[논문]Tumor necrosis factor α - induced protein3의 발현과 NF-κB 활성 억제를 통한 동과자의 염증반응 억제 효과

김균하; 최준용; 주명수

doi:10.15188/kjopp.2021.02.35.1.15

Tumor necrosis factor α - induced protein3의 발현과 NF-κB 활성 억제를 통한 동과자의 염증반응 억제 효과
Donggwaja Suppresses Inflammatory Reaction Via Tumor Necrosis Factor α-induced Protein3 and NF-κB 원문보기

동의생리병리학회지 = Journal of physiology & pathology in Korean Medicine, v.35 no.1, 2021년, pp.15 - 21

김균하 (부산대학교 한방병원 한방내과) , 최준용 (부산대학교 한방병원 한방내과) , 주명수 (부산대학교 한의학전문대학원)

Abstract ▼ AI-Helper

Donggwaja (Benincasae Semen), the seed of Benincasa hispida (Thunb.) Cogn., has been used in Korean traditional medicine to control the body heat and water retention caused by various diseases. Both the symptoms targeted by the herbal medicine in clinic and studies with disease mouse models support the potential anti-inflammatory effect of Donggwaja. However, it is less understood how Donggwaja exerts its possible anti-inflammatory effect. Here, we present evidence that Donggwaja suppresses macrophage inflammatory reactions via expressing tumor necrosis factor a-induced protein 3 (TNFAIP3 or A20) and suppressing NF-kB activity. The ethanol extract of Donggwaja (EED) showed no toxicity when added to RAW 264.7 cells less than 100mg/ml. When treating the cells for 16 h, EED significantly suppressed the nuclear localization of NF-kB, suggesting that EED suppresses NF-kB activity. Concordantly, a semi-quantitative RT-PCR analysis showed that EED decreased the expression of prototypic pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor (TNF)-a, IL(interleukin)-6, and IL-1b. EED induced in RAW 264.7 cells the expression of A20, a ubiquitin modulator that suppresses inflammatory signaling cascades initiated from TLR4 and TNF and IL-1 receptors, while not affecting the induction of Nrf2, an anti-inflammatory factor that could suppress the effect of NF-kB. These results suggest that EED exerts its suppressive effect on inflammation, at least in part, by expressing anti-inflammatory factor A20 and suppressing pro-inflammatory factor NF-kB activity.

주제어

표/그림 (5)

그림 Fig. 1. Cytotoxicity of Donggwaja. RAW 264.7 cells were treated with various amounts of Donggwaja for 24 h. Cytotoxicity was determined by measuring the cell viability. Data represent the mean ± SEM of three independent measurements.
그림 Fig. 2. Donggwaja interferes with the nuclear translocation of NF-kB. RAW 264.7 cells were treated with 10 μg/ml or 50 μg/ml of Donggwaja for 16 h and then with LPS (100 ng/ml) for 15 min or 30 min. Nuclear NF-kB was measured by western blotting of p65 RelA, a key component of NF-kB (A), the blot of which was analyzed by densitometor (B). *P was < 0.05 compared to the control treated with LPS for 15 min, and **P was < 0.05 compared to the control treated with LPS for 30 min. Data represent the mean ± SEM of three independent measurements.
그림 Fig. 3. Donggwaja suppresses the expression of prototypic inflammatory cytokines. RAW 264.7 cells were treated with two different amounts of Donggwaja for 16 h and then 100 ng/ml of LPS. Two hours after LPS treatment, total RNA was extracted and the mRNAs of TNF-α, IL-1β, IL-6 mRNA were amplified by semi- quantitative RT-PCR (A). PCR products were run on an agarose-gel, the image of which was subject to densitometric analysis (B). *P was < 0.05 compared to the LPS-treated control. Data represent the mean ± SEM of three independent measurements.
그림 Fig. 4. Donggwaja induces the expression of A20. RAW 264.7 cells were treated with Donggwaja (50 μg/ml). Total proteins were analyzed for A20 by western blot.
그림 Fig. 5. Effect of Donggwaja on anti-inflammatory factor Nrf2. RAW 264 cells (A) and reporter cell line (B) were treated with two different amounts of Donggwaja and sulforaphane (5 mM) for 16 h. The nuclear localization of Nrf2 and the induction of Nrf2-dependent luciferase expression were measured by western blot and luciferase reporter assay, respectively. * No statistical significance was found, compared to untreated control. Data in the graph (B) represent the mean ± SEM of three independent measurements.

