초록 ▼

Ⅴ. 연구개발결과
본 연구개발사업에서는 3개의 세부과제로 구분하여 진행하였으며, 제 1세부(안동대학교)에서 는 다양한 주박 추출물의 제조 (총 110 종 추출물 제조) 및 이의 in-vitro 항혈전 활성, 항균, 항산화, 전분분해효소 억제활성을 평가하고, 최종적으로 생리활성 기반 유효조성물 제조 및 key molecule 의 구조분석을 담당하였으며, 제 2세부(안동대학교)에서는 제 1세부로부터 제공 된 다양한 시료들을 이용하여 항염증, 항비만, 암세포 생장억제 활성을 평가하였다. 제 1 협동 기관인 (주)국순당에서는 제 1세

Ⅴ. 연구개발결과
본 연구개발사업에서는 3개의 세부과제로 구분하여 진행하였으며, 제 1세부(안동대학교)에서 는 다양한 주박 추출물의 제조 (총 110 종 추출물 제조) 및 이의 in-vitro 항혈전 활성, 항균, 항산화, 전분분해효소 억제활성을 평가하고, 최종적으로 생리활성 기반 유효조성물 제조 및 key molecule 의 구조분석을 담당하였으며, 제 2세부(안동대학교)에서는 제 1세부로부터 제공 된 다양한 시료들을 이용하여 항염증, 항비만, 암세포 생장억제 활성을 평가하였다. 제 1 협동 기관인 (주)국순당에서는 제 1세부에서 제공된 시료들을 대상으로 미백활성, 주름개선 및 광노 화 억제 활성 등을 검증하였으며, 최종적으로 2종의 화장품원료(리조푸스/쌀발효추출여과물, 리조푸스/쌀발효물)를 신규 등록하고, 상업화를 위한 4종의 향장제품을 생산하였다. 현재 생산제품들은 [수불](물속의 불이란 뜻으로 술의 고어임) 이라는 브랜드로 상업화 대기 중에 있다.
제 1세부과제에서는 3종 탁주, 3종 약주, 1종 과일주, 1종 증류주, 3종의 국순당의 상업적 시설에서 사용하고 있는 누룩을 포함한 총 11종 시료에 대한 에탄올 추출물, 열수 추출물을 조제하였으며, 이들 추출물을 대상으로 순차적 유기용매 분획물을 조제하여, 제1 세부 실험에 사용함은 물론, 제 2세부 및 제 1협동기관에 제공하였다. 구체적으로 옛날막걸리 주박, 우국생 주박, 한방이화주 주박, 백세주 주박, 신도주 주박, 예담 주박, 명작복분자 주박, 고구마소주 주박 및 쌀로 만든 한방이화주 누룩, 옛날 막걸리 누룩 (2종 누룩 혼합제품), 국순당 누룩 (R4 누룩)을 대상으로 110종의 추출물 및 활성 분획물을 시료로 사용하였다. 각각의 주박에 대한 용매 추출 효율은 사용 용매에 따라 상이하였으며, 열수 추출물의 경우 옛날 막걸리, 신도주 주박에 서 높은 추출효율을 나타내었으며, 에탄올 추출의 경우에는 한방이화주, 옛날 막걸리, 우국생순으로 높은 추출효율을 나타내었다. 분획물의 경우, 열수 추출물은 헥센 분획물이 매우 미미하였으며, 에틸아세테이트 분획물은 한방이화주, 고구마 소주, 우국생 주박에서 높게 나타났다. 부탄올 분획물은 명작 복분자주, 고구마 소주, 백세주, 신도주, 예담 순으로 높게 나타났다. 열수 추출물의 대부분은 물 잔류물로 이행되었다. 11종 주박 및 누룩의 pH, brix, 색차, 알코올 함량, 영양성 등의 이화학적 특성 이후, 110종의 시료를 대상으로 유용성분(total flavonoid, total polyphenol, total sugar, reducing sugar)을 평가하였으며, 그 결과, 열수 추출물의 경우, 국순당 누룩의 에탈아세테이트 분획에서 가장 높은 polyphenol 함량이 나타났으며, total flavonoid의 경우, 명작복분자의 추출물, 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물, 또한 국순당누룩의 에틸아세테이트 분획물, 부탄올 분획물에서 높은 함량을 나타내었다. 