초록
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○ 연구결과
1. 버섯균주 선발
가. 녹차 및 양파추출물을 첨가한 고체배지 (PDA배지)에서 아가리쿠스, 영지, 느타리버섯의 균사체 생육이 활발 하였다.
나. 녹차 및 양파추출물을 첨가한 액체배지에서 아가리쿠스 균사...

○ 연구결과
1. 버섯균주 선발
가. 녹차 및 양파추출물을 첨가한 고체배지 (PDA배지)에서 아가리쿠스, 영지, 느타리버섯의 균사체 생육이 활발 하였다.
나. 녹차 및 양파추출물을 첨가한 액체배지에서 아가리쿠스 균사체의 생육이 가장 활발하였음. 따라서, 아가리쿠스버섯을 배지조성시험 및 유효성분생성시험에 이용하였다.
2. 액체배양 배지조성 개발
가. HK기본배지의 제조는 대두박분해물 0.1%, 황백당 1.2%, MgSO₄ㆍ7H₂O 0.0375%, KH₂PO₄ 0.0375%가 첨가된 액체배지를 HK기본배지라 함
나. HK기본배지에 탄소원 및 질소원을 각각 0.3%씩 혼합하여 배양할 때 균사체의 성장은 일부증가하였으나, 유효성분 (β-glucan)의 생성은 비슷하거나 오히려 줄어들었다. 따라서 이후 실험에서는 HK기본배지에 녹차열수추출물과 양파열수추출물을 첨가한 배지를 사용하였다.
다. 균사체량과 β-glucan생성량으로 볼 때 녹차분말 (0.5%), 양파분말 (1.0%)을 HK기본배지에 첨가하여 배양하는 것을 선택하였다.
3. 배양조건 확립
가. 최적 배양조건 구명 [seed배양 및 소량배양]
1) 삼각플라스크배양 (Seed 및 시험용액배양)에서는 25, 30℃에서 β-glucan의 생성이 가장높았다. 잡균오염에 대한 안전성을 고려할 때 25℃의 배양을 선택하였다.
2) 변온에 의한 균사체 자극에 의한 추가적인 β-glucan의 생성능력은 없었다.
3) 배양기간이 7일이상이되면 균사체의 개체성장보다는 부피만 커지면서 노화현상이 발생하여 seed 및 소량배양은 7일 이내 배양을 선택하였다.
나. 대량배양에서의 최적의 배양조건 구명
1) 녹차 및 양파분말을 추가로 첨가하여 녹차분말 0.5%, 양파분말 1.0%를 첨가한 배지에서 균사체의 함량과 β-glucan의 함량이 높았다.
2) 공기공급량 1v/v/m이었을 때 균사체의 생육이 양호하였다.
3) 배양온도 20, 25, 30℃ 범위내에서는 균사체의 생육과 β-glucan의 함량에 큰영향을 미치지 않았다.
4) 대량량배양에서 균사체의 생장은 3일이면 충분하며 그 이상 배양하면 균사체 크기는 커지지만 배양액표면에 균사체 노화 증거인 띠를 형성하였다.
4. 양파에 버섯균사체가 분비한 효소를 처리하여 β-glucan과 phytochemical 배당체생성
가. 배당체생성 확인과 제품개발
1) 녹차분말과 양파분말을 기본 액체배지에 혼합하여 배양한시료에서 β-glucan과 phytochemical(catechin, quercetin)의 배당체가 생성되었다.
2) 버섯균사체배양물로부터 효소를 분리한 다음, 녹차와 양파중의 phytochemical (catechin, quercetin)과 버섯이 분비한 β-glucan을 효소반응시켜 배당체를 생성시키고자한 실험에서도 배당체가 생성되었다.
3) 버섯균사체배양물로부터 분리한 효소를 처리하였을 때, 녹차제품의 향과 맛이 아주 좋은 제품이 개발되었음.
나. 배당체의 추출 및 분리
1) 녹차시료
가) DEAE cellulase column으로 80%에탄올침전물을 분리하였을 때 GT0.5시료로 부터 279~280nm에서 흡광을 갖는 2개의 peak를 얻었다.
나) TLC로 분리한 결과 Rf 0.08, 0.18에서 DAP과 UV모두에서 발색되는 물질이 분리됨으로써 이들 두 개의 벤드가 β-glucan catechin배당체로 추정된다.
다) HPLC에서 β-glucan catechin배당체를 재분리하였다.
