초록 ▼

유전성 대사 질환은 효소의 결함으로 인해 전구 물질이 장기에 축적되어 퇴행성 병변을 가져오는 질환들이다. 이 질환의 일부에서 효소의 보충 요볍이나 골수 이식으로 부족한 효소를 보충하고자 하는 노력이 있었으나 효소의 보충요법은 경제성의 문제로 포기되고 골수이식도 HLA가 서로 맞는 공여자가 없으면 사망률이 높아 유전자 치료의 가능성이 탐색되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 질환의 모델로 헌터 증후군을 셜정하여 유전자 치료법을 시도하기 위한 기초 연구 및 실용화 기술을 개발하고자 하였다.
위의 목표를 달성하기 위하여 헌터 증

유전성 대사 질환은 효소의 결함으로 인해 전구 물질이 장기에 축적되어 퇴행성 병변을 가져오는 질환들이다. 이 질환의 일부에서 효소의 보충 요볍이나 골수 이식으로 부족한 효소를 보충하고자 하는 노력이 있었으나 효소의 보충요법은 경제성의 문제로 포기되고 골수이식도 HLA가 서로 맞는 공여자가 없으면 사망률이 높아 유전자 치료의 가능성이 탐색되고 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 질환의 모델로 헌터 증후군을 셜정하여 유전자 치료법을 시도하기 위한 기초 연구 및 실용화 기술을 개발하고자 하였다.
위의 목표를 달성하기 위하여 헌터 증후군을 보이는 환자들의 유전자 진단이 선행되었으며 이들로부터 비활성 IDS 효소를 가지는 섬유아세포주를 확보하였다. 이들 세포의 효소역가를 증가시키기 위한 시도로서 정상 유전자를 도입하기 위한 두가지 외부유전자 구조물을 구성하였다. 이들을 세포주에 전달하고 영구적으로 잔류시키기 위해 레트로 바이러스 벡터가 사용되었으며 유전자 조합 바이러스들은 CRIP 세포에서 생산되어 환자로부터 얻어진 섬유아세포주에 전달 되었다. 섬유아세포주에서 이들 외부유전자들의 존재를 확인하고 그 효소 활성이 측정되었다. 또한, 보다 나은 효소 전달 시스템을 구축하기 위하여 carrier cell로 사용될 골수모세포와 같은 성질이 있는 cord blood cell에서 CD 34+ rich population을 얻는 방법을 개발하였다. 이러한 실험은 향후 진행펼 임상 trial의 simulation model로서, cord blood세포의 transfection은 골수모세포나 말초골수모세포에 transfection 시키는 것과 같으며 환자의 fibroblast cell line은 환자의 mucopolysacharide가 침착된 장기를 나타낸다.
위 실험들을 통하여, 외부유전자를 포함한 바이러스 생산 세포주의 개발, 바이러스의 생산, 보충된 효소의 활성증가 확인 등이 수행되었다. 효소의 활성 측정은 환자의 진단방법이 될 뿐 아니라 효소의 활성을 전혀 보이지 않는 세포들의 외부효소에 의한 기질 전환능을 확인하는데 필요한 것으로 본 연구로 인한 진단기술의 국산화를 이루었다. 또한 이들 재조합 retrovirus들의 유용성을 증명하고 특허를 신청하였다. 이를 바탕으로 효소의 발현을 극대화시켜 생체에 적용할 수 있는 시스템을 확립하고자 하는 시도로부터 상당한 CD34+ 세포를 확보할수 있게 되었으며 효과적인 유전자 치료를 위한 계의 확립을 위한 coculture system의 유용성을 증명할 수 있었다.
유전성 대사질환은 각 질환별로 환자 수는 적으나 질환의 수가 많은 특정이 있고 그 원인이 효소의 이상에 기인하므로 본 연구에서 얻어진 결과들은 이와 유사한 다른 질환에도 같은 치료방식을 도입할 때 상당한 도움을 줄 수 있을 것으로 생각된다.

Abstract ▼

Inherited metabolic disorder IS mainly caused by deficiency of an enzyme, storage of undigested substrates, and degenerative pathology. For the cure of such diseases, enzyme supply or bone marrow transplantation were tried. However, enzyme replacement method calls for great financial support and bon

Inherited metabolic disorder IS mainly caused by deficiency of an enzyme, storage of undigested substrates, and degenerative pathology. For the cure of such diseases, enzyme supply or bone marrow transplantation were tried. However, enzyme replacement method calls for great financial support and bone marrow transplantation(BMT) was thought to have many problems because of its HLA compatibility and mortality. Therefore, the study of gene therapy in this type of disease was appeared inevitable. In this project, we select Hunter Syndrome as a model of metabolic disorder and tried to develope a protocol for gene therapy based on the applicable data.
To accomplish those objectives, we diagnosed the patients with Hunter syndrome and established fibroblast cell lines without IDS enzyme activity. In order to increase IDS activity we constructed two recombinant DNA containing normal IDS gene. We used retroviral vector for permanent gene expression of exogenous IDS in patient fibroblast. Those recombinant virus were produced from CRIP cell line and introduced to the fibroblast. We confirmed the existence of the exogenous IDS in the genomic DNA from the fibroblast, and the activity of the gene was revealed to be increased. In the study for improved enzyme transfer system, we developed the method to harvest CD34+ rich population from cord blood cell which had same characteristics with marrow stem cells. Those cells can be used as carrier cell for gene therapy. In the simulation for clinical trial, transfection to cord blood cell is same as a transfer to marrow stem cell or peripheral stem cell while, fibroblast cell line is mimicking patient's organ with mucopolysaccharide.
Through the whole study, we developed virus producing cell line with exogenous IDS gene having increased activity. It was possible for us to carry out enzyme assay which is also essential for confirmation of conversion activity as well as patient diagnosis. We requested the patent about the active retroviral vector and showed the usefulness the coculture system. Whole data from this project may be applied to introduction of new treatment for another genetic metabolic disorder.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제출문 ... 3
• 목차 ... 4
• 연구개발사업 최종보고서 요약문 ... 5
• Project Summery ... 6
• 총괄연구개발과제 연구결과 ... 7
• 1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표 ... 7
• 2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과 ... 10
• 3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론 ... 15
• 4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도 ... 19
• 5. 총괄연구개발과제의 활용계획 ... 20
• 6. 첨부서류 ... 21
• 7. 참고문헌 ... 21
• 끝페이지 ... 23