[논문]반응표면분석법을 이용한 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785의 protease 활성증가를 위한 배지 최적화

양희건; 하광수; 류명선; 박세원; 정호진; 양희종; 정도연

doi:10.5352/jls.2021.31.8.761

반응표면분석법을 이용한 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785의 protease 활성증가를 위한 배지 최적화
Optimization of Medium to Improve Protease Production Using Response Surface Methodology by Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.8, 2021년, pp.761 - 770

양희건 ((재)발효미생물산업진흥원) , 하광수 ((재)발효미생물산업진흥원) , 류명선 ((재)발효미생물산업진흥원) , 박세원 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정호진 ((재)발효미생물산업진흥원) , 양희종 ((재)발효미생물산업진흥원) , 정도연 ((재)발효미생물산업진흥원)

초록
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본 연구에서는 반응표면분석법을 이용하여 전통발효식품인 막걸리로부터 분리한 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785 균주에 대하여 protease 생산량을 증가시키기 위한 배지의 최적 농도를 확립하고자 하였다. 선정한 11개의 배지 성분 중 각 성분이 protease 생산에 미치는 영향에 대한 분석을 위해 Plackett-Burman design (PBD)를 설계하여 통계분석한 결과 glucose, yeast extract, beef extract를 protease 생산 향상을 위한 요인으로 최종 선별하였다. 선별된 3개의 성분에 대해 protease 생산을 위한 각 성분별 최적 농도를 결정하기 위해 central composite design (CCD)분석을 설계하여 protease 최대 생산을 위한 각 배지조성별 농도는 glucose 6.75 g/l, yeast extract 12.42 g/l, beef extract 17.48 g/l로 예측되었다. ANOVA 분석을 통해 실험모델의 적합성을 증명하였고, 설계한 최적배지에서 반복실험을 진행하여 protease 생산량을 측정한 결과 예측값과 매우 유사한 값을 나타냄을 확인하였다. 최종적으로 일반 배지에 비해 137% 환이 증가하였으며, 추가로 정량 분석 결과 기존 25.72 U/ml 대비 59.28 U/ml로 230.47% 증가함을 확인하였다. 본 연구를 통해 protease 생산량 증가를 위한 배지 성분의 최적화를 확립하였고, 이를 바탕으로 산업용 효소로서 protease의 효율적인 활용방안에 대한 기초자료로서 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In this study, the optimal medium composition for enhancing protease production was established by the Bacillus strain isolated from Makgeolli, a traditional fermented food, using the response surface methodology. B. amyloliquefaciens SRCM115785 was selected as the protease producer by productivity analysis and identified by 16S rRNA gene sequencing. Plackett-Burman design (PBD) was introduced to analyze the effect of each component on protease production among the 11 selected medium components. As a result, glucose, yeast extract, and beef extract were finally selected as factors for enhancing protease production. Central composite design (CCD) analysis was designed as a method to determine the optimal concentration of each component for protease production and the concentration of each medium composition for maximum protease production was predicted to glucose 6.75 g/l, yeast extract 12.42 g/l and beef extract 17.48 g/l. The suitability of the experimental model was proved using ANOVA analysis and as a result of quantitative analysis to prove this, the amount of increase was 230.47% compared to the LB medium used as a control. Through this study, the optimization of medium composition for enhancing protease production was established, and based on this, it is expected that it can be efficient use of protease as an industrial enzyme.

주제어

표/그림 (11)

그림 Fig. 1. Linear correlation relationship between the halo zone diameter (mm) and log of the enzyme activity (U/ml) on protease production. R-squared = 0.9986.
표 Table 1. Results of protease production by 6 isolates of Bacillus sp. strains in LB medium
그림 Fig. 2. Phylogenetic tree based on neighbor-joining method showing relationships between strain SRCM115785 and members of the genus Bacillus. The percentage numbers at the nodes are the levels of bootstrap support based on maximum-likelihood analyses of 1,000 resampled data sets. Bar, 0.0005 nucleotide substitution per position.
그림 Fig. 3. Time course profile of protease production by B. amyloliquefaciens SRCM115785 in LB broth as unoptimized medium. ●: Log CFU/ml, ○: dry cell weight (g/l), ▲: protease (g/l).
표 Table 2. Matrix of the Plackett-Burman design experiments on 11 variables with response values
표 Table 3. ANOVA(analysis of variance) for coefficients of Plackett-Burman design affecting protease production
그림 Fig. 4. Main effect plot showing effect of each variable on protease production by B. amyloliquefaciens SRCM115785. Stepper slope in the line illustrates the greater magnitude of the main effect.
표 Table 4. Matrix of the Central composite design experiments on 17 variables with response values
표 Table 5. ANOVA for central composite design (quadratic model) of SRCM115785
그림 Fig. 5. The three-dimensional response surface plots of protease production as predicted by the quadratic model. The effects of two independent variables on protease production are simultaneously demonstrated.
그림 Fig. 6. Comparison of protease production in different media, LB (unoptimized medium) as well as comparing the model to experimental value. Data are presented as the mean ± SD. ■: diameter (mm), ●: U/ml.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 전통발효식품인 김치, 된장, 막걸리 등에서 protease 활성이 높은 균주를 스크리닝하여 활성이 높은 Bacillus속 균주들을 분리 및 동정하여 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785의 protease 생산량 증진을 위한 배지성분을 반응표면 분석법을 적용하여 조사하고, 각 성분의 농도를 설정하여 대량생산을 위한 최적의 산업적 배지조건을 확립하고자 하였다.