2) 양파시료
가) DEAE celluloase coloumn으로 80%에탄올침전물을 분리하였을 때 ON1.0시료로 부터 279～280nm에서 흡광을 갖는 4개의 peak을 얻었다.
나) TLC로 분리한 결과 Rf 0.07, 0.12에서 DAP과 UV모두에서 발색되는 물질이 분리됨으로써 이들 두 개의 벤드가 β-glucan quercetin배당체로 추정된다.
다) HPLC에서 β-glucan quercetin배당체를 재분리하였다.
다. 구조확인
1) GT0.5-80EP와 ON1.0-80EP는 616.96~540.33 ㎝-1에서 흡광벤드가 나타남. 버섯균사체를 배양하지않은 녹차추출물과 양파추출물, 그리고 녹차추출물과 양파추출물을 첨가하지 않고 배양한 버섯균사체배양물에서는 발견되지않았다.
2) 이 특징적인 흡광벤드는 catechin과 quercetin표준품과 비교하였을 떄, sharp하지 않고 board하게 나타난 것이 특징이다.
3) 특징적인 UV흡광은 GT-80EP는 279nm와 350nm이었으며, ON-80EP는 279nm와 557nm이었다.
4) GC-MS를 이용하여 구성당을 확인한 결과, GT0.5-80EP의 경우 Glucose, xylose, 그리고 ON-80EP의 경우는 Glucose와 mannose가 확인되었다.
5. 기능성 조사
가. 항산화효과
1) Peroxide value (POV)
가) GT-80EP와 ON-80EP를 처리하였을 때 POV가 낮아 짐으로 항산화성이 있었다.
나) 처리 농도가 증가할 수록 POV의 감소가 크므로, 처리량에 따른 dose response를 보였다.
2) Free radical scavenging activity (DPPH)
가) GT-80EP는 34.2%의 free radical 제거능을 보인다. GT-80EP의 용매분획물중 EtOAc분획물의 free radical 제거능은 78.5%로 BHT (79.9%)와 유사한 활성을 나타내었다. Dose response를 나타내었다.
나) ON-80EP의 경우 21.3%의 free radical 제거능을 보임. ON-80EP를 용매분획한것중 EtOAc분획물의 free radical 제거능은 60.2%로 BHT (79.9%)보다는 약간 낮음. Dose response를 나타내었다.
3) Maloaldehyde (MA) 측정
가) GTC0.1-80EP의 MA생성억제효과는 대조군에 비해 53.7%로 BHT (57.8%)와 유사한 생성억제능을 보임였다. 이것을 다시 용매분획한 분획물중 ethyl acetate분획물은 70.2%의 억제능을보이므로써 BHT보다 높았다.
나) ON1.0-80EP의 경우 용매분획물중 EtOAc분획물이 30.4%로 BHT (57.8%)보다는 약간 낮은 MA 생성억제능을 보였다.
4) Superoxide (O2-) assay: NBT reduction
GT0.5-80EP의 Superoxide (O2- ) 제거능력은 처리구에 비하여 66%로 높은 Superoxide (O2- ) 제거능력이 있었다.
나. 세포독성 (S-180 cell)
1) GT0.5-80EP와 ON1.0-80EP는 각각 ED50 값이 2.9와 3.9 ㎍/㎖로 S-180세포에 대한 독성이 AG-80EP (5.5 ㎍/㎖), GTE (8.1 ㎍/㎖), ONE (11.0 ㎍/㎖)보다 높았다.
2) 기본배지에 녹차 및 양파분말의 첨가량이 클수록 세포독성이 높았다.
다. Mouse에 대한 항암성
1) 마우스에 GT0.5-80EP와 ON1.0-80EP를 처리함으로써 32,4 (127%연장), 30.6 (120%연장)의 수명연장효과가 있었고, 암에 전혀 걸리지 않은 마우스도 각각 2마리 (20%)와 1마리 (10%)가 있었다.
2) 기본배지에 녹차분말을 첨가하는 량이 많을 수 록 대조군 (24.5일)에 비해 32.2, 36.6, 42.2일로 131, 136, 142%의 수명연장효가 있었으며 10～20%에서는 치유효과가 나타났다.
3) 기본배지에 양파분말을 첨가하는 량이 많을 수 록 대조군 (24.5일)에 비해 30.2, 31.3, 33.2일로 123, 128, 136% 수명연장효가 있었으며, 최고농도에서 10%의 치유효과가 나타났다.
