본 연구에서는 재조합 E. coli 시스템에 의한 재조합 cystein proteinase의 대량 생산을 위하여 4L 회분 배양 및 최적 지수 생장기에서의 IPTG- induction을 연속적으로 실시하였다. 발현된 rPwCP1 양은 진탕 배양 시스템에서의 결과와 비교해 볼때 현저하게 향상되었음을 알 수 있었으며, 더불어 metal affinitychromatography 방법으로 처리하여 전기영동을 수행한 결과, 목적 재조합 단백질만을 정제 및 농축시킬 수 있음이 확인되었다.
본 연구에서는 재조합 E. coli 시스템에 의한 재조합 cystein proteinase의 대량 생산을 위하여 4L 회분 배양 및 최적 지수 생장기에서의 IPTG- induction을 연속적으로 실시하였다. 발현된 rPwCP1 양은 진탕 배양 시스템에서의 결과와 비교해 볼때 현저하게 향상되었음을 알 수 있었으며, 더불어 metal affinity chromatography 방법으로 처리하여 전기영동을 수행한 결과, 목적 재조합 단백질만을 정제 및 농축시킬 수 있음이 확인되었다.
A fermentation study of the recombinant Escherichia coli system has been tired to overproduce a recombinant Paragonimus westermani cysteine proteinase, rPwCP1. Using the modified LB media, main cultures and chemical induction with IPTG were carried out to examine the possibility of secretory protein...
A fermentation study of the recombinant Escherichia coli system has been tired to overproduce a recombinant Paragonimus westermani cysteine proteinase, rPwCP1. Using the modified LB media, main cultures and chemical induction with IPTG were carried out to examine the possibility of secretory protein overproduction at high cell density culture. As a result, the target protein of rPwCP1, purified by metal affinity chromatography and gel filtration, has been shown at 50.8 kDa on SDS-PAGE, and its final concentration turns out to be 350mg/L.
A fermentation study of the recombinant Escherichia coli system has been tired to overproduce a recombinant Paragonimus westermani cysteine proteinase, rPwCP1. Using the modified LB media, main cultures and chemical induction with IPTG were carried out to examine the possibility of secretory protein overproduction at high cell density culture. As a result, the target protein of rPwCP1, purified by metal affinity chromatography and gel filtration, has been shown at 50.8 kDa on SDS-PAGE, and its final concentration turns out to be 350mg/L.
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문제 정의
본 연구에서는 이러한 시스틴 단백질 분해효소 유전자를 발현시킬 수 있는 재조합 Escherichia coli 시스템을 유전공학적 기술을 이용하여 개발하였으며, 미생물 배양 및 목적 재조합 단백질(recombinant Paragonimus westermani cysteine proteinase, rPwCPl)의 발현에 관한 최적 조건들을 탐색하였다.
본 연구에서는 재조합 E. coli 시스템에 의한 재조합 cystein proteinase의 대량 생산을 위하여 4L 회분 배양 및 최적지수 생장기에서의 IPTG- induction을 연속적으로 실시하였다. 발현된 rPwCPl 양은 진탕 배양 시스템에서의 결과와 비교해 볼때 현저하게 향상되었음을 알 수 있었으며, 더불어 metal affinity chromatography 방법으로 처리하여 전기영동을 수행한 결과, 목적 재조합 단백질만을 정제 및 농축시킬 수 있음이 확인되었다.
제안 방법
실시하였다. 또한 chemical induction 전과 induction 후의 배양액을 각각 sampling 함과 동시에 초음파 파쇠시 켜 얻게 되는 상둥액을 10% polyacrylamid gel에서 SDS-PAGE 함으로써, induction 전후 과정에서의 rPwCPl의 발현 양상을 비교하였다. 단백질 정제를 위해서 metal affinity column chromatography 법을 이용하였고, column에 쓰여진 resine Ni-NTA를 사용하였다.
5시간에 걸쳐 실시한다. 발효조에서의 배양액 중 pH의 지속적인 조절을 위하여 4N NH4OH 용액을 사용하였고, 목적 유전자 발현을 위해서 inducer인 Isopropyl thio-0 -D- galactoside(IPTG)를 지수 생장 기간중 최적 시점에서 투여한 다음, 약 4시간 정도 배양 및 induction 하였다.
배양과정에서의 균체의 증식도 조사는 배양액의 광 밀도(ODeoo)를 측정함으로써 실시하였다. 또한 chemical induction 전과 induction 후의 배양액을 각각 sampling 함과 동시에 초음파 파쇠시 켜 얻게 되는 상둥액을 10% polyacrylamid gel에서 SDS-PAGE 함으로써, induction 전후 과정에서의 rPwCPl의 발현 양상을 비교하였다.
