초록 ▼

이 연구의 목적은 국내 수산발효식품에서 분리된 항균성 펩티드(s ubtile in)를 생산하는 Bacillus 를 수산발효식품 등의 위생학적 제조와 유통안전성을 증대시키는 방법으로 활용하고자 하는 것이다. 이를 위하여 한국의 재래 젓갈에서 항균성 펩티드를 생산하는 B. subtilis 균을 분리하고 항균성 펩티드 생산조건을 파악하였으며, 수산발효식품 등의 단백질 발효식품제조에 적용 방안 및 이에 필요한 protease 활성을 연구하고자 하였다. 본 연구에서 개발된 열안전성이 우수한 항균성 펩티드를 대량생산하는 균주는 막대형간균으로서

이 연구의 목적은 국내 수산발효식품에서 분리된 항균성 펩티드(s ubtile in)를 생산하는 Bacillus 를 수산발효식품 등의 위생학적 제조와 유통안전성을 증대시키는 방법으로 활용하고자 하는 것이다. 이를 위하여 한국의 재래 젓갈에서 항균성 펩티드를 생산하는 B. subtilis 균을 분리하고 항균성 펩티드 생산조건을 파악하였으며, 수산발효식품 등의 단백질 발효식품제조에 적용 방안 및 이에 필요한 protease 활성을 연구하고자 하였다. 본 연구에서 개발된 열안전성이 우수한 항균성 펩티드를 대량생산하는 균주는 막대형간균으로서, Gram 양성균이며, 호기적이었다. 그리고 V-P 반응에서 양성을 나타내었으며, $NO_3$를 $NO_2$로 환원시켰으며 전분을 가수분해시키는 능력을 나타내었다. 이 균주는 ${65^{\circ}C}$에서는 생육이 불가능하였으며 casein을 분해시켰다. 이 대량생산주를 Bergy`s manual에 따라 조사한 결과 Bacillus subtilis로 동정되었으며 이 분리주를 Bacillus subtilis CAU131로 명명하고 한국미생물보존센터에 2001년 3월 말 기탁되었다(KCCM 10257). 한편, 이 균주의 균주의 특허출원이 완료되었으며, subtilein으로 명명된 항균성 펩티드와 균주에 관련된 연구내용이 SCI 논문에 발표되었다.
항균성 펩티드 생산 B. subtilis를 B.H.I, L.B, M.R.S 등에서 배양시, B.H.I 배지에서 진탕배양하였을 때 균체의 성장도 가장 많았고 이에 따른 항균물질 생산 능력도 가장 우수하였다. ${37^{\circ}C}$에서는 7% 까지의 염 첨가시 생육이 가능하였으며 저온에서는 생육이 저해되었다. 생육이 가능한 최저온도는 ${15^{\circ}C}$정도로 밝혀졌다. 분리된 균주가 생산하는 항균성 펩티드는 이 펩티드를 생산하는 균주와 같은 계열인 바실러스 종에 강한 항균력을 나타내었으며, 병원성 식중독균인 E. coli O157:H7, Salmonella typimurium 등에도 항균력을 나타내었다. 그러나 그 항균력이 Bacillus 속의 경우보다 현저하게 약한 것으로 나타내었으며 전체적으로 비교적 좁은 범위의 항균력을 나타내고 있었다. 항균성 펩티드의 항균력은 10%까지 염을 첨가시 항균력에 전혀 영향을 미치지 않았다. 이 균이 생산하는 항균성 펩티드가 Mono-Q 이온교환크래마토그래피(FPLC)와 RP-C18 역상크래마토그래피(HPLC)를 통하여 약 3000 배 정도 정제되었으며, 정제된 펩티드는 약 5,000 Da의 분자량을 나타내었다. 이 펩티드의 항균력은 실온, pH 3-7의 범위에서 한달 이상 유지되었으며 ${90^{\circ}C}$의 열처리에서도 하루이상 활성이 실활되지 않았다. 이 펩티드는 pronase와 papain과 같은 단백질분해효소에 의하여 분해되었으며, chymotrypsin, alpha-amylase, beta-amylase, lipase 혹은 lipase 등은 활성에 영향을 미치지 못하였다. B. subtilis KCCM 10257이 생산하는 항균성 펩티드는 열에 대하여 상당히 안정하며, 80로 2시간을 가열시에도 활성이 대부분 유지되었다. 그러나 90 이상에서는 활성이 감소하기 시작하였으며, 100에서는 1시간의 가열로 전체활성의 약 20%가 감소하였다. 이같은 열에 대한 안정성은 식품첨가물로 사용시 여러 가지 장점을 부여할 수 있는 특성이다.
B. subtilis KCCM 10257 이 생산하는 항균성펩티드의 작용 메카니즘을 규명하기 위하여 지시균주(Bacillus subtilis ATCC 6633)를 항균성펩티드로 처리하고 전자현미경을 사용하여 형태학적 변화를 살펴보았다. 항균성펩티드를 처리후 지시균주 들은 대부분 세포벽이 파괴되었음을 관찰할 수 있었으며, 항균성펩티드가 세포벽의 안전성에 영향을 미쳐 지시균주가 사멸됨을알 수 있었다. 항균성 펩티드는 Amestes에서 유전돌연변이성을 나타내지 않았다.