전체적으로 각각 의 열수 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 다른 분획물보다 상대적으로 높은 total polyphenol 함량 및 total flavonoid 함량을 나타내었다. 한편 총당 및 환원당 함량 평가결과 물잔류물로 거의 이행됨을 확인하였다. 한편 에탄올 추출물의 경우, 백세주 주박, 우국생 주박, 한방 이화주 주박의 에탈아세테이트 분획에서 가장 높은 polyphenol 함량이 나타났으며, 고구마 소주 주박의 에탈아세테이트 분획에서도 높은 polyphenol 함량을 나타내었다. 반면, total flavonoid의 경우, 한방이화주, 백셎 및 명작복분자의 에틸아세테이트 분획물에서 탁월한 함량을 나타내었으며, 전체적으로 각각의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물에서 다른 분획물보다 상대적으로 높은 total polyphenol 함량 및 total flavonoid 함량을 나타내었다. 한편 항산화능 (DPPH 음이온 소거능, ABTS 양이온 소거능, 환원력 평가), nitrite 소거능 평가결과, 전체적으로 55종 열수 추출물 및 분획물 중, 높은 항산화 활성은 백세주, 명작 복분자, 고구마 소주 주박에서 나타났으며, 국순당 누룩, 옛날 막걸리 누룩, 한방이화주 누룩에서 나타나 누룩에 의한 생리활성이 나타남을 추측할 수 있었다. 에탄올 추출물의 경우, 열수 추출물보다 높은 항산화능을 나타내고 있으며, 55종 추출물 및 분획물 중 높은 항산화 활성은, 한방이화주, 백세주, 명작 복분자, 고구마 소주 주박에서 나타났으며, 국순당 누룩, 옛날 막걸리 누룩, 한방이화주 누룩의 에틸아세테이트 분획에서도 우수한 항산화 활성이 나타났다.
항혈전 활성의 경우, 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획에서 강력한 항응고 활성이 나타났으며, 특히 옛날막걸리, 명작복분자, 고구마 소주 및 한방이화주 누룩의 에틸아세테이트 분획은 15배 이상 혈전 생성을 지연시켜 상업적으로 사용되는 아스피린보다 우수함을 확인하였다. 또한 에탄올 추출물의 경우 상기의 활성 분획물 이외에도, 우국생, 한방이 화주, 백세주, 신도주 등 모든 전통주 주박의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획은 강력한 항응고 활성을 나타냄을 확인하였다. 한편, 110종 시료의 인간 혈소판 응집저해 활성 평가 결과, 열수 추출물의 경우 우국생 주박, 신도주 주박, 명작복분자 주박, 고구마 소주 주박 및 3종 누룩에서 높은 응집저해 활성을 나타내었으며, 가장 높은 활성은 우국생 주박의 헥센 분획물에서 나타났다. 따라서 향후 우국생 주박은 신규의 항혈소판 제제로 개발 가능하리라 판단되며, 국순당 누룩의 에틸아세테이트 분획물에서도 강력한 활성이 나타났다. 그러나 한방이화주 누룩의 에틸아세테이트 분획물처럼 일부는 혈소판 응집 촉진 활성을 나타내기도 하였다. 110 종 주박 추출물 및 분획물의 항혈전제로의 실제적 가능성 탐색의 일환으로 시료들의 인간 적혈구 용혈활성을 평가하였으며, 그 결과, 3종 누룩의 에탄올 추출물에서는 인간 적혈구 용혈 활성이 나타남을 확인하였다. 따라서 향후 주박 추출물 및 활성분획물의 경우, 에탄올 추출물보다는 열수 추출물 사용이 바람직함을 알 수 있었다. 또한 상업적으로 추출물 및 활성 분획물을 조제시에도 열수 추출이 에탄올 추출보다 안전성, 경제성, 간편성에서 보다 효율적이므로, 향후 향장소재 개발시에도 열수 추출물 사용이 바람직하다.
