[논문]Chrysin과 emodin에 의한 대장암 세포 항 성장 활성 및 세포사멸

류승민; 김용현; 이은주; 정정욱; 김종식

doi:10.5352/jls.2021.31.10.929

Chrysin과 emodin에 의한 대장암 세포 항 성장 활성 및 세포사멸
Anti-proliferative Effects and Apoptosis Induced by Chrysin or Emodin in Human Colorectal HCT116 Cells 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.31 no.10, 2021년, pp.929 - 936

류승민 (국립안동대학교 생명공학부) , 김용현 (국립안동대학교 생명공학부) , 이은주 (국립안동대학교 생명공학부) , 정정욱 (국립안동대학교 생명공학부) , 김종식 (국립안동대학교 생명공학부)

초록
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본 연구에서는 시판하는 천연물 library (Selleckchem, L1400)로부터 암세포 항 성장 활성을 보여주는 천연물을 선별하였다. 즉, 인간 대장암 세포주인 HCT116에 50 μM의 각 천연물을 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. 1차 선별과정을 통하여 5종의 천연물(chrysin, diosmetin, emodin, piperlongumine, tanshinone I)을 선별하였다. 5종의 천연물에 의한 NAG-1 단백질의 발현을 확인한 결과 chrysin과 emodin에 의해서 발현이 현저하게 증가하였다. 또한, chrysin과 emodin은 농도의존적으로 세포 생존율을 감소시켰으며, chrysin과 emodin은 항암 단백질인 NAG-1의 발현을 농도 및 시간 의존적으로 증가시켰다. 게다가, chrysin과 emodin 처리에 의해 증가된 PARP cleavage가 NAG-1 siRNA transfection에 의해서 감소됨을 확인함으로써, chrysin과 emodin에 의한 세포사멸과 NAG-1의 발현 증가가 직접적인 관련이 있음을 증명하였다. 따라서, 본 연구결과는 암세포 항 성장 활성을 보여주는 천연물 선별에 대한 기초 데이터를 제공해 주며, chrysin과 emodin에 의한 암세포 항 성장 활성 및 세포사멸의 기전을 이해하는 데 도움을 줄 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

In the present study, we screened candidate natural compounds which possess the strong anti-proliferative effects on human colorectal HCT116 cells using the commercial natural product library (Selleckchem, L1400) based on cell viability assay. Human colorectal cancer HCT116 cells were incubated with 50 μM of each compound from the natural product library, and then cell viability was measured by MTT assay. From the first screening, five different kinds of natural products (chrysin, diosmetin, emodin, piperlongumine, and tanshinone I) were selected based on cell viability assay in HCT116 cells and commercial availability. All selected natural products significantly decreased cell viabilities in HCT116 cells, whereas pro-apoptotic protein NAG-1 is strongly induced by chrysin or emodin treatment. Chrysin and emodin decreased cell viability in a dose-dependent manner. Moreover, chrysin and emodin increased the expression of pro-apoptotic NAG-1 protein in a dose- and time-dependent manner. In addition, PARP cleavage induced by chrysin or emodin was recovered in part by the transfection of NAG-1 siRNA indicating that NAG-1 may be one of the genes responsible for apoptosis induced by chrysin or emodin. Overall, our findings may provide basic screening data on natural products which possess anti-proliferative activities and may help to understand the molecular mechanisms of anti-proliferative and pro-apoptotic activities mediated by chrysin and emodin.

주제어

표/그림 (5)