이 항균성 펩티드를 생산하는 균주의 수산발효식품적용을 위한 단백질 분해효소가 정제되었으며 그 특성이 파악되었다. 상기균주에서 생산되는 단백질분해효소는 $(NH_4)_2SO_4$, Superdex G-75 겔크로마토그래피, Mono Q- 이온교환 수지를 통하여 정제되었으며, SDS Page를 통하여 분자량이 27500 Da으로 확인이 되었다. 이 효소는 casein이 첨가된 배지에서 casein을 분해하여 clearzone을 형성 시켰으며, 효소의 활성은 succinyl-Ala-Xaa-Pro-Phe-p-nitroa nilide 합성 펩티드의 분해능을 시험하여 확인이 가능하였다. 이 효소는 ${20-45^{\circ}C}$의 넓은 범위에서 비슷한 활성을 나타내었으며, ${55^{\circ}C}$ 이상에서는 단백질 분해효소의 변성으로 인하여 활성이 급속히 감소됨을 관찰할 수 있었다. 정제된 효소는 Xa a 로서 Ile 와 His 에 대하여 높은 활성을 나타내었으며, Km 및 Vmax 값은 각각 1.0068 mM과 23.59 U/mg 이었다.
항균성 펩티드를 16000AU/100g, 32000AU/100g씩 16%, 8% 가염 조미 오징어 젓갈에 넣어 숙성시키면서(${15^{\circ}C}$) 총균수와 첨가된 식중독 균주인 B.cereus의 생육에 미치는 효과를 살펴보았다. 박테리오신을 32000AU 첨가했을 때 총균수는 저장 8일 때까지, B.cereus는 5일 때까지 대조구에 비해 서서히 증가하는 경향을 보여주었다. 이후로는 첨가구와 비첨가구 사이에 별차이 없이 균수가 증가하였다. 16%염보다 8%염 오징어 젓갈에서 총균수의 증가는 빨랐으며 16000AU/100g 첨가했을 때 대조구에 비해 서서히 증가함을 알 수 있었다. B.cereus균을 접종하고 박테리오신을 첨가한 경우 16%염농도에서 박테리오신의 첨가에 의해 B.cereus균의 생육이 저해되었다. 8% 염의 조미 오징어 젓갈을 30일동안 10, ${15^{\circ}C}$에 저장하면서 박테리오신을 첨가하고 5일 간격으로 이화학적 변화를 측정하였다. pH는 저장일이 증가함에 따라서 낮아졌는데, ${10^{\circ}C}$에서 저장한 오징어 젓갈의 pH변화는 ${15^{\circ}C}$ 보다 느린 속도로 낮아졌으며, 박테리오신 첨가구와 비첨가구 사이에 차이가 없었다. 그러나 ${15^{\circ}C}$의 경우 첨가구의 pH가 저장 15일째부터 차이가 나기 시작하여 30일엔 pH 5.0 정도로 떨어졌다. 즉 박테리오신첨가에 의해 젓갈의 숙성이 빠르게 진행되어진 것 같다. 산도는 저장일수에 따라 증가하였고, ${10^{\circ}C}$에서는 박테리오신 첨가구와 비첨가구 사이에 pH변화가 전혀 없었으나 ${15^{\circ}C}$에서는 박테리오신 첨가구가 15일 후부터 더 빠르게 증가하였다. VBN의 경우 저장일수에 따라 증가하였는데, 15일 후 ${15^{\circ}C}$에서 박테리오신 첨가구와 비첨가구 모두 27mg%를 넘어 부패취를 내기 시작하였다. 오징어 젓갈의 주요 아미노산은 60% 이상의 Glu 그리고 Asp, His, Ala, Leu이었다. Asn은 오징어 젓갈 숙성 초에 있다가 15일 저장후엔 검출되지 않았다. ${10^{\circ}C}$ 저장시 박테리오신 첨가구와 대조구 모두 저장일수가 증가함에 따라 각각의 유리아미노산 함량도 증가하는 경향을 보였으며, 첨가구가 대조구에 비해 숙성중 정미 성분이라 할 수 있는 Glu의 함량이 많았다. 이와 달리 ${15^{\circ}C}$에서는 저장 15일후부터 각각의 유리아미노산이 감소하였다. 박테리오신 첨가구가 대조구에 비해 급격하게 감소하였다. 항균성 펩티드인 subtilein을 첨가시 오징어 젓갈은 ${10^{\circ}C}$에서 숙성시 유해균주인 B. cereus를 저해할 수 있었으며, 그 발효성질에 영향을 미치지 않았다. ${15^{\circ}C}$에서는 관능적 품질변화가 심하여 비적합한 것으로 판단되었다. 박테이오신의 기타 응용을 위하여 저염 조리굴젓을 제조하고 B.cereus의 생육억제효과를 살펴본 연구에서 개발된 subtilein은 오징어 젓갈에서와 마찬가지로 숙성시 굴젓의 유해 B.cereus 의 생육을 억제하는 것으로 나타났다. 그러므로 본연구에서 개발된 B. subtilis가 생산하는 박테이오신은 그 응용범위를 확대할 수 있는 가능성을 나타내었다.