110 종 주박 추출물 및 분획물을 대상으로 4종의 그람양성 세균 및 4종의 그람음성 세균을 대상으로 항세균 활성을 평가하였으며, 그 결과, 한방이화주, 복분자주, 고구마 소주 및 국순당 누룩에서 우수한 항균력을 나타냄을 확인하였다. 항세균 활성은 향후 화장품 향장소재 개발시 참고자료로 활용될 것이다. 110 종 주박 추출물 및 분획물의 in-vitro 전분분해효소 억제 활성을 평가하였으며, 그 결과 백세주 및 명작 복분자주 주박에서 양호한 활성이 나타났으며, 옛날 막걸리 주박의 에탄올 추출물의 부탄올 분획물에서 가장 강력한 glucoamylase 저해활성이, 백세주 주박의 에탄올 추출물의 물 잔류물에서 가장 강력한 α-amylase 저해활성이 확인되었다. 이러한 결과는 다양한 주박 추출물 및 활성분획물이 전분분해효소 억제제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
최종적으로 다양한 활성들을 수치화하여 clustering한 결과, 명작복분자, 옛날 막걸리, 우국생및 백세주 주박의 에탄올 추출물의 에틸아세테이트 분획물을 선정하였으며, 20∼50 kg의 해당주박을 대상으로 에탄올 추출물을 대량 제조하였다. 이후 순차적 유기용매 분획을 실시하여 에틸아세테이트 분획을 대량 회수하였으며, 이를 대상으로 silica-gel chromatography, Preparative HP-TLC를 수행하고, 활성물질들을 HPLC-MS, GC-MS를 사용하여 분석하였다. 현재까지 확인된 물질들은 우국생 주박에서 1,4:3,6-Dianhydro-D-mannitol, Oxalic acid di-(2-phenylehtyl) ester, 백세주 주박 유래의 Hesperdin, Quercetin, 명작복분자 주박 유래의 Oxalic acid di-(2-phenylehtyl) ester, Quercetin 등이 다량 확인되었으며, 상기 3종의 주박 모두에서 항산화 활성 및 항혈전 활성이 우수한 phenolic compound 및 pyridoxine 등 19종의 물질들을 분리, 확인하였다. 확보 물질로는 gentisic acid, caffeic acid, ferulic acid, cinnamic acid, chlorogenic acid,, syringic acid, coumaric acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzoic acid, folic acid, ascorbic acid, kojic acid, vanillic acid, sinapic acid, catechin, pyridoxine, genistein, daidzein이다. 현재 이들의 항혈전 (혈액응고저해 및 인간 혈소판 응집저해) 및 항산화 활성이 우수함을 확인하고 인간적혈구 용혈활성이 없음을 확인하여, 향장제품 소재로 주박 추출물 및 활성 분획물이 적합함을 확인하였다. 특히 sinapic acid, hesperitin 등은 본 사업을 통해 최초로 항혈전 활성이 확인된 물질이다. 향후 사업 종료된 이후에도 (주)국순당과 함께, 지속적으로 이들 순수물질들의 향장제품 소재이용성 및 제품화 연구를 진행할 예정이다.
제2 세부과제에서는 1차년도에는 총 5 종의 주박과 누룩 추출물 및 이들의 유기용매 분획물에 의한 지방세포형성억제, 항염증 및 암세포 항성장 활성 등의 다양한 생리활성을 연구하였다. 처리한 추출물 중 W-Ju 주박의 ethyl acetate 분획물인 WPAc가 가장 높은 지방세포형성 억제활성을 보였다. 이는 oil Red O 염색과 pro-adipogenic 유전자의 발현 억제를 통해 확인하였다. 항염증 활성의 경우 B-Ju 주박의 ethyl acetate 분획물인 PAc 처리시 가장 높은 활성을 보여 주었다. 또한, PAc는 대장암 세포주인 HCT116의 생존율을 가장 많이 감소시켰으며, 항암 유전자인 NAG-1 과 ATF3 유전자의 발현을 증가 시킬 수 있음을 확인하였다. 이러한 연구결과는 전통주 제조시 사용되는 누룩과 부산물로 발생되는 주박 추출물 및 유기용매 분획물이 지방세포형성억제활성, 항염증 및 암세포 성장 억제활성을 가지고 있음을 시사한다.
