[논문]Poricoic acid의 비알코올성 지방간염 억제 효능

김혜란; 정대영; 김세이; 정명호

doi:10.5352/jls.2022.32.12.962

Poricoic acid의 비알코올성 지방간염 억제 효능
Preventive Effect of Poricoic Acid against Nonalcoholic Steatohepatitis 원문보기

생명과학회지 = Journal of life science, v.32 no.12, 2022년, pp.962 - 970

김혜란 (부산대학교 한의학전문대학원 한의학과) , 정대영 (부산대학교 한의학전문대학원 한의학과) , 김세이 (부산대학교 한의학전문대학원 한의학과) , 정명호 (부산대학교 한의학전문대학원 한의학과)

초록
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비알코올성 지방간염(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)은 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)의 진행질환으로, 중성지방 침착, 염증 및 간 섬유화가 동반되어 간경변증과 간암의 원인이 되는 질환이나, 아직까지 비알코올성 지방간염을 치료하는 뚜렷한 치료제가 없는 실정이다. Poricoic acid (PoA)는 복령의 약효성분으로 여러 약리작용이 보고되었으나 비알코올성 지방간염의 치료 효능은 보고되지 않았다. 따라서 본 연구에서는 PoA가 비알코올성 지방간염의 병인에 작용하여 비알코올성 지방간염을 억제하는지를 in vivo 및 in vitro 연구를 통해 확인하였다. 비알코올성 지방간염을 유도하는 식이(high fat and methionine-choline deficient diet, HFMCD)로 비알코올성 지방간염을 유발한 쥐에서 PoA는 HFMCD에 의해 증가된 간 무게를 감소시켰으며, 간 독성을 나타내는 alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase도 감소시켰다. Oil Red O 염색 및 hematoxylin & eosin 염색의 결과에 의하면, PoA는 HFMCD에 증가하는 간 조직 내 중성지방의 생성을 감소시켰으며, qPCR 결과에 의해서도 PoA는 중성 지방 합성과 관련된 유전자들의 발현도 감소시켰다. 또한 간 조직에서 CD68 면역 염색 결과에 의하면, PoA는 HFMCD에 의해 증가는 CD68 면역 염색을 감소시켰으며, 염증과 관련된 유전자 발현도 감소시켰다. 더욱이 Sirius red 염색과 α-smooth muscle actin (α-SMA) 면역 염색으로 간 섬유화 정도를 측정한 결과, PoA는 HFMCD에 증가되는 sirius red 염색과 α-SMA 면역 염색을 유의적으로 감소시켰으며 섬유화 관련 유전자들의 발현도 감소시켰다. 또한, PoA는 palmitate (Pa)로 처리한 간세포 AML12에서 Pa에 의해 증가하는 중성 지방산 합성, 염증 및 섬유화 관련 유전자들의 발현을 감소시켰다. 이상의 결과를 종합하면 PoA는 비알코올성 지방간염의 중요 병인인 중성지방 생성, 염증 및 섬유화를 억제하여 비알코올성 지방간염을 억제함을 확인하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Nonalcoholic steatohepatitis (NASH) is the progressive stage of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) that highly increases the risk of cirrhosis and liver cancer, and there are few therapeutic options available in the clinic. Poricoic acid (PoA), a component of Poria cocos Wolf, has a wide range of pharmacological activities; however, little is known about its effects on NASH. The preventive effects of PoA on NASH were examined in vivo and in vitro by analyzing triglyceride synthesis, inflammation and fibrosis. In the high fat and methionine-choline deficient diet (HFMCD)-induced NASH mice, PoA reduced the liver weight and the levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase compared with non-treated HFMCD group. The staining with Oil Red O and hematoxylin and eosin revealed that PoA administration reduced red staining and the size of lipid droplet. qPCR analysis showed that PoA also reduced the expression of genes related to triglyceride synthesis. Further, immunostaining with CD68 and qPCR analysis revealed that PoA reduced the staining with CD68 and the expression of inflammatory genes induced by HFMCD. Moreover, PoA reduced the staining with sirius red and antibody of α-smooth muscle actin and also reduced the expression of genes related to fibrosis. The treatment of PoA to AML12 cells reduced the increase in triglyceride amount and expression of genes associated with triglyceride synthesis, inflammation and fibrosis. Taken together, our study indicate that PoA has therapeutic effect on NASH through preventing triglyceride synthesis, inflammation and fibrosis.