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

Nrf2는대표적인 염증 억제인자이다. 따라서 이 실험에서는 동과자 추출물이 염증억제 인자 Nrf2의 발현을 촉진함으로써 염증을 억제할 가능성을 조사하였다. RAW 264.
비록 이 연구 결과들이 동과자의 항염증 효과를 비롯하여 다양한 효능을 가지고 있을 가능성을 제시하지만, 구체적이고 다양한 항염증 기전을 제시하지는 못하였다. 본 연구 결과는 동과자가 A20의 발현을 유도하고 NF-kB의 활성을 억제함으로써 염증을 억제할 가능성을 구체적으로 제시한다.
본 연구는 동과자가 염증억제인자 A20의 발현을 유발하고 염증 촉진인자 NF-κB의 활성을 억제함으로써 대식세포의 주요 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다. 이 결과는 동과 자가 적어도 대식세포의 염증반응을 억제함으로써 염증질환 치료에 기여할 수 있음을 시사한다.
본 연구에서는 동과자의 항염증 효과를 세포 실험으로 확인하고, 구체적인 염증억제 기전을 규명하고자 하였다. 대식세포인 RAW 264.
그러나 동과자가 어떤 기전으로 사이토카인과 염증 촉진 인자의 생성을 억제하는 지에 대해 잘 알려져 있지 않다. 본연구에서는 동과자 에탄올 추출물을 이용하여 동과자가 TNFAIP3 의 발현을 유도하고, NF-κB 활성을 억제함으로써 염증조절에 기여할 가능성에 대한 실험적 근거를 제시하고, 이를 통해 고전에 기록된 동과자 약효에 대해 실험적 근거를 마련하고자 한다.
위 결과에서 동과자 추출물이 NF-kB의 활성을 억제하였으므로 이번 실험에서는 동과자 추출액이 상위 억제 signal을 활성하여 NF-kB 활성을 억제할 가능성을 조사하였다. TNFAIP3 (A20)는 TLR4에 결합하는 adaptor molecule을 조절하여 NF-kB 활성을 억제하므로 동과자 추출물이 A20의 발현을 조절할 가능성을 조사하였다.
활성화 된 NF-kB는 세포질에서 핵으로 이동하여 염증반응에 관여하는 다양한 유전자를 전사 한다¹⁹⁾. 이 실험에서는 동과자추출물이 NF-kB 활성을 억제함으로써 염증을 억제할 가능성을 조사하였다. RAW 264.