라. 항관절염성
1) Cytokine으로 활성화 시킨 ROS 17/2.8 cell에서의 NO 생성 억제 효과는 GTC0.1-80EP가 34.4%로 가장 높은 NO억제 효과를 나타내었다. 그 다음이 GT0.5-80EP이었다. 녹차추출물 또는 버섯균사체추출물보다 높은 억제 효과가 있었다.
2) iNOS 발현이 가장적은것은 GTC0.1-80EP (27.3%) 이었다.
마. 면역성
1) GT0.5-80EP, ON1.0-80EP의 섭취로 인하여 마우스의 T 세포와 B 세포의 증식을 증가시키고 혈장 C3함량을 증가시키므로 GT0.5-80EP의 섭취가 일반적으로 면역 능력증진에 효과가 있었다.
2) GT0.5-80EP, ON1.0-80EP의 섭취로 IL-1와 IFN-γ 생성능력이 향상되었다.
6. 제품화 기술개발
가. 버섯균사체녹차제품의 개발: 버섯균사체 배양물을 하등급의 녹차에 처리하여 발효시킨 제품으로, 향미가 우수하면서 여러 가지 생리활성을 갖는 고급 녹차가 개발되었다.
나. 양파제품의 경우는 차 또는 분말 보다는 액상제품으로 하는 것이 바람직할 것으로 생각되며, 양파음료의 단점인 양파향을 없애주며 기능성이 강화된 제품이 개발되었다.
7. 제품의 품질평가
가. 관능검사
1) GT0.5에서 맛과 향에서 기호도가 우수하였다.
2) ON1.0에서 맛과 향에서 기호도가 우수하였다.
나. 향기성분
맛과 향에서 기호도가 우수한 녹차제품 GT0.5의 향기성분
다. 맛
1) 녹차제품 (GT0.5)과 양파제품 (ON1.0)의 유리당은 sucrose, glucose, fructose였다.
2) 기본배지에서 배양한 균사체 배양액의 경우 oxalic acid와 succic acid가 함유되어 있었으며, 녹차분말을 첨가한 배지에서 버섯균사체를 배양한 제품에서는 malic와 malonic가, 양파분말을 첨가한 배지에서 버섯균사체를 배양한 제품에서는 oxalic, succinic acid가 함유되어 있었다.
8. 안전성
가. 단회투여독성 (급성독성)
GT0.25-80EP, GT0.5-80EP, ON0.5-80EP, ON1.0-80EP 시료를 각각 500㎎/㎏ mouse (15 ㎎/30 g) 경구투여시 급성독성을 보이지 않았다.
나. 장기투여 독성실험 (아급성독성)
GT0.25-80EP, GT0.5-80EP, ON0.5-80EP, ON1.0-80EP 시료를 각각 0, 15, 30, 60 ㎕/30 g mouse body weight 경구투여시 아급성 독성을 보지지 않았다.

Abstract
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Mycelial growth of Agaricus blazei, Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus on PDA medium containing green tea extract and onion ex...

Mycelial growth of Agaricus blazei, Ganoderma lucidum, Pleurotus ostreatus on PDA medium containing green tea extract and onion extract was active. Mycelial growth of Agaricus blazei in submerged liquid culture containing green tea powder and onion powder was most active. Thus Agaricus blazei was selected for the following experiment.
All of the submerged liquid culture media are based on the basal medium developed by HK Biotech. Carbon source (0.3%) and nitrogen source (0.3%) in addition to basal medium were tested for the mycelial growth enhancement and β-glucan production.
However, additional carbon and nitrogen source are not effective for the growth of mycelia and production of β-glucan. Therefore, green tea powder and onion powder were used for following experiment. Green tea powder (0.5%) and onion powder (1.0%) were selected for the following experiment considering the factors of β-glucan production and mycelial growth.
Optimum temperature for the production of β-glucan in the liquid culture of elenmyer flask was 25 and 30℃. Contamination of bacteria is less at 25℃, thus 25℃ was selected for the culture. Culturing periods of longer than 7days results enlargement of mycelial volume , and ageing of mycelia.
Dry weight of mycelia and β-glucan were high in the culture medium with green tea powder (0.5%) and onion powder (1.0%). The best airation condition for mycelial growth was 1v/v/m. Culturing period for the large size culture was in the best of 3days.
Catechin-β-glucan and quercetin-β-glucan were produced from mycelial culture in the medium containing green tea powder and onion powder. Catechin-β-glucan and quercetin-β-glucan were produced from the reaction of catechin and quercetin with -glucan by enzyme from mushroom mycelial culture. Commercial product was βdeveloped from green tea treated with mushroom mycelial culture.
