초록 ▼

혈장분획제제 중 혈액응고인자제제와 일부 면역글로불린제제는 혈장에 존재하는 다양한 단백질로부터 유효한 단백성분만을 선택적으로 분리 정제하기 위해 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 생산된다. 효율적인 cleaning 공정이 이루어지지 않는다면 크로마토그래피는 다양한 종류의 불순물뿐만 아니라 혈액 중 내재 또는 오염 가능성이 있는 위해인자가 오염될 가능성이 있기 때문에 cleaning 검증의 중요성이 강조되고 있다. Cleaning 검증은 제조공정중 행해지는 세척공정이 일관성 있게 다양한 종류의 불순물뿐만 아니라 감염성 위해인자를 제

혈장분획제제 중 혈액응고인자제제와 일부 면역글로불린제제는 혈장에 존재하는 다양한 단백질로부터 유효한 단백성분만을 선택적으로 분리 정제하기 위해 다양한 크로마토그래피 방법을 사용하여 생산된다. 효율적인 cleaning 공정이 이루어지지 않는다면 크로마토그래피는 다양한 종류의 불순물뿐만 아니라 혈액 중 내재 또는 오염 가능성이 있는 위해인자가 오염될 가능성이 있기 때문에 cleaning 검증의 중요성이 강조되고 있다. Cleaning 검증은 제조공정중 행해지는 세척공정이 일관성 있게 다양한 종류의 불순물뿐만 아니라 감염성 위해인자를 제품의 안전성, 효력, 순도 등의 quality에 영향을 미치지 않을 규정된 수준 이하로 제거하는 것을 체계적으로 검토하는 문서화된 일련의 검증행위라 할 수 있다. 혈장분획제제의 안전성 보증을 위해서는 크로마토그래피의 cleaning 공정에저 감염성 위해인자의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화가 필요하다. 본 연구에저는 혈장분획제제 제조공정에 사웅되는 크로마토그래피의 cleaning 공정에서 감염성 위해인자의 제거 및 불활화 공정의 검토 강화로혈장분획제제의 안전성을 확보하기 위해 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템을 구축하고자하였다. 이를 위해 다음과 같은 연구를 수행하였다.
1) 문헌에 나타난 cleaning 검증에 대한 관리 지침과 선진국 사례를 중심으로 혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 cleaning 공정의 바이러스 제거 및 불활화 방법의 효율성 검토
2) 국내 혈장분획제제 제조사에서 실시하고 있는 크로마토그래피 sanitization 공정(NaOH 처리 공정)과 열처리 공정의 바이러스 불활화 효율 검증 및 불활화기 작 규명
3) 크로마토그래피 sanitization 공정의 박테리아와 곰팡이 불활화효율 검증
4) 혈액에 오염 가능성이 있는 바이러스 중 물리 화학적 처리에 큰 저항성을 갖는 Hepatitis A virus (HAV)를 대상으로 Real-time PCR을 이용한 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템구축
5) 크로마토그래피 cleaning 검증을 위한 바이러스 spiking 실험법 확립
6) 구축된 크로마토그래피cleaning 검증 시스템의 적용 : SP-Sepharse 양이온 크로마토그래피 공정,Q-Sepharose 음이온 크로마토그래피 공정, Heparin affinity 크로마토그래피 공정에 적용
7) 구축된 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템의 적합성 평가
8) 제조사 및 식약청에 관련 기술 이전을 위한 SOP 작성
위와 같은 연구를 통해 혈장분획제제 제조공정의 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템을 구축하였다.

Abstract ▼

Manufacturing processes for blood products as well as other types of biopharmaceutical products using animal cell cultures have the risk of viral contaminations. Viral safety of the products is ensured through complementary manufacturing and quality control measures that include control of raw mater

Manufacturing processes for blood products as well as other types of biopharmaceutical products using animal cell cultures have the risk of viral contaminations. Viral safety of the products is ensured through complementary manufacturing and quality control measures that include control of raw materials, validation and implementation of effective virus clearance technology, and monitoring of final-filled product for the presence of virus. Recently, increasing attention has been focuses on establishing efficient cleaning procedures to prevent carry-over contamination from batch to batch. Treatment with NaOH is widely used for cleaning vessels, chromatography media and systems. Hepatitis A virus(HAV) is a frequent contaminant of plasma derivatives. Recently international regulation for the validation of HAV safety has been reinforced and increasing attention has been focused on establishing efficient cleaning procedures to prevent potential contamination of HAV. Infectivity assay using $TCID_{50}$ or plaque forming unit has been used for the validation study of virus clearance. However the infectivity assay can not be applied to the cleaning validation of chromatography process. Quantitative real-time PCR method can be an alternative to the infectivity assay in the case that infectivity assay can not work. In order to develop a cleaning validation system for chromatography during manufacture of plasma derivatives, following researches were conducted.
1) Literature review for the evaluation of the viral inactivation efficiency of chromatography cleaning methods conducted during manufacture of plasma derivatives
2) Evaluation of the efficiency of virus inactivation by NaOH and heat treatment for cleaning and sanitizing chromatography media and systems
3) Evaluation of the inactivation efficiency of bacteria and yeast by NaOH
4) Development of a quantitative real-time PCR assay for the cleaning validation of HAV
5) Method validation of the quantitative real-time PCR assay for the cleaning validation sensitivity, specificity, reproducibility, and limit of quantitative were validated.
6) Application of the cleaning validation system to chromatography process such as SP-Sepharose cation chromatography for thrombin production, Q-Sepharose anion chromatography for factoe VIII production, and heparin affinity chromatography for anti-thrombin III production
9) Evaluation of the cleaning validation system
9) Documentation of the standardization and Standard Operating Procedures (SOP) Through this study, a cleaning validation system for chromatography process was developed using a quantitative real-time PCR for HAV. The validation system was successfully applied to chromatography processes for manufacture of thrombin factor VIII and anti-thrombin III.