제안 방법

세포 독성을 확인하였다. 24-well에 RAW 264.7 세포를 배양하고 동과자 추출물 0, 10, 25, 50, 100 μg/ml 농도로 처리하였다. 처리 24시간 후, CCK-8 kit를 이용하여 세포의 생존율을 microplate reader를 이용하여 측정하였다.
5 % NP-40 cell lysis buffer를 이용하여 추출하였고, nuclear proteine NE-PER™ nuclear extraction kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출하였다. Bradford assay로 정량 후 동일 양의 단백질을 NuPAGE gel (Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 Polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 transfer하여, 1 차와 2차 antibody를 사용하여 단백질 발현을 분석하였다.
96-well plate에 세포를 분주하고, 동과자 추출액을 농도별로 처리한 후, 24시간 배양하였다. CCK-8 시약을 첨가한 후, 4 시간 동안 추가 배양하고 microplate reader (Model 550, Bio-Rad, Richmond, USA)를 이용하여 450 nm 흡광도에서 세포 독성을 측정하였다.
7 cells were treated with various amounts of Donggwaja for 24 h. Cytotoxicity was determined by measuring the cell viability. Data represent the mean ± SEM of three independent measurements.
2 % agarose gel에 전기영동하고 SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen)으로염색 후 blue light에서 band를 확인하였다. GAPDH를 유전자 발현의 control로 사용하였고, Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 발현 정도를 수치화 하였다.
24-well에 배양한 reporter 세포에 동과자 추출물을 처리하고 16 시간 후 Luciferase assay kit (Promega, USA)의 lysis buffer를 사용하여 용해시킨다. Kit에 소개된 방법에 따라 cell lysate 와 luciferase를 반응 시킨 후 luminometer로 측정하였다.
7 세포를 동과자 추출액 (10 μg/ml 또는 50 μg/ml)과 Nrf2 활성물질인 sulforaphane (SFN, 5mM)으로 16시간 처리하였다. Nrf2가 활성화되면 핵으로 이동하므로 nuclear protein을 추출하여 western blotting으로 nuclear Nrf2를 확인하였다. Fig.
Nrf2에 의해 유도되는 NQO₁의 발현을 NQO₁/luciferase reporter cell을 사용하여 확인하였다¹⁸⁾. 24-well에 배양한 reporter 세포에 동과자 추출물을 처리하고 16 시간 후 Luciferase assay kit (Promega, USA)의 lysis buffer를 사용하여 용해시킨다.
이 실험에서는 동과자추출물이 NF-kB 활성을 억제함으로써 염증을 억제할 가능성을 조사하였다. RAW 264.7 세포를 10 μg/ml과 50 μg/ml의 동과자 추출액으로 16시간 처리한 후, 100 ng/ml 농도의 LPS로 15분과 30 분 처리하여 NF-kB를 활성화시켰다. 활성 된 NF-kB는 핵으로 이동하므로 처리된 세포에서 nuclear protein을 추출하고 NF-kB의대표적 subunit인 p65 RelA 단백질을 western blot으로 조사하고 (Fig.
따라서 이 실험에서는 동과자 추출물이 염증억제 인자 Nrf2의 발현을 촉진함으로써 염증을 억제할 가능성을 조사하였다. RAW 264.7 세포를 동과자 추출액 (10 μg/ml 또는 50 μg/ml)과 Nrf2 활성물질인 sulforaphane (SFN, 5mM)으로 16시간 처리하였다. Nrf2가 활성화되면 핵으로 이동하므로 nuclear protein을 추출하여 western blotting으로 nuclear Nrf2를 확인하였다.
이 결과를 재확인하기 위해 Nrf2-reporter cell line을 이용하여 Nrf2의 활성 여부를 조사했다. RAW 264.7 세포에 Nrf2에 의해 조절되는 NQO₁ 유전자의 promoter와 luciferase reporter 유전자를 가지는 plasmid를 stable transfection하여 만든 NQO₁-luciferase reporter cell line을 두 가지 농도의 동과자 추출액으로 처리하고 16시간 후에 luciferase activity를 측정하였다. Fig.
TNFAIP3 (A20)는 TLR4에 결합하는 adaptor molecule을 조절하여 NF-kB 활성을 억제하므로 동과자 추출물이 A20의 발현을 조절할 가능성을 조사하였다. RAW264.7 세포를 TNF-α (10 ng/ml, 8h) 또는 동과자추출물 (50 μg/ml, 16h)로 처리한 후, A20 단백질의 발현을 western blot으로 조사하였다. Fig.
활성을 억제할 가능성을 조사하였다. TNFAIP3 (A20)는 TLR4에 결합하는 adaptor molecule을 조절하여 NF-kB 활성을 억제하므로 동과자 추출물이 A20의 발현을 조절할 가능성을 조사하였다. RAW264.
Total RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출한 후 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 1:5 end-point dilution한 후 TaqPCRx DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와유전자 특이적인 primer를 이용하여 각 유전자의 발현을 조사하였다.
Total proteine 0.5 % NP-40 cell lysis buffer를 이용하여 추출하였고, nuclear proteine NE-PER™ nuclear extraction kit (Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 추출하였다. Bradford assay로 정량 후 동일 양의 단백질을 NuPAGE gel (Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동 하였다.
Total RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출한 후 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA는 1:5 end-point dilution한 후 TaqPCRx DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와유전자 특이적인 primer를 이용하여 각 유전자의 발현을 조사하였다. PCR에 사용된 primer는 COSMOGENETH (서울, 대한민국) 에주문제작하여 사용하였다.
IL-1β 발현과 유사하게 10 μg/ml의 동과자 추출액을 처리할 경우 IL-6 발현이 억제되었으나 그 정도는 약했다(lane 4와 5), 그러나 50 μg/ml의 동과자 추출액을 처리할 경우, IL-6 발현을 강하게 억제하였다(lane 6). 동과자 추출물에 의한 사이토카인 발현억제는 densitometric 분석으로 재확인하였다(Fig. 3B). 이 결과는 동과 자가 염증촉진 인자인 NF-kB 활성을 억제하여 NF-kB에 의해 조절되는 염증촉진 사이토카인 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다.
실험에 적합한 동과자 에탄올 추출물의 농도를 결정하기 위해 먼저 세포 독성을 확인하였다. 24-well에 RAW 264.
유전자의 발현은 semi-quantitative RT-PCR을 이용하여 확인하였다. Total RNA를 RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 추출한 후 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다.
5A에서 보듯이 동과자는 Nrf2 발현을 유도하지 못했다. 이 결과를 재확인하기 위해 Nrf2-reporter cell line을 이용하여 Nrf2의 활성 여부를 조사했다. RAW 264.
동과자 추출물은 NF-kB의 핵 이동을 억제하였으므로 NF-kB 가 조절하는 염증성 사이토카인의 발현을 억제할 가능성이 있다. 이를 확인하기 위해 동과자를 RAW264.7 세포에 10 μg/ml 또는 50 μg/ml의 농도로 16시간 처리한 한 후 100ng/ml의 LPS를 2시간 처리하였다. 처리 후, total RNA를 추출하고 semi-quantitative RT-PCR 방법으로 TNF-α, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현을 확인하고 (Fig.
Bradford assay로 정량 후 동일 양의 단백질을 NuPAGE gel (Thermo Fisher Scientific)에서 전기영동 하였다. 전기영동 후 Polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane에 transfer하여, 1 차와 2차 antibody를 사용하여 단백질 발현을 분석하였다.
총 cyclee 25였다. 증폭된 DNA는 1.2 % agarose gel에 전기영동하고 SYBR safe DNA gel stain (Invitrogen)으로염색 후 blue light에서 band를 확인하였다. GAPDH를 유전자 발현의 control로 사용하였고, Image J (NIH, Bethesda, MD, USA) 소프트웨어를 이용하여 발현 정도를 수치화 하였다.
7 세포를 배양하고 동과자 추출물 0, 10, 25, 50, 100 μg/ml 농도로 처리하였다. 처리 24시간 후, CCK-8 kit를 이용하여 세포의 생존율을 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 실험결과, 최고 10 0 μg/ml의 농도로 처리한 세포의 생존률은 처리하지 않은 대조군 세포의 생존율과 유의적 차이가 없었다(Fig.
7 세포에 10 μg/ml 또는 50 μg/ml의 농도로 16시간 처리한 한 후 100ng/ml의 LPS를 2시간 처리하였다. 처리 후, total RNA를 추출하고 semi-quantitative RT-PCR 방법으로 TNF-α, IL-1β, IL-6의 mRNA 발현을 확인하고 (Fig. 3A) 이를 densitometric 분석하여 통계적 유의성을 조사하였다(Fig. 3B). Fig.
7 세포를 10 μg/ml과 50 μg/ml의 동과자 추출액으로 16시간 처리한 후, 100 ng/ml 농도의 LPS로 15분과 30 분 처리하여 NF-kB를 활성화시켰다. 활성 된 NF-kB는 핵으로 이동하므로 처리된 세포에서 nuclear protein을 추출하고 NF-kB의대표적 subunit인 p65 RelA 단백질을 western blot으로 조사하고 (Fig. 2A) 그 결과를 densitometer를 이용하여 분석하였다 (Fig. 2B). Fig 2A에서 보는 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않은 세포 (lane 1)나 동과자 추출액 만을 처리한 세포 (lane 2와 3)에서는 NF-kB의 활성이 보이지 않았다.