Two peaks (UV absorbance 280nm) were obtained from GT0.5-80EP by DEAE by DAP and UV. They are suspected as glycone of catechin- β-glucan. Glycone of cellulose coloumn chromatography. Two spot at Rf 0.08 and 0.18 on TLC were colored by DAP and UV. They are suspected as glycone of catechin- β-glucan. Glycone of catechin-β-glucan were re-separated by HPLC. Four peaks (UV absorbance 280nm) were obtained from ON1.0-80EP by DEAE cellulose coloumn chromatography. Four spot at Rf 0.07 and 0.12 on TLC were colored by DAP and UV. They are suspected as glycone of catechin-β-glucan. Glycone of catechin-β-glucan were re-separated by HPLC. Typical IR spectrum GT0.5-80EP and ON1.0-80EP are shown absorption band at 616.96～540.33 cm^-1. This absorption band are not shown from the sample of green tea extract and onion powder extract. Maximum UV absorbance were shown at 279nm and 350nm from GT-80EP, and 279nm and 557nm from ON-80EP. Sugar composition of GT0.5-80EP analyzed by GC-MS were Glucose and xylose, and of ON-80EP were Glucose and mannose.
POV of linoleic acid were lowered by treatment of GT-80EP and ON-80EP indicating that they exhibit antioxidant activity. Dose responses on the lowering effect of POV were shown by both samples. Free radical scavenging activity (FRSA, 34.2%) was shown by GT0.5-80EP. FRSA of ethyl acetate fraction from GT-80EP were 78.5%, that was similar with BHT activity (79.9%). Dose response was shown for FRSA. Free radical scavenging activity (FRSA, 21.3%) was shown by ON1.0-80EP. FRSA of ethyl acetate fraction from GT-80EP were 60.2%, that was lower than BHT activity (79.9%).
Dose response was shown for FRSA. Inhibitory effect (53.7%) of GTC0.1-80EP on MA production was similar to BHT (57.8%). Inhibitory effect (70.2%) of ethyl acetate fraction from GTC0.1-80EP was higher than that of BHT. Inhibitory effect (30.4%) of ethyl acetate fraction from ON1.0-80EP was lower than that of BHT. Removal activity of Superoxide (O2-) of GT0.5-80EP was 66%, that is higher than control.
ED₅₀ of GT0.5-80EP and ON1.0-80EP against S-180cell were 2.9 and 3.9 ㎍/㎖, respectively. Cytotoxicity of these two samples were higher than that of AG-80EP (5.5 ㎍/㎖), GTE (8.1 ㎍/㎖), ONE (11.0 ㎍/㎖). Dose response was shown on cytotoxicity of these samples. Life span of mouse were extended by treatment of GT0.5-80EP and ON1.0-80EP as 32,4 (127% extension), 30.6 (120% extension). Extension of life span showed for dose response with 131, 136, 142% compared with control. 10～20% of mice were recovered from cancer. Extension of life span showed for dose response with 123, 128, 136% compared with control. 10% of mice were recovered from cancer. Inhibition (34.4%) of NO production in ROS 17/2.8 cell induced by Cytokine was high in the treatment of GTC0.1-80EP. iNOS expression (27.3%) was low by treatment of GTC0.1-80EP. Growth of T and B cell of mice were enhanced by treatment of GT0.5-80EP and ON1.0-80EP. Contents of Serum C3 in the mice increased by treatment of GT0.5-80EP. The production of IL-1 and IFN-γ were increased by treatment of GT0.5-80EP. Green tea fermented with mushroom mycelia was developed. The high quality product was produced from low grade green tea. Drink was developed from submerged mycelial cultured with onion powder. The flavour of onion was improved by culturing mushroom mycelia.
Product developed with GT0.5 and ON1.0 were the best for the sensory quality. Free sugar from GT0.5 and ON1.0 were sucrose, glucose, and fructose. Oxalic acid and succic acid from mushroom mycelia cultured in basal medium, malic acid and malonic acid from GT0.5, oxalic acid and succinic acid from ON1.0, L-alanineand, L-phenylalanine from GT0.5, and L-serine from ON1.0 were quantitated.
No toxicity were observed in GT0.25-80EP, GT0.5-80EP, ON0.5-80EP, ON1.0-80EP from the results of acute and subacute test.