표 Table 1. The results of cell viability assay using natural product library in HCT116 cells
표 Table 1. Continued
그림 Fig. 1. Effects of five different kinds of natural products on cell viability and NAG-1 expression in HCT116 cells. (A) HCT116 cells were incubated with 50 μM of chrysin (CRS), diosmetin (DSM), emodin (EMD), piperlongumine (PLG) or tanshinone I (TSN) for 24 hr, whereas 0.1% DMSO (vehicle, VEH) was treated as a control. Cell viability was measured using MTS assay. Values indicate means ± SD (n=4). ***p<0.001 vs VEH. (B) HCT116 cells were treated with 50 μM of each natural product for 24 hr. Cell lysates were prepared and Western blot was performed using NAG-1 and Actin antibodies.
그림 Fig. 2. Decrease of cell viability and up-regulation of NAG-1 protein by chrysin or emodin in HCT116 cells. (A, B) HCT116 cells were incubated with 10, 25, and 50 μM of chrysin (CRS) or emodin (EMD) for 24 hr, whereas 0.1% DMSO (VEH) was treated as a control. Cell viability was measured using MTS assay. Values indicate means ± SD (n=4). ***p<0.001 vs VEH. (C, D) HCT116 cells were incubated with various concentrations of chrysin or emodin for 24 hr. Western blot was performed by using NAG-1 and Actin antibodies. (E, F) HCT116 cells were incubated with 50 μM chrysin or emodin and collected at the different time points. Western blot was done using NAG-1 or Actin antibodies.
그림 Fig. 3. Recovery of apoptosis induced by chrysin or emodin after NAG-1 siRNA transfection in HCT116 cells. (A) β -gal or NAG-1 siRNA was transfected into HCT116 cells. After 24 hr transfection, cells were treated with vehicle (VEH, 0.1% DMSO) or 50 μM chrysin. After 24 hr treatment, cell lysates were prepared and Western blot analysis was done using PARP, NAG-1 or Actin antibodies. (B) β-gal or NAG-1 siRNA was transfected into HCT116 cells. After 24 hr transfection, cells were treated with vehicle (VEH, 0.1% DMSO) or 50 μM emodin. After 24 hr treatment, total proteins were prepared and subjected to Western blot analysis using PARP, NAG-1 and Actin antibodies.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 173종의 천연물로 구성되어 있는 li- brary로부터 암세포 항 성장 활성이 있는 천연물 선별을 위한 기초 데이터를 제공하였으며, 최종적으로는 천연물 chrysin과 emodin에 의한 암세포 항 성장 활성과 세포사멸을 확인하였으며, 항암 유전자 NAG-1 발현과의 관련성을 규명하였다.

제안 방법

1차 선별과정에서 선정된 5종의 천연물을 각각 구입하여 1차 선별과정과 동일한 조건에서 각 천연물을 처리한 후 세포 생존율을 측정하였으며, 대조구의 경우 vehicle (VEH, 0.1% DMSO)을 처리하였다. 다만, 1차 선별과정에서는 MTT 용액을 이용하여 세포 생존율을 측정한 반면, 2차 확인 과정에서는 MTS 용액을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
Chrysin과 emodin을 농도별로 24시간 처리하고, 대조 구로는 vehicle (VEH, 0.1% DMSO)을 처리한 후 세포 생존율을 측정하였다. Fig.
대장암 세포주 HCT116를 약 24시간 동안 배양한 후 serum free DMEM에 Lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen, Carls- bad, CA, USA) 10 μl와 10 pmol NAG-1 siRNA (Bioneer, Daejeon, Korea) 6 μl를 혼합하여 transfection 하였다
2B에서 보는 바와 같이 chrysin과 emodin을 각각 10, 20, 50 μM의 농도로 24시간 처리한 결과 세포 생존율이 처리한 천연물 농도의존적으로 세포 생존율이 감소함을 확인하였다. 동일한 처리 조건에서 chrysin과 emo- din을 농도별로 처리한 후 항암 단백질 NAG-1의 발현을 확인하였으며, loading control로써 Actin의 발현을 확인하였다. 그 결과 Fig.
1B). 이후 chrysin과 emodin에 의한 농도별 세포 생존율과 농도별, 시간별 처리에 따른 항암 단백질 NAG-1의 발현을 확인하였으며, chrysin과 emodin에 의한 세포사멸과 NAG-1 발현과의 관련성을 규명하고자 하였다.

대상 데이터

인간 대장암 세포주 HCT116는 Korean Type Culture Collection (KTCC, Korea)에서 구입하였으며, 배양은 10% fetal bovine serum (FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA), 1% penicillin-streptomycin (Welgene, Korea)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco, USA)을 사용하였다.
L1400) 는 Selleckchem사(Houston, TX, USA)로부터 구입하였다. 천연물 library는 총 173 종류의 천연물로 구성되어 있으며, 1차 선별과정에서 세포 생존율 측정에 사용되었다. 추가 연구를 위하여 천연물인 chrysin, diosmetin, emodin, piperlongu- mine, 그리고 tanshinone I은 Sigma 사(St.