대상 데이터

MN, USA)에서 각각 구입하였다. Nrf2 활성 물질인 sulforaphanee Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하여 사용하였다. Western blot에 사용된 Nrf2 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였으며, 그 외 p65 RelA (NF-kB), A20 (TNFAIP3), actin, lamin B 항체와 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
cDNA는 1:5 end-point dilution한 후 TaqPCRx DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 와유전자 특이적인 primer를 이용하여 각 유전자의 발현을 조사하였다. PCR에 사용된 primer는 COSMOGENETH (서울, 대한민국) 에주문제작하여 사용하였다. 유전자 특이적 primer sequence는 다음과 같다.
RAW 264.7 세포는 American Type culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. RAW 264.
7 세포는 American Type culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하였다. RAW 264.7 세포배양은 L-glutamine (200 mg/L), 10 % (v/v) heat- inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 과 100 μg/ml streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 등이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)을 사용하였다. 세포는 37℃, 5 % CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였고 계대 수 (passage number) 15 회 미만의 세포를 실험에 사용하였다.
TLR4에 특이적으로 결합하는 대장균 내독소 (TLR4-specific LPS, Escherichia coli O₅₅:B5)와 human TNF-α는 Alexis Biochemical (San Diego, CA, USA)와 R&D systems (Minneapolis, MN, USA)에서 각각 구입하였다. Nrf2 활성 물질인 sulforaphanee Sigma-Aldrich Co.
Louis, MO, USA) 에서구입하여 사용하였다. Western blot에 사용된 Nrf2 항체는 Abcam (Cambridge, UK)에서 구입하였으며, 그 외 p65 RelA (NF-kB), A20 (TNFAIP3), actin, lamin B 항체와 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.
동과자 (Benincasae Semen)를 ethyl alcohol 95.0 % 용매로 추출한 추출물 (CA04-010)을 한국식물추출물은행 (Korea Plant Extract Bank)으로 부터 분양 받아 사용하였다.
7 세포배양은 L-glutamine (200 mg/L), 10 % (v/v) heat- inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 U/ml penicillin 과 100 μg/ml streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 등이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)을 사용하였다. 세포는 37℃, 5 % CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였고 계대 수 (passage number) 15 회 미만의 세포를 실험에 사용하였다.
총 cyclee 25였다. 증폭된 DNA는 1.