제안 방법

PBD 통계분석 결과를 기반으로 SRCM115785균주의 protease 생산량 증가에 가장 큰 영향을 미치는 성분으로 glucose, yeast extract, beef extract 3종을 선별하였고, 선별된 성분의 농도 최적화를 위해 CCD를 설계하였다(Table 4). 3개의 중심점을 포함한 17개 실험구에 대한 각각의 독립변수와 반응값 (Y, protease g/l)에 대한 회귀방정식은 Design expert 12 pro- gram을 이용하여 다음과 같이 예측하였다.
Protease 고생산균주로 최종 선발한 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785 균주의성장 및 protease 생산량을 조사하기 위해 100 ml의 LB 액체배지에 전배양액 1%를 접종 후, 30 ℃, 150 rpm으로 24시간 동안 진탕 배양하였으며, 4시간마다 배양액을 회수하여 protease 생산량 및 건조 균체량(DCW, dried cell weight)과 흡광도(OD600)를 조사하였다. 건조 균체량의 측정을 위해 배양액 10 ml을 30분간 13, 000 rpm에서 원심분리하여 항량에 도달할 때까지 80℃에서 건조 후 균체량을측정하였고, 흡광도는 배양액을 회수하여 UV/VIS spectrophotometer (Analytic Jena, Germany)를 이용하여 600 nm에서 측정하였다.
본 연구에서는 전통발효식품인 김치, 된장, 막걸리 등에서 protease 활성이 높은 균주를 스크리닝하여 활성이 높은 Bacillus속 균주들을 분리 및 동정하여 선별하였다. 최종적으로 선별된 균주 Bacillus amyloliquefaciens SRCM115785의 protease 생산량 증진을 위한 배지성분을 반응표면 분석법을 적용하여 조사하고, 각 성분의 농도를 설정하여 대량생산을 위한 최적의 산업적 배지조건을 확립하고자 하였다.

이론/모형

건조 균체량의 측정을 위해 배양액 10 ml을 30분간 13, 000 rpm에서 원심분리하여 항량에 도달할 때까지 80℃에서 건조 후 균체량을측정하였고, 흡광도는 배양액을 회수하여 UV/VIS spectrophotometer (Analytic Jena, Germany)를 이용하여 600 nm에서 측정하였다. 배양 시간별 배양액 내의 protease 생산량은 앞서 수행한 2% skim milk 배지를 이용한 well diffusion 방법을 사용하여 측정하였다.

참고문헌 (29)

Ahn, Y. S., Kim, Y. S. and Shin, D. H. 2006. Isolation, identification, and fermentation characteristic s of Bacillus sp. with high protease activity from traditional Cheonggukjang. Kor. J. Food Sci. Technol. 38, 82-87.
Bae, Y. E. and Yoon, K. H. 2012. Production and characterization of thermostable protease from Bacillus licheniformis isolated from Korean traditional soybean paste. Kor. J. Microbiol. 48, 298-304.
Bong, K. M., Kim, K. M., Seo, M. K., Han, J. H., Park, I. C., Lee, C. W. and Kim, P. I. 2017. Optimization of medium for the carotenoid production by Rhodobacter sphaeroides PS-24 using response surface methodology. Kor. J. Org. Agric. 25, 135-148.
Cupp-Enyard, C. 2008. Sigma's non-specific protease activity assay-Casein as a substrate. J. Vis. Exp. 17, 899.
Gupta, R., Beg, Q., K., Khan, S. and Chauhan, B. 2002. An overview on fermentation, downstream processing and properties of microbial alkaline proteases. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60, 381-395.

상세보기
Ha, G. S., Kim, J. W., Im, S. A., Shin, S. J., Yang, H. J. and Jeong, D. Y. 2020. Application of response surface methodology in medium optimization to improve lactic acid production by Lactobacillus paracasei SRCM201474. J. Life Sci. 30, 522-531.
Ha, G. S., Shin, S. J., Jeong, S. Y., Yang, H. Y., Im, S. A., Heo, J. H., Yang, H. J. and Jeong, D. Y. 2019. Optimization of medium components using response surface methodology for cost-effective mannitol production by Leuconostoc mesenteroides SRCM201425. J. Life Sci. 29, 861-870.
Haddar, A., Fakhfakh-Zouari, N., Hmidet, N., Frikha, F., Nasri, M. and Kamoun, A. S. 2010. Low-cost fermentation medium for alkaline protease production by Bacillus mojavensis A21 using hulled grain of wheat and sardinella peptone. J. Biosci. Bioeng. 110, 288-294.
Jeong, S. J., Yang, H. J., Ryu, M. S., Seo, J. W., Jeong, S. Y. and Jeong, D. Y. 2018. Statistical optimization of culture conditions of probiotic Lactobacillus brevis SBB07 for enhanced cell growth. J. Life Sci. 28, 577-586.
Joshi, S., Yadav, S., Nerurkar, A. and Desai, A. J. 2007. Statistical optimization of medium components for the production of biosurfactant by Bacillus licheniformis K51. J. Microbiol. Biotechnol. 17, 313-319.