목차
Contents
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• 표지 ... 1
• 제출문 ... 2
• 요약문 ... 3
• SUMMARY ... 20
• CONTENTS ... 23
• 목차 ... 27
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 31
• 제 1 절 연구개발 목적 ... 31
• 1. 기술개발의 최종 목표 ... 31
• 2. 단계별 목표 ... 32
• 제 2 절 연구개발의 필요성 ... 33
• 1. 기술적 측면 ... 33
• 2. 경제ㆍ산업ㆍ문화적측면 ... 34
• 제 3 절 연구개발 범위 ... 36
• 제 2 장 국내ㆍ외 기술개발 현황 ... 39
• 제 1 절 국내외 관련기술의 현황 및 문제점 ... 39
• 제 2 절 기술개발의 효과 ... 43
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 45
• 제 1 절 연구수행 방법 ... 45
• 1. 버섯균주 선발 ... 45
• 2. 버섯균사체배양용 배지조성 개발 ... 46
• 3. 배양조건 확립 ... 48
• 가. 배지조성 및 균주 ... 48
• 나. 최적 배양조건 구명 [seed배양 및 소량배양] ... 49
• 다. 대량배양에서의 최적의 배양조건 구명 ... 49
• 4. 녹차와 양파에 버섯균사체가 분비한 효소를 처리하여 β-glucan과 phytochemical 배당체생성 ... 51
• 가. 배양체생성 확인과 제품개발 ... 51
• 나. 배당체의 추출 및 분리 ... 51
• 5. 기능성 조사 ... 54
• 가. 항산화력 검증 ... 54
• 나. 세포독성 및 항암성 (S-180 cell에 대한 독성 실험) ... 56
• 다. Mouse에 대한 항암성 ... 56
• 라. 항관절염성 ... 56
• 마. 면역성 ... 57
• 6. 제품화기술 개발 ... 59
• 가. 버섯균사체 추출물제조 ... 59
• 나. 균사체 추출물 제품의 생산 ... 59
• 다. 버섯균사체액체 배양액을 이용한 분말 제품의 생산 ... 59
• 7. 제품의 품질평가 ... 60
• 가. 관능검사 ... 60
• 나. 향기성분의 분석 ... 60
• 다. 맛 성분의 분석 ... 60
• 8. 안전성 조사 ... 61
• 가. 단회투여 독성실험 (급성) ... 61
• 나. 장기투여 독성시험 (아급성) ... 62
• 제 2 절 연구결과 ... 63
• 1. 버섯균주 선발 ... 63
• 2. 액체배양 배지조성 개발 ... 66
• 3. 배양조건 확립 ... 72
• 가. 배지조성 및 균주 ... 72
• 나. 최적 배양조건 구명 [seed배양 및 소량배양] ... 72
• 다. 대량배양에서의 최적의 배양조건 구명 ... 75
• 4. 녹차와 양파에 버섯균사체가 분비한 효소를 처리하여 β-glucan과 phytochemical 배당체생성 ... 82
• 가. 배양체생성 확인과 제품개발 ... 82
• 나. 배당체의 추출 및 분리 ... 83
• 5. 기능성 조사 ... 100
• 가. 항산화력 검증 ... 100
• 나. 세포독성 및 항암서 ... 117
• 다. Mouse에 대한 항암성 ... 121
• 라. 항관절염성 ... 125
• 마. 면역성 ... 128
• 6. 제품화기술 개발 ... 135
• 가. 버섯균사체 녹차 ... 135
• 나. 균사체 엑기스 제품의 생산 ... 136
• 다. 버섯균사체양파음료 제조 ... 137
• 라. 버섯균사체액체 배양액을 이용한 분말 제품의 생산 ... 138
• 7. 제품의 품질평가 ... 139
• 가. 관능검사 ... 139
• 나. 향기성분 ... 141
• 다. 맛 ... 143
• 8. 안전성 조사 ... 148
• 가. 단회투여 독성실험 (급성) ... 148
• 나. 장기투여 독성시험 (아급성) ... 157
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 172
• 제 1 절 목표달성도 ... 172
• 1. 1차년도 ... 172
• 2. 2차년도 ... 173
• 3. 3차년도 ... 174
• 제 2 절 관련분야 기여도 ... 175
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 177
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술 정보 ... 179
• 제 7 장 참고문헌 ... 182
• 용어정리 ... 187
• 끝페이지 ... 189

연구자의 다른 보고서

참고문헌

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