데이터처리

그룹 간 유의성 분석을 위해 one-way analysis of variance (ANOVA) (InStat, Graphpad Software, Inc., San Diego, CA)를시행하였고, 사후분석은 Turkey test를 사용하였다. 모든 검정에서 p<0.

이론/모형

동과자 추출물의 세포독성을 평가하기 위해 Cell Counting Kit-8 (CCK-8, Enzo)를 사용하였다. 96-well plate에 세포를 분주하고, 동과자 추출액을 농도별로 처리한 후, 24시간 배양하였다.

성능/효과

처리 24시간 후, CCK-8 kit를 이용하여 세포의 생존율을 microplate reader를 이용하여 측정하였다. 실험결과, 최고 10 0 μg/ml의 농도로 처리한 세포의 생존률은 처리하지 않은 대조군 세포의 생존율과 유의적 차이가 없었다(Fig. 1). 이 결과는 동과자 추출물 100 μg/ml 농도 범위 내에서는 세포 독성을 거의 보이지 않았음을 보여준다.
3B). 이 결과는 동과 자가 염증촉진 인자인 NF-kB 활성을 억제하여 NF-kB에 의해 조절되는 염증촉진 사이토카인 유전자의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다.
사이토카인의 발현을 억제할 수 있음을 보여준다. 이 결과는 동과 자가 적어도 대식세포의 염증반응을 억제함으로써 염증질환 치료에 기여할 수 있음을 시사한다.
동과자 에탄올 추출물은 NF-κB 활성을 억제하는 A20의 발현을 유발시켰으나 항염증 인자인 Nrf2는 활성 시키지 않았다. 이 결과는 동과자가 A20의 발현을 촉진하고 NF-κB의 활성을 억제함으로써 염증반응 억제에 기여할 가능성을 보여준다.
4에서 보는 바와 같이, 동과자추출액은 TNF-α와 유사하게 A20의 발현을 유발하였다 (lane 2와 3). 이 결과는 동과자가 A20의 발현을 촉진함으로써 NF-kB 활성을 억제하는데 기여했을 가능성을 보여준다.

후속연구

예를 들어, 동과자에 의해 A20이 발현되면 A20은 IKK의 기능을 억제하고 결과적으로 NF-κB 활성을 억제하는 것으로 알려져 있지만 동과자가 직접 IKK의 기능을 억제함으로써 NF-κB 활성을 억제할 가능성도 배제할 수 없다. 동과자에 의해 IKK의 활성이 직접적으로 억제되는 지 여부를 조사하면 동과자에 의한 A20의 발현과 NF-κB 활성 억제가 독립적으로 발생하는지 또는 A20 발현의 결과로 NF-κB 활성이 억제되는지 여부를 규명할 수 있을 것이다. 한편, NF-κB 활성은 대표적인 항염증 인자 Nrf2에 의해 감소될 수 있다.
그러므로 동과 자의 염증성 질환 치료효과는 다양한 질환 동물 모델을 이용한 연구를 통해 규명이 필요하다. 본 연구의 한계는 염증성 질환 동물 모델을 사용하는 대신, 대식세포에 의한 염증반응 조절에 중점을 두고 있다는 점일 것이다. 그러나 대식세포는 염증반응의 시작, 유지, 종결의 과정을 조절하는 염증반응 조절자이다.
동과자 메탄올 또는 에탄올 추출물은 NO (nitric oxide), IL-6, TNF-α와 같은 염증 촉진인자의 생성을 억제하였고^{15, 16)} IgE 생성과 mast cell 활성 억제를 통해 히스타민 분비 등을 감소시켜 알레르기성 질환에도 효과가 있음을 보고하였다¹⁷⁾. 비록 이 연구 결과들이 동과자의 항염증 효과를 비롯하여 다양한 효능을 가지고 있을 가능성을 제시하지만, 구체적이고 다양한 항염증 기전을 제시하지는 못하였다. 본 연구 결과는 동과자가 A20의 발현을 유도하고 NF-kB의 활성을 억제함으로써 염증을 억제할 가능성을 구체적으로 제시한다.

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M Bhatia, S Moochhala. Role of Inflammatory Mediators in the Pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome. J Pathol. 2004;202:145-56.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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