2차년도에는 제1세부 과제로부터 제공받은 주박 및 누룩 시료 총 85종에 의한 항염증 활성을 연구하였다. 85종의 분획물 중 선별한 세 가지의 분획물 (KSD-E1-3, KSD-E2-3, KSD-E4-3) 에 의해서 LPS에 의해 염증이 유도된 RAW 264.7 세포주에서 nitric oxide 생산이 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한, 세가지 분획물에 의해 염증유발 유전자인 COX-2, TNF-alpha, 그리고 iNOS 유전자의 발현이 감소되었다. 세 가지 분획물 중 KSD-E4-3에 의한 항염증 활성의 작용기전을 이해하기 위하여 oligo DNA microarray를 수행하였다. 마이크로어레이 결과 발현이 감소된 유전자 중 염증과 관련된 유전자 6개를 (IL-1F6, iNOS, IL-10, Fabp4, IL-1RN, CSF2)를 선택하여, RT-PCR과 정량적 real-time PCR을 수행하였다. 그 결과, 모든 유전자의 발현이 감소됨을 확인하였다. 또한, 동일한 85종의 시료를 이용하여 대장암 세포주 모델에서 항성장 활성 연구와 활성기전을 연구하였다. 이들 중 세포생존율 연구결과에 따라 3가지 종류의 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3, KSD-E4-3)을 선별하였다. 이 중 가장 활성이 높은 KSD-E1-3 분획물에 의한 유전체 수준에서의 유전자 발현변화를 확인하기 위하여 oligo DNA microarray 실험을 수행하였다. 그 결과, 2배 이상 발현이 증가된 유전자들 가운데 항암 유전자인 NAG-1, ATF3, DDIT3 그리고 p21을 선별하여 추가 실험을 진행하였다. 세포생존율 결과에 따라 선별된 3가지 종류의 분획물(KSD-E1-3, KSD-E2-3 그리고 KSD-E4-3)에 의한 4가지 종류의 유전자의 발현을 확인한 결과, KSD-E1-3에 의하여 모든 유전자의 발현이 높게 증가되었다. KSD-E1-3에 의한 유전자의 발현이 전사조절인자 p53에 의존적인지 확인하고자 p53 null HCT116 세포주를 이용하여 RT-PCR한 결과, NAG-1, ATF3, 그리고 DDIT3 유전자 p53에 비의존적이었으며, 반면 p21 유전자는 p53에 의해서만 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
3차년도에는 고구마 소주로부터 획득한 에탄올 추출물 및 순차적 유기용매 분획물을 제조하고, 이들 시료가 LPS로 활성화된 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주에서 nitric oxide (NO) 생산과 세포생존율에 미치는 영향을 연구하였다. 처리한 시료 중 ethylacetate 분획물(KSD-E8-3) 처리군에서 LPS로 염증 유도된 RAW 264.7 세포주의 생존율에는 영향 없이 NO 생성을 현저하게 감소시킴을 확인하였다. 또한 분획물 KSD-E8-3 처리에 의해서 염증 매개 인자인 COX-2, iNOS 그리고 TNF-alpha의 유전자의 발현이 감소되었으며, iNOS 단백질의 발현이 현저히 감소됨을 Western blot으로 확인하였다. 또한, 분획물 KSD-E8-3 처리에 의해 세포내 대표적인 신호 전달 단백질인 3가지의 MAPK 단백질(p38, JNK, ERK1/2)의 인산화가 모두 억제됨을 확인하였다. 또한, 한방 이화주의 주박으로부터 ethanol 추출물과 그것의 순차적인 유기용매 분획물을 획득하고, 이들 시료들이 인간 대장암 세포인 HCT116 세포주의 cell viability와 pro-apoptotic 유전자인 ATF-3와 NAG-1의 발현에 미치는 영향을 연구하였다. 처리된 유기용매 시료 가운데 KSD-E3-2 분획물(hexane 분획물)과 KSD-E3-3 분획물(ethylacetate 분획물)의 처리에 의해 현저하게 세포생존율이 감소하였으며, 두 분획물에 의해 농도의존적으로 세포 생존율이 감소하였다. 또한, 두 분획물의 처리에 의해 pro-apoptotic 유전자인 NAG-1 과 ATF-3 의 유전자와 단백질의 발현이 증가함을 확인하였다. 특히, KSD-E3-3 분획물 0.1 mg/ml의 처리에 의해 NAG-1 단백질의 발현이 현저하게 증가하였으며, 또한 apoptosis의 지표인 PARP cleavage가 관찰되었다. 이러한 KSD-E3-3 분획물에 의해 유도된 apoptosis는 NAG-1 siRNA transfection에 의해 회복됨을 확인하였다. 따라서, KSD-E3-3 분획물에 의한 NAG-1 단백질의 발현증가와 apoptosis 간의 직접적인 관련성이 있음을 시사한다. 마지막으로, 1세부과제부터 제공받은 순수물질 11종에 대한 항염증 연구를 수행하였다. 그중 hesperetin에 NO 생성이 현저히 감소됨을 확인하였고, 이러한 NO 생성의 저해는 p38 MAPK를 통해 이루어진다는 것을 증명하였다.
