초록 ▼

본 연구과제는 심혈관질환의 치료용 유전자 전달체 개발과 질병 모델에서의 그 응용을 위한 과제로서 target 질환은 심근염과 허혈성심혈관질환이며 유전자전달벡터는 naked DNA와 렌티바이러스이다. 제1세부과제는 다양한 유전자전달체를 제조하고 평가하여 최적의 유전자전달체를 개발하였으며, 제2세부과제는 개발된 유전자전달체를 바탕으로 심근염에서의 발현 효율 검증 및 치료효과를 연구하였으며, 제3세부과제는 개발된 유전자전달체를 이용하여 허혈성심질환에서 발현 효율 검증 및 치료효과를 연구하였다.
제1세부과제에서는 다양한 전사조절인자를

본 연구과제는 심혈관질환의 치료용 유전자 전달체 개발과 질병 모델에서의 그 응용을 위한 과제로서 target 질환은 심근염과 허혈성심혈관질환이며 유전자전달벡터는 naked DNA와 렌티바이러스이다. 제1세부과제는 다양한 유전자전달체를 제조하고 평가하여 최적의 유전자전달체를 개발하였으며, 제2세부과제는 개발된 유전자전달체를 바탕으로 심근염에서의 발현 효율 검증 및 치료효과를 연구하였으며, 제3세부과제는 개발된 유전자전달체를 이용하여 허혈성심질환에서 발현 효율 검증 및 치료효과를 연구하였다.
제1세부과제에서는 다양한 전사조절인자를 포함하는 다양한 Naked DNA 벡터를 제조한 바, 첫째, 인간사이토메갈로바이러스(HCMV) major immediate-early(MIE) 유전자의 프로모터와 비코딩서열들을 이용한 pCN, pCK 벡터; 둘째, 인간 housekeeping 유전자인 $EF-1{\alpha}$ 유전자와 ${\beta}$-actin 유전자의 프로모터 및 비코딩서열을 사용한 pEP, $p{\beta}Actin$ 벡터; 셋째, HCMV MIE 유전자의 enhancer 부분과 $EF-1{\alpha}$ 유전자의 core promoter 및 비코딩서열이 hybird된 형태인 pCEF 벡터; 넷째, adeno-associated virus(AAV)의 inverted terminal repeate(ITR)이 활용된 pCN-ITR과 pCK-ITR 벡터, 다섯째, HTLV-1LTR의 U3일부-R-U5일부 부위를 이용한 pCRN 벡터를 제조하였다. 또 EIAV 벡터의 유전자발현 프로모터를 변형하고 농축하는 방법을 확립하였다. 제조된 이들 벡터의 유전자 발현효율을 in vitro cell culture system과 in vivo mouse model에서 조사한 바, pCN, pCK 벡터의 유전자 발현효율이 in vitro와 in vivo 모두에서 전반적으로 가장 우수하였고 이에 pCK벡터를 가장 적합한 유전자전달체로 선택하였다 (Lee et at., BBRC, 272:230-235, 2000; 특허출원 미국, 유럽, 일본, 중국, 한국). 또 pCK벡터의 in vivo 적용을 위한 연구로서 Naked DNA 벡터 내에 오염된 대장균 게노믹 DNA의 양을 real time quantitative PCR법을 이용하여 신속하고 정확하게 정량하는 방법을 확립하였으며 gel filtration법을 통해 오염된 게노믹 DNA를 제거하는 법을 개발하였다.

Abstract ▼

The purpose of this study is to develop gene-based therapeutic products and technology for cardiovascular disease such as ischemic heart disease and myocarditis using naked DNA and lentiviral vector as gene delivery vehicles. To reach the goal, we have undertaken the following studies: First, we dev

The purpose of this study is to develop gene-based therapeutic products and technology for cardiovascular disease such as ischemic heart disease and myocarditis using naked DNA and lentiviral vector as gene delivery vehicles. To reach the goal, we have undertaken the following studies: First, we developed a series of gene delivery vectors and evaluated their performance both in vitro and in vivo; Second, using the developed vector system, we tested the effects of gene therapy on myocarditis; Third, using the developed vector system, we developed and evaluated the gene-based strategy for the treatment of ischemic heart disease.
First, we developed a series of gene delivery vector using naked DNA and lentiviral vector, and evaluated their gene trasfer efficiency both in vitro and in vivo. Results from these investigation can be summarized as follows:
1. We constructed pCN and pCK vector which contain the promoter and non-coding sequences of human cytomegalovirus(HCMV) major immediate-early(MIE) gene.
2. We also generated pEP, pβActin, pCEF, pCN-ITR, pCK-ITR and pCRN vectors by introduction and combination of various transcription regulatory elements such as the promoter and non-coding sequences of human housekeeping gene EF-1α and β-actin, HCMV MIE promoter, Adeono-associated virus(AAV) inverted terminal repeat(ITR) seqeunces, and human T-cell leukemia virus type I(HTLV-1) long terminal repeat(LTR) sequences.
3. As a lentivrial vector, EIAV(equine infectious anemia virus)-based gene delivery vehicles were evaluated. We also established the concentration technology of EIAV-based vector.
4. The comparative evaluation study of the above vectors showed that pCN and pCK vectors were most efficient gene delivery vehicles both in vitro and in vivo.
5. We established the technologies for detection and removal of host genomic DNA contaminants in naked DNA vector using real time quantitative PCR and gel filtration.
6. Finally, we generated a series of gene therapeutics using pCK as a platform vector; pCK-VEGF and pCK-HGF for ischemic cardiovascular diseases, pCK-lL-1Ra, pCK-sTNFrIg and pCK-vIL-10 for myocarditis.

목차 Contents

• Ⅱ. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...15
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...24
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...27
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획...31
• 6. 첨부서류...32
• Ⅲ. 제1세부연구개발과제 연구결과...123
• 1. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...124
• 2. 제1세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...126
• 3. 제1세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...130
• 4. 제1세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...138
• 5. 제1세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...139
• 6. 제1세부연구개발과제의 활용계획...141
• 7. 참고문헌...142
• Ⅲ. 제2세부연구개발과제 연구결과...143
• 1. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...144
• 2. 제2세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...145
• 3. 제2세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...149
• 4. 제2세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...150
• 5. 제2세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...151
• 6. 제2세부연구개발과제의 활용계획...152
• 7. 참고문헌...153
• Ⅲ. 제3세부연구개발과제 연구결과...155
• 1. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발 목표...156
• 2. 제3세부연구개발과제의 연구대상 및 방법...157
• 3. 제3세부연구개발과제의 최종 연구개발결과...158
• 4. 제3세부연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...167
• 5. 제3세부연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...169
• 6. 제3세부연구개발과제의 활용계획...170
• 7. 참고문헌...170