데이터처리

모든 실험은 최소한 3회 이상 반복 실험을 실시하였으며 실험 결과는 평균±표준편차로 나타내었고, 각 실험 결과의 유의성 검토는 시료가 포함되지 않은 대조구와 비교하여 stu- dent’s t-test에 의해 판정하였으며 p<0.05일 때 유의성이 있다고 판단하였다.

이론/모형

1% DMSO)을 처리하였다. 수확한 단백질은 Western blot analysis 실시하여 각 단백질의 발현 양을 확인하였다.

성능/효과

2%의 세포 생존율을 보여주어(Fig. 1A), 비록 1차 선별 결과와 세포 생존율의 수치에는 차이가 있으나 5종의 천연물 모두 대조구에 비해 비슷한 양상으로 높은 대장암 세포의 항 성장 활성을 보여 주는 것으로 확인되었다.
2B에서 보는 바와 같이 chrysin과 emodin을 각각 10, 20, 50 μM의 농도로 24시간 처리한 결과 세포 생존율이 처리한 천연물 농도의존적으로 세포 생존율이 감소함을 확인하였다
2C, Fig 2D에서 보는 바와 같이 10, 20, 50 μ M의 농도로 처리한 chrysin과 emodin에 의해서 농도 의존적으로 NAG-1의 발현이 증가됨을 확인하였다
다만, 1차 선별과정에서는 MTT 용액을 이용하여 세포 생존율을 측정한 반면, 2차 확인 과정에서는 MTS 용액을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다. 2차 확인 결과, chrysin (CRS), diosmetin (DSM), emodin (EMD), piperlongumine (PLG), 그리고 tanshinone I (TSN)이 각각 순서대로 대조구에 비해 73.3%, 74.7%, 56.8%, 24.0% 그리고 44.2%의 세포 생존율을 보여주어(Fig. 1A), 비록 1차 선별 결과와 세포 생존율의 수치에는 차이가 있으나 5종의 천연물 모두 대조구에 비해 비슷한 양상으로 높은 대장암 세포의 항 성장 활성을 보여 주는 것으로 확인되었다.
2F). 따라서, chrysin과 emodin에 의한 세포 생존율 감소 경향이 NAG-1 단백질의 발현증가와 비슷한 양상으로 이루어진다는 것을 확인하였다.
또한, 50 μM의 chrys- in과 emodin을 시간대별로 처리한 결과 NAG-1의 발현이 처리 시간이 증가됨에 따라 발현이 증가되며, 특히 두 천연물 모두 18시간 처리군에서부터 급격히 증가됨을 확인하였다(Fig
선별된 5종류의 천연물에 의한 pro-apoptotic 단백질 중 하나인 NAG-1의 발현을 확인한 결과 chrysin과 emodin에 의해서만 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인하였다(Fig. 1B).
종합적으로 본 연구에서는 대장암 세포주 HCT116에서 173 종의 천연물 처리에 의한 세포 생존율에 대한 기초 데이터를 제공하였으며, 이 중 천연물 chrysin과 emodin에 의해 유도되는 apoptosis가 항암 단백질 NAG-1의 발현 유도와 직접적인 관련이 있음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 천연물 chrys- in과 emodin에 의한 항암 활성의 작용 기전을 이해하는 데 도움을 줄 것으로 판단된다.

후속연구

종합적으로 본 연구에서는 대장암 세포주 HCT116에서 173 종의 천연물 처리에 의한 세포 생존율에 대한 기초 데이터를 제공하였으며, 이 중 천연물 chrysin과 emodin에 의해 유도되는 apoptosis가 항암 단백질 NAG-1의 발현 유도와 직접적인 관련이 있음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 천연물 chrys- in과 emodin에 의한 항암 활성의 작용 기전을 이해하는 데 도움을 줄 것으로 판단된다. 향후 chrysin과 emodin에 의한 항염증, 항비만 활성 등 다양한 생리활성과 작용 기전에 대한 연구를 진행함으로써, 식이가능한 천연물 chrysin과 emodin 의 다양한 활용 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.
이러한 연구결과는 천연물 chrys- in과 emodin에 의한 항암 활성의 작용 기전을 이해하는 데 도움을 줄 것으로 판단된다. 향후 chrysin과 emodin에 의한 항염증, 항비만 활성 등 다양한 생리활성과 작용 기전에 대한 연구를 진행함으로써, 식이가능한 천연물 chrysin과 emodin 의 다양한 활용 가능성을 제시할 수 있을 것으로 기대된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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