주제어

표/그림 (7)

그림 Fig. 1. Effects of Poricoic acid on body weight and liver weight in HFMCD fed mice. (A) amount of food intake. (B) Body weight. (C) Body weight gain. (D) Liver weight. (E) Ratio of liver weight/body weight. Data are presented as the mean ± SD of nine mice. ^**p<0.01 vs normal diet (ND)-fed mice, ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. HFMCD-fed mice. ND; normal diet. HFMCD; high fat and methionine-choline deficient diet.
그림 Fig. 2. Poricoic acid attenuates HFMCD-induced liver toxicity in HFMCD fed mice. The levels of ALT (A) and AST (B) were measured from liver lysates. Data are presented as the mean ± SD of nine mice. ^**p<0.01 vs normal diet (ND)-fed mice, ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. HFMCD-fed mice.
그림 Fig. 3. Poricoic acid ameliorates HFMCD-induced hepatic steatosis in HFMCD fed mice. (A) Representative images of liver morphology. (B) Oil Red O staining and H&E staining. Representative images were shown. A scale bar is 100 μm. (C) Relative mRNA levels of triglyceride synthesis-related genes including SREBP1c, FAS, SCD1 and ACC1. Data are presented as the mean ± SD of nine mice. ^*p<0.05, ^**p<0.01 vs normal diet (ND)-fed mice, ^#p<0.05 vs. HFMCD-fed mice.
그림 Fig. 4. Poricoic acid reduces HFMCD-induced inflammation in the liver of HFMCD fed mice. (A) CD68 staining. Representative images were shown. A scale bar is 100 μm. (B) Relative mRNA levels of inflammatory genes including TNFα, IL-6, IL-Iβ, and CD68. Data are presented as the mean ± SD of nine mice. ^*p<0.05, ^**p<0.01 vs normal diet (ND)-fed mice, ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. HFMCD-fed mice.
그림 Fig. 5. Poricoic acid decreases HFMCD-induced fibrosis in the liver of HFMCD fed mice. (A) Sirius staining and α-SMA staining. A scale bar is 100 μm. (B) Relative mRNA levels of fibrosis genes including α-SMA, Col1α1 and TIMP1. Data are presented as the mean ± SD of nine mice. ^**p<0.01 vs normal diet (ND)-fed mice, ^#p<0.05, ^##p<0.01 vs. HFMCD-fed mice.
그림 Fig, 6. Poricoic acid reduces palmitate-induced triglyceride amount and expression of lipogenesis genes in the palmitate-treated AML12 cells. (A) Cell toxicity of palmitate and poricoic acid on LX-12 cells. Cell viability was determined by MTT assay. (B) Intracellular TG amounts. (C) Relative mRNA expression of lipogenesis genes including SREBP1c, FAS and SCD1. Data represent mean ± SD of triplicate experiments. ^**p<0.01versus non-treated control. ^#p<0.05 versus Pa-treated cells. Pa; palmitate. PoA; poricoic acid.
그림 Fig. 7. Poricoic acid decreases palmitate-induced expression of genes related to inflammation and fibrosis in the palmitate-treated AML12 cells. (A) Relative mRNA levels of inflammatory genes including MCP-1, IL-1β and CD68. (B) Relative mRNA levels of fibrosis genes including α-SMA, Col1α1 and TIMP1. Data represent mean ± SD of triplicate experiments. ^*p<0.05, ^**p<0.01versus non-treated control. ^#p<0.05 versus Pa-treated cells.

AI 본문요약
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문제 정의

따라서, 본 연구에서는 한약 소재 복령의 천연 성분인 PoA가 비알코올성 지방간염의 발병 기전(중성지방 생성, 염증 및 섬유화)에 다중적으로 작용하여 비알코올성 지방간염을 치료하는 효능이 있는지를 in vivo 및 in vitro 실험을 통해 연구하였다.