원문보기 상세보기
Jung, H. K., Jeong, Y. S., Youn, K. S., Kim, D. I. and Hong, J. H. 2009. Quality characteristics of soybean paste (Doenjang) prepared with Bacillus subtilis DH3 expressing high protease levels, and deep-sea water. Kor. J. Food Preserv. 16, 348-354.
Kim, D. Y., Lee, E. T. and Kim, S. D. 2003. Purification and characterization of fibrinolytic enzyme produced by Bacillus subtilis K7 isolated from Korean traditional soy sauce. J. Kor. Soc. Agric. Chem. Biotechnol. 46, 176-182.
Kim, J. Y. 2007. Isolation and characterization of an alkaline protease produced by Bacillus subtilis JK-1. Kor. J. Microbiol. 43, 331-336.
Kim, K. E. 2014. Isolation of protease producing microorganisms. J. Kor. Soc. Environ. Eng. 36, 265-270.
Kim, K. P., Kim, N. H., Rhee, C. H., Woo, C. J. and Bae, D. H. 2002. Isolation and characterization of protease producing bacteria from soil. J. Kor. Soc. Food Sci. Nutr. 31, 754-759.
Klingeren, B. V. and Rutgers, A. 1979. Microbiological assays of aminoglycoside antibiotics in serum: Technique and interpretation. Acta Clin. Belg. 34, 278-287.

상세보기
Lee, N. R., Go, T. H., Lee, S. M., Hong, C. O., Park, K. M., Park, G. T., Hwang, D. Y. and Son, H. J. 2013. Characteristics of Chungkookjang prepared by Bacillus amyloliquefaciens with different soybeans and fermentation temperatures. Kor. J. Microbiol. 49, 71-77.
Lee, R. H., Yang, S. J., Hwang, T. Y., Chung, S. K. and Hong, J. H. 2015. α-glucosidase inhibitory activity and protease characteristics produced by Bacillus amyloliquefaciens. Kor. J. Food Preserv. 22, 727-734.
Lim, S. I., Kim, H. K. and Yoo, J. Y. 2000. Characteristics of protease produced by Bacillus subtilis PCA 20-3 isolated from Korean traditional Meju. Kor. J. Food Sci. Technol. 32, 154-160.
Montville, T. J. 1983. Dual-substrate plate diffusion assay for proteases. Appl. Environ. Microbiol. 45, 200-204.

상세보기
Nilegaonkar, S., S., Zambare, V., P., Kanekar, P. P., Dhakephalkar, P. K. and Sarnaik, S. S. 2007. Production and partial characterization of dehairing protease from Bacillus cereus MCM B-326. Bioreseour. Technol. 52, 3571-3578.
Pathak, A., P., Rathod, M., G., Mahabole, M. P. and Khairnar, R. S. 2020. Enhanced catalytic activity of Bacillus aryabhattai P1 protease by modulation with nanoactivator. Heliyon 6, e04053.

상세보기
Ryu, M. S., Yang, H. J., Jeong, S. J., Seo, J. W., Ha, G. S., Jeong, S. Y. and Jeong, D. Y. 2018. Characteristic study and optimization of culture conditions for Bacillus amyloliquefaciens SRCM 100731 as probiotic resource for companion animal. Kor. J. Microbiol. 54, 384-397.
Saitou, N. and Nei, M. 1987. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4, 406-425.

상세보기
Yang, H. J., Park, C. S., Yang, H. Y., Jeong, S. J., Jeong, S. Y., Jeong, D. Y., Kang, D. O., Moon, J. Y. and Choi, N. S. 2015. Optimization of medium for the production of cellulase by Bacillus subtilis NC1 using response surface methodology. J. Life Sci. 25, 680-685.
Yang, S. J., Lee, D. H., Park, H. M., Jung, H. K., Park, C. S. and Hong, J. H. 2014. Amylase activity and characterization of Bacillus subtilis CBD2 isolated from Doenjang. Kor. J. Food Preserv. 21, 286-293.
Yoo, J. H., Joo, J. H., Kim, S. G. and Jang, I. H. 2006. Isolation and characterization of protease producing B. amyloliquefaciens JH-35 from food waste. Kor. J. Environ. Agric. 35, 294-301.
Yoon, K. H. and Shin, H. Y. 2010. Medium optimization for the protease production by Bacillus licheniformis isolated from Cheongkookjang. Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 38, 385-390.
Yoon, S. H., Ha, S. M., Kwon, S. J., Lim, J. M., Kim, Y. S., Seo, H. S. and Chun, J. S. 2017. Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 67, 1613-1617.

저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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