참여기업인 (주)국순당에서는 주박의 화장품 소재로서의 기능을 확인하기 위하여 1세부로부터 주박 추출물 시료를 받아 미백과 주름예방 효과를 확인하였다. 시료는 옛날막걸리 주박, 우국생 주박, 한방이화주 주박, 백세주 주박, 신도주 주박, 예담 주박, 명작 복분자 주박, 고구마 소주 주박 및 쌀로 만든 한방이화주 누룩, 옛날 막걸리 누룩 (2종 누룩 혼합제품), 국순당 누룩(R4 누룩)을 대상으로 110종의 추출물 및 활성 분획물을 사용하였다. 미백활성을 스크리닝하기 위하여 in vitro tyrosinase 활성 저해력과 멜라닌 세포의 멜라닌생성 저해력을 확인하였으며 옛날 막걸리주박과 우국생 주박, 백세주 주박 에틸아세테이트 추출물에서 그 효과가 좋음을 확인하였다. 이러한 미백활성은 멜라닌을 형성하는데 핵심 효소인 tyrosinase와 이와 관련된 단백질인 TRP-1,2의 발현을 저해하여 나타나는 효과로 tyrosinase의 발현에 관련되는 cAMP-PKA-CREB-MITF의 기전 저해를 통하여 이러한 미백효과를 나타냄을 확인하였다. 또한 대표적인 기능성인 주름개선효과를 확인하기 위하여 시료를 처리하여 MMPs의 발현을 확인하였으며 옛날 막걸리 주박, 백세주 주박 에틸아세테이트 추출물, 누룩 추출물이 농도별로 MMPs의 활성을 저해하고 이러한 효과는 ERK, p38과 같은 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 인산화에 영향을 주고 NF-κB DNA-binding activity를 감소시킴으로서 MMP-9의 발현을 억제하여 주름예방 효과를 보임을 확인하였다. 건조 막걸리 주박의 중금속 제거력을 확인하여 이 새로운 기능을 바탕으로 미세먼지와 중금속 제거용 화장료 소재로 특허 출원하였으며, 최종 선정 물질인 우국생 에틸아세테이트 추출물의 S. aureus에 대한 항균활성과 사람 피부에 대한 자극 완화 활성을 확인하여 기존의 막걸리 추출물과는 다른 차별화를 바탕으로 시제품 4종을 개발하고 안정성 및 사용성을 평가하였다. 또한 백세주 추출물을 이용하여 원료화하고 시제품화 함으로써 소재 및 제품의 확장을 준비하고 있다.