제안 방법

In vivo에서 PoA의 비알코올성 지방간염의 억제 효능을 세포에서 확인하였는데, Pa로 처리한 간 세포 AML12 세포에서 중성지방, 염증, 섬유화 등을 측정하였다. AML12 세포에 Pa로 처리하면 Pa에 의해 중성지방의 생성과 이와 관련된 유전자들의 발현이 증가하였으나 PoA와 함께 처리하면 Pa에 의한 중성지방의 생성과 이와 관련된 유전자들의 발현이 억제되었다.
따라서, 이 이후의 실험은 세포의 독성이 나타나지 않는 Pa의 농도 100 mg/ml과 PoA의 농도 5, 10 μg/ml을 사용하였다. PoA가 AML12 세포에서 Pa에 의해 증가되는 중성지방을 억제하는지를 확인하기 위해, 중성지방의 양과 중성지방 합성 관련 유전자 발현으로 분석하였다. Fig.
PoA가 HFMCD에 의해 유도되는 간 독성을 억제하는지를 알기 위해, 혈중 ALT, AST을 측정하였다. 각 군별 혈중 ALT 및 AST의 농도를 측정한 결과를 Fig.
PoA가 HFMCD에 의해 유도되는 섬유화 반응을 억제하는지를 분석하기 위해, 간 조직을 sirius 염색과 α-SMA 면역 염색을 시행하였으며
PoA가 HFMCD에 의해 유도되는 염증반응을 억제하는지를 분석하기 위해, 간 조직에서 CD68 항체로 면역 조직학적 염색을 하였고, 또한 염증 관련 유전자의 발현을 측정하였다. Fig.
PoA가 HFMCD에 의해 증가하는 중성지방 생성을 억제하는지를 분석하기 위해, 간 형태의 변화, ORO 및 H&E 염색과 중성지방 합성과 관련된 유전자들의 발현을 측정하였다
PoA가 Pa로 처리한 AML12 세포에서 Pa에 의해 증가되는 염증 및 섬유화 반응을 억제하는지를 확인하기 위해, 염증 및 섬유화 관련 유전자 발현으로 분석하였다. Fig.
In vivo 실험을 통해 PoA가 HFMCD 식이로 비알코올성 지방간염을 유발한 쥐에서 중성지방의 생성(지방간), 염증 및 섬유화 반응을 억제함을 확인하였다. 이와 같은 PoA의 비알코올성 지방간염 제어 효능을 in vitro에서 확인하기 위해, Pa로 처리한 AML12 세포에서 PoA가 중성지방의 생성(지방간), 염증 및 섬유화 반응을 억제하는지를 분석하였다. 먼저 본 실험에 앞서 PoA와 Pa에 대한 세포독성을 측정하였다.
각 실험군은 9마리로 cage당 3마리씩 분리하여 사육하였다. 정상군은 정상식이(normal diet, ND)를 한 군이고, 실험군은 총 칼로리의 60% 고지방(high fat)과 0.1% methionine과 0% choline이 포함된 식이(60 kcal% fat, no added choline, and 0.1% methionine, HFMCD)로 식이한 군이며, 이를 다시 생리 식염수에 용해시킨 PoA을 0, 5, 10, 20(mg/Kg body weight)의 농도로 투여한 군으로 나누어, 총 실험군은 4그룹으로 나누어 실험을 진행하였다. PoA는 총 6주 동안 투여하였으며, 모든 동물 실험은 부산 대학교 연구동물윤리위원회의 지침에 따라 수행하였다(Approval no.

대상 데이터

No. AM102, AM103; 아산 제약)를 이용하여 측정하였다. ALT 및 AST 측정은 기질액과 혈청을 반응시킨 뒤 정색 시약을 넣고 505 nm에서 증류수를 대조로 흡광도를 측정하였다.
AML12 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, CL-173TM; Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), fetal calf serum (FCS)은 HyClone (Logan, UT, USA)에서 구입하였다
실험에 사용된 마우스는 6주령 수컷 C57BL/6 (두열바이오텍, Seoul, Korea)로 실험 환경은 항온(24±2℃), 항습(55±5%)을 유지하고 12시간 간격으로 light-dark cycle을 일정하게 유지하였다

데이터처리

이 연구에서 사용된 모든 data는 mean ± SD 값으로 표기하였다. Data는 ANOVA를 이용해 분석하였으며, mean difference는 Tukey-Kramer post-hoc 테스트를 이용해 분석하였다. 결과값은 p<0.

이론/모형

Total RNA는 TRIzol® (Ambion Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 분리하였으며, 분리한 2 μg total RNA로부터 TOPscriptTM RT DryMIX (Enzynomics, Daejeon, South Korea)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. Real time PCR분석은 SYBR Green master mixture (SJ Bio Sciences, Daejeon, Korea)을 사용하여 분석하였고, 각 유전자에 특이적인 primer들로 PCR을 행하였다.

성능/효과

2A). AST을 측정한 결과에서도 ALT의 측정 결과와 동일하게 HFMCD로 식이하고 PoA를 투여하지 않은 군에서는 정상 식이군에 비해 ALT가 유의성 있게 증가하였으나, PoA을 투여한 군에서 ALT 수치가 유의성 있게 감소됨을 확인하였다(Fig. 2B).
In vivo 실험을 통해 PoA가 HFMCD 식이로 비알코올성 지방간염을 유발한 쥐에서 중성지방의 생성(지방간), 염증 및 섬유화 반응을 억제함을 확인하였다. 이와 같은 PoA의 비알코올성 지방간염 제어 효능을 in vitro에서 확인하기 위해, Pa로 처리한 AML12 세포에서 PoA가 중성지방의 생성(지방간), 염증 및 섬유화 반응을 억제하는지를 분석하였다.
따라서, in vivo 및 in vitro 실험의 결과를 종합하면 PoA는 중성지방 합성, 염증, 섬유화 반응을 억제함으로써 비알코올성 지방간염을 치료하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 추후 이와 같은 결과와 함께 PoA가 세포사멸 및 산화적 스트레스도 억제하는지를 분석하면 PoA의 비알코올성 지방간염의 치료 효능에 대한 분자적 기전을 더 확인할 수 있을 것으로 판단된다.

후속연구

따라서, in vivo 및 in vitro 실험의 결과를 종합하면 PoA는 중성지방 합성, 염증, 섬유화 반응을 억제함으로써 비알코올성 지방간염을 치료하는 효능이 있음을 확인할 수 있었다. 추후 이와 같은 결과와 함께 PoA가 세포사멸 및 산화적 스트레스도 억제하는지를 분석하면 PoA의 비알코올성 지방간염의 치료 효능에 대한 분자적 기전을 더 확인할 수 있을 것으로 판단된다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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