5 시간 정도 실시한다. 주 배양인 7L 발효 시스템(korea fermentor Co. KFC-7L)에 멸균 준비된 4L modified medium에 5% 접종한 후, 37℃, pH7.0, 500-700rpm, DO 1.5vvm 인 조업조건으로 약 7.5시간에 걸쳐 실시한다. 발효조에서의 배양액 중 pH의 지속적인 조절을 위하여 4N NH4OH 용액을 사용하였고, 목적 유전자 발현을 위해서 inducer인 Isopropyl thio-0 -D- galactoside(IPTG)를 지수 생장 기간중 최적 시점에서 투여한 다음, 약 4시간 정도 배양 및 induction 하였다.
대상 데이터
본 연구에서 사용된 recombinent cystein proteinase의 생산균주의 숙주는 Escherichia coli BL21의 일종이고, 재조합 rPwCPl 생산 vector로는 T7 promoter에 의해 발현되는 pRSETa를 사용하였으며, 이것은 분리정제 과정에서 metal affinity purification 이 효율적으로 이루어질 수 있도록 C-terminal에 6-histidin이 tagging 된 것이다.
또한 chemical induction 전과 induction 후의 배양액을 각각 sampling 함과 동시에 초음파 파쇠시 켜 얻게 되는 상둥액을 10% polyacrylamid gel에서 SDS-PAGE 함으로써, induction 전후 과정에서의 rPwCPl의 발현 양상을 비교하였다. 단백질 정제를 위해서 metal affinity column chromatography 법을 이용하였고, column에 쓰여진 resine Ni-NTA를 사용하였다.
성능/효과
그림 3은 원심 분리법으로 harvest한 발현된 재조합 E. coli를 초음파 파쇄시킨 뒤, 상등액을 metal affinity chromatography 방법으로 분리 및 정 제시 킨 다음, 전기영동을 수행 한결 과로서, 50.8kDa의 분자량 위치에서 우리가 원하는 재조합 단백질 bend만이 유일하게 나타냄을 확인할 수 있었다. 이 결과로서 metal affinity chromatography 방식에 의한 정제를 통하여 목적 재조합 단백질인 시스틴 분해효소(cysteine proteinase)만을 따로 분리 및 농축할 수 있음을 확인하였다.
전기영동한 결과를 나타내는 것으로 sample 1은 IPTG-induction흐}■기 전의 결과를, sample 2는 그 이후의 결과를 각각 나타낸 것이다. 그림에 나타난 바와 같이, IPTG-induction 이전에는 미미하던 50.8kEa의 목적 재조합 단백질의 band는 IPTG-induction 이후에 확연하게 나타남을 확인할 수 있었으며, 그 이후의 데이터들은 별 차이가 없는 것으로 나타났다. 그림 1에서도 나타난 바와 같이 E.
또한 protein assay 결과도 rPwCPl이 350mg/L의 농도로 생산되었음을 확인하였다(data not shown). 이것은 진탕 배양 시스템 결과에 비교하여 약 50배 이상 높은 결과임을 확인할 수 있었다.
coli 시스템에 의한 재조합 cystein proteinase의 대량 생산을 위하여 4L 회분 배양 및 최적지수 생장기에서의 IPTG- induction을 연속적으로 실시하였다. 발현된 rPwCPl 양은 진탕 배양 시스템에서의 결과와 비교해 볼때 현저하게 향상되었음을 알 수 있었으며, 더불어 metal affinity chromatography 방법으로 처리하여 전기영동을 수행한 결과, 목적 재조합 단백질만을 정제 및 농축시킬 수 있음이 확인되었다.
8kDa의 분자량 위치에서 우리가 원하는 재조합 단백질 bend만이 유일하게 나타냄을 확인할 수 있었다. 이 결과로서 metal affinity chromatography 방식에 의한 정제를 통하여 목적 재조합 단백질인 시스틴 분해효소(cysteine proteinase)만을 따로 분리 및 농축할 수 있음을 확인하였다.
후속연구
그림에서 쉽게 알 수 있는 바와 같이, IPTG-induction 이후에도 1시간 정도의 균체 성장이지속되어 IPTG-induction 전과 비교하여 균체농도가 2배 정도 증가함과 동시에 acetic acid 농도도 3g/L 정도까지 증가하였으나, 5.5시간의 배양 후에는 균체 증식도와 acetic acid 농도 모두가 확연히 감소하였음을 확인할 수 있었는데, 이러한 사실은 균체증식의 멈춤이 IPTG-induction에 기인한다기 보다는 오히려 1차 탄소 원인 포도당의 결핍에 기인된다고 판단되며, 추후 실시될 유가 배양에 의한 고농도 균체증식후 IPTG-induction에 관한 연구에 중요하게 이용될 것이다.
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