Abstract ▼

Bacillus subtilis CAU131 (KCCM 10257) isolated from a fermented shrimp product produces subtilein, named tentatively as a bacteriocin which exhibited a bactericidal effect against closely related species such as B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778 and several other strains of Bacillus sp. Th

Bacillus subtilis CAU131 (KCCM 10257) isolated from a fermented shrimp product produces subtilein, named tentatively as a bacteriocin which exhibited a bactericidal effect against closely related species such as B. subtilis ATCC 6633, B. cereus ATCC 11778 and several other strains of Bacillus sp. The purification of the subtile in was achieved by applying a mono-Q anion exchange chromatography on FPLC and $C_{18}$ reverse-phase chromatography on HPLC. After these purification steps, a specific activity of subtilein was increased about 3,000 fold compared with culture broth and it exhibited a molecular mass of about 5,000 Da on SDS-PAGE. The antimicrobial activity of subtilein was well maintained at acidic and neutral pH leve ls between 3 and 8. Subtilein was relatively heat stable. Its antimicrobial activity lasted for 2 h at ${80^{\circ}C}$, and the inhibitory activity reduced during a subsequent heating process at ${100^{\circ}C}$. About 80% of residual activity was found after a 1 h incubation at ${100^{\circ}C}$. The treatment of subtilein led to morphological changes in stationary-phasecells of B. subtilis ATCC 6633 and most cells appered to be lysed.
Bacillus sp. are useful in industry for the production of many enzyme, antibiotic, and insecticides. Subtile in from B. subtilis KCCM 10257 was added to fermented squid (8% and 16% salt) by 16000AU/100g, 32000AU/100g and incubated at 10 and ${15^{\circ}C}$. Total cell number did not decreased by addition of B. subtilis KCCM 10257 and subtilein. In sample ainoculated with B. cereus, the growth of B.cereus was inhibited by addition of subtilein. Physicochemical and organoleptical properties were studied in fermented squid with subtilein. When squid was fermented at ${10^{\circ}C}$, no significant changes was detected in pH, total acidity, VBN value, and free amino acid content compared with control. However, these properties of fermented squid was changed and the score of organoleptic propertied decreased, if the quide was fermented at ${15^{\circ}C}$ with subtilein. This experiment was repeated with fermented oyster with subtilein. Subtilein exhibited similar inhibitory activity on the growth of B. cereusduring fermentation. This effect explains the application possibility of subtilein in other fermented proteineous foods.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 목차 ... 3
• Ⅰ. 연구개발결과 요약문 ... 4
• Project Summery ... 6
• Ⅱ. 총괄연구개발과제의 연구 결과 ... 7
• 1 . 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2 . 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 9
• 3 . 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 41
• 4 . 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 44
• 5 . 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 46
• 6 . 첨부서류 ... 46