목차 Contents

• II. 총괄연구개발과제 연구결과...9
• 제 1 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...9
• 1.1 총괄연구개발과제의 목표...9
• 1.1.1. 연구배경...9
• 1.1.2. 연구목적...12
• 1.1.3. 연구범위...13
• 1.2 총괄연구개발과제의 목표달성도...13
• 1.3 국내$\cdot$외 기술개발 현황...15
• 1.3.1. 국내$\cdot$외 관련분야에 대한 기술개발 현황...15
• 1.3.2. 연구결과가 국내$\cdot$외 기술개발 현황에서 차지하는 위치...17
• 제 2 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 방법...19
• 2.1. 연구의 이론적 배경...19
• 2.2. 연구방법...20
• 2.2.1. 자료수집...20
• 2.2.2. 미국, 유럽 등 선진국 및 국제기구의 크로마토그래피 cleaning 검증에 대한 관리 지칭의 검토 및 분석...20
• 2.2.3. 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 cleaning 공정의 감염성 위해인자 제거 및 불활화...20
• 2.2.4. 국내 혈장분획제제 제조사에서 실시하고 있는 크로마토그래피 sanitization 공정의 세균 및 곰팡이에 대한 불활화 효율 검증...21
• 2.2.4.1. 균주의 배양...22
• 2.2.4.2. NaOH 처리에 의한 불활화 실험...22
• 2.2.5. 국내 혈장분획제제 제조사에서 실시하고 있는 크로마토그래피 sanitization 공정의 바이러스 불활화 효율 검증 및 불활화 기작 규명...22
• 2.2.5.1 바이러스 배양...23
• 2.2.5.2. 감염역가 시험법에 의한 바이러스의 정량...23
• 2.2.5.3. NaOH처리에 의한 바이러스 불활화...23
• 2.2.5.4. 열처리에 의한 HAV와 PPV 불활화...24
• 2.2.5.5. 바이러스 감소인수(Virus reduction factor)의 계산...24
• 2.2.6. 열처리에 의한 바이러스 불활화 기작 규명...24
• 2.2.7. Real-time PCR을 이용한 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템 구축...24
• 2.2.7.1. Primer의 선별...27
• 2.2.7.2. HAV의 검출을 위한 Reverse transcription(R-T)...27
• 2.2.7.3. 일반 PCR 최적화...27
• 2.2.7.4. Real-time PCR최적화...27
• 2.2.8. Real-time R-T PCR시험법의 신뢰성 검증...28
• 2.2.9. 구축된 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템의 적용...28
• 2.2.10. 구축된 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템의 적합성 평가...29
• 2.2.11. SOP를 작성하고 제조사 및 식약청에 관련 기술 이전...29
• 제 3 장 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 결과...30
• 3.1 크로마토그래피 cleaning 검증에 대한 관리 지침의 검토...30
• 3.2 문헌에 나타난 선진국 사례를 중심으로 혈장분획제제 제조공정에서 크로마토그래피 cleaning 공정의 바이러스 제거 및 불활화 방법의 효율성 검토...31
• 3.3 바이러스 불할화 공정에 대한 HAV와 PPV의 민감도 비교...31
• 3.3.1. NaOH처리에 의한 HAV와 PPV 불활화...31
• 3.3.2. 열처리에 의한 HAV와 PPV 불활화...35
• 3.3.3. NaOH 처리에 의한 BHV와 BVDV 불활화...37
• 3.3.4. NaOH 처리에 의한 세균 및 곰팡이 불찰화 효율 검증...42
• 3.3.5. Heparin Sepharose 6 Fast Flow resin의 NaOH 처리에 대한 기능적 안정성...46
• 3.3.6. HAV의 검출을 위한 R-T PCR과 정량분석을 위한 Real time R-T PCR...47
• 3.3.6.1. Primer의 선별...47
• 3.3.6.2. HAV의 검출을 위한 R-T PCR 최적화...48
• 3.3.6.3. HAV DNA 정량을 위한 Real-time PCR 최적화...49
• 3.3,7. Real-time R-T PCR의 신뢰성 검증...51
• 3.3.8. 크로마토그래피 cleaning 검증을 위한 바이러스 spiking 실험법...54
• 3.3.8.1. 크로마토그래피 cleaning 검증을 위한 바이러스 spiking 실험 절차...54
• 3.3.8.2. 크로마토그래피 공정의 scale-down 및 scale-down 공정의 검증...54
• 3.3.9. 구축된 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템의 적용...58
• 3.3.9.1. SP-Sepharose 크로마토그래피 cleaning 검증...58
• 3.3.9.2. Q-SephErose 크로마토그래피 cleaning 검증...59
• 3.3.9.3. Heparin-Sepharose 크로마토그래피 cleaning 검증...60
• 3.3.10. 구축된 크로마토그래피 cleaning 검증 시스템의 적합성 평가...62
• 3.3.11. SOP를 작성하고 제조사 및 식약청에 관련 기술 이전...63
• 제 4 장 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...64
• 제 5 장 총괄연구개발과제의 연구성과...67
• 5,1 활용성과...67
• 5.2 활용계획...68
• 제 6 장 기타 중요변경사항...69
• 제 7 장 참고문헌...70
• 제 8 장 첨부서류...73
• 붙임 1...74
• 붙임 2...79
• 총괄 연구과제 요약...83