었다. 이러한 DCM과 EtOAc 분획물 처리에 의한 현상이 apoptosis 활성에 의한 것인지 annexine V/FITC-PI 염색 실험을 추가적으로 실시하여 확인하였다.
Apoptosis 현상에 의해 세포 사멸이 유도되면 표면에 phospatidylserine 이 노출되어 annexin V/FITC에 의해 강하게 염색되고, PI는 사멸된 세포내로 들어가 핵을 염색한다(Guon 과 Chung, 2014; Kim 등, 2013). 함초 유기용매별 추출물을 100 µg/mL로 처리하고 15시간 배양 뒤 apoptosis가 일어난 세포를 측정한 결과, DCM 분획물에서 early와 late apoptosis 활성이 1.68%, 25.85%로 가장 높게 나타났다(Fig. 2). 세포사멸 활성이 있던 EtOAc를 포함한 그 외 다른 분획물들은 정상군과 유의적인 차이를 확인할 수 없었다.
세포사멸 활성이 있던 EtOAc를 포함한 그 외 다른 분획물들은 정상군과 유의적인 차이를 확인할 수 없었다. 결과적으로 함초 유기용매 추출물 중 DCM 분획물에서 가장 뛰어난 세포사멸 활성이 있는 것으로 판단된다.
항암 연구에서 세포증식 억제는 세포주기조절과 밀접한 관련이 있으며 apoptosis가 유도되면 세포의 다양한 단계에서 증식의 멈춘다(Xie과 Yang, 2014). 함초 유기용매별 추출물을 100µg/mL로 처리하고 15시간 배양 뒤 세포주기의 변화를 측정한 결과, 정상군보다 DCM 분획물에서 의미있게 Sub-G1기가 증가하는 현상을 확인할 수 있었다 (Fig. 3). 결과적으로 DCM 분획물 처리에 의해 난소암 세포가 Sub-G1기에 머물러 증식이 억제 될 것으로 판단된다.
3). 결과적으로 DCM 분획물 처리에 의해 난소암 세포가 Sub-G1기에 머물러 증식이 억제 될 것으로 판단된다.
4). DCM 분획물을 농도별(0, 50, 100, 150µg/ mL)로 처리하여 확인한 결과, Bax, Bak는 농도의존적으로 유의성 있는 증가를 보였고, Bcl-2의 의미있는 감소와 Bcl-xL의 변화 없음을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 이들 결과를 종합해보면 anti- apoptosis인 Bcl-2의 감소와 pro-apoptosis인 Bax, Bak의 증가로 미토콘드리아에 막 투과성이 야기되어 cytochrome c의 방출을 유도로 세포사멸의 신호전달 경로가 진행될 것을 알 수 있다.
5). 이들 결과를 종합해보면 anti- apoptosis인 Bcl-2의 감소와 pro-apoptosis인 Bax, Bak의 증가로 미토콘드리아에 막 투과성이 야기되어 cytochrome c의 방출을 유도로 세포사멸의 신호전달 경로가 진행될 것을 알 수 있다. 함초 DCM 분획물 처리에 의한 anti-apoptotic 유전자와 pro-apoptotic 유전자의 상호작용은 결과적으로 내인성 경로를 통한 세포사멸 활성을 주도하여 난소암에 대한 항암 활성을 보이는 것으로 판단된다.
이들 결과를 종합해보면 anti- apoptosis인 Bcl-2의 감소와 pro-apoptosis인 Bax, Bak의 증가로 미토콘드리아에 막 투과성이 야기되어 cytochrome c의 방출을 유도로 세포사멸의 신호전달 경로가 진행될 것을 알 수 있다. 함초 DCM 분획물 처리에 의한 anti-apoptotic 유전자와 pro-apoptotic 유전자의 상호작용은 결과적으로 내인성 경로를 통한 세포사멸 활성을 주도하여 난소암에 대한 항암 활성을 보이는 것으로 판단된다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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