Abstract ▼

In this study, to develop bio-active cosmoceutical compounds and fermentation-based cosmetics from the lees of Korean traditional fermentation wine, we have prepared 110 solvent extracts and their subsequent organic solvent fractions from 8 traditional wine lees (Yetnal makgeoli, wookukseng, Hanbang

In this study, to develop bio-active cosmoceutical compounds and fermentation-based cosmetics from the lees of Korean traditional fermentation wine, we have prepared 110 solvent extracts and their subsequent organic solvent fractions from 8 traditional wine lees (Yetnal makgeoli, wookukseng, Hanbang Ehwa-ju, Baekse-ju, Sindo-ju, Yedam, Bokbunja-ju, Sweet potato distilled lees), and 3 Korean nuruks (Ehwa nuruk, Yetnal makgeoli nuruk, Kooksungdang nuruk-R4). The prepared samples were analyzed their physicochemical properties, content of useful compounds (total polyphenol, total flavonoids etc), and different bio-activity, such as anti-inflammation, anti-proliferative, whitening, anti-wrinkle, anti-thrombosis, anti-oxidant, anti-diabetes, anti-microbial activities. Based on the bio-activity and active compounds correlation analysis using clustering and treeview program, finally, the lees of wookukseng, the lees of baekse-ju, and the lees of bokbunja-ju were selected for potent commercial source of bio-active cosmoceutical compounds and fermentation-based cosmetics. Now, we have enrolled two cosmetic ingredients (Rhizopus/Rice Fermented Extract-Filtrate, Rhizopus/Rice Fermented) and developed 4 different cosmetics named as 1) Soobul natural fermentation Cleansing Foam, 2) Soobul natural fermentation bath powder, 3) Soobul natural fermentation Cream, and 4) Soobul natural fermentation anti-aging, antioxidant ampoule which are ready to commercialization. The details research results are as follows.
Research team 1 : We have prepared 110 solvent extracts and their subsequent organic solvent fractions from 8 traditional wine lees, and 3 Korean nuruks for 3 years. The physicochemical properties of different lees and nuruk, the content of useful compounds were analyzed, and the anti-thrombosis, anti-oxidant, anti-diabetes, anti-microbial activities were systematically evaluated, The big data from 3 years analysis were commerced and the bio-activity and active compounds correlation analysis using clustering and treeview program were conducted, Based on commercial availability and activity, finally, the lees of wookukseng, the lees of baekse-ju, and the lees of bokbunja-ju were selected for potent commercial source of bio-active cosmoceutical compounds and fermentation-based cosmetics. The large scale ethanol extraction (20-50kg) of the above mentioned lees and subsequent ethylacetate fraction, silica-gel chromatography, Preparative HP-TLC lead to identification of active key molecules. Using HPLC-MS and GC-Mass, we have identified different phenolic compounds such as, gentisic acid, caffeic acid, ferulic acid, cinnamic acid, chlorogenic acid, syringic acid, coumaric acid, salicylic acid,, 4-hydroxybenzoic acid, folic acid,, ascorbic acid, kojic acid, vanillic acid, sinapic acid and catechin, pyridoxine, genistein, daidzein. The purified compounds did not show hemolysis activity against human red blood cell and showd strong anti-coagulation activity, human platelet aggregation inhibition activity, and anti-oxidant activity. Therefore, those active compounds could be applied to bio-active cosmoceutical compounds and fermentation-based cosmetics. Especially, in this study, the strong anti-thrombosis activity of sinapic acid and hesperitin were identified. To date, this is first report of in-vitro anti-thrombosis activity and these compounds could be developed as a promising anti-thrombosis agent.
Research team 2: In the first year, the study examined extracts from five different kinds of lees and nuruk and their organic solvent fractions in terms of several biological functions, such as anti-adipogenic, anti-inflammatory, and anti-proliferative activities. The anti-adipogenic activity was investigated by treating mouse pre-adipocyte 3T3-L1 cells with one extract (YE) and four organic solvent fractions (YAc, PAc, RAc, and WPAc) during adipogenesis. Among the treated samples, the ethyl acetate fraction of W-Ju lees (WPAc) showed the strongest anti-adipogenic effect, which was confirmed with oil red O staining and down-regulation of pro-adipogenic genes such as PPAR-gamma and SCD-1.Treatment with WPAc also reduced the expression of PPAR-gamma in a time-dependent manner. The effects of five different extracts were examined on nitric oxide (NO) production in mouse RAW 264.7 cells to determine anti-inflammatory activity. The ethyl acetate fraction of B-Ju lees (PAc) significantly decreased NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells and it also inhibited NO production in a dose-dependent manner. The PAc fraction also dramatically decreased the viability of human colorectal cancer HCT116 cells in a dose-dependent manner. In addition, PAc increased the expression of NAG-1 and ATF3 genes in a dose dependent manner. Overall, these results indicate that lees and nuruk have several biological functions, including anti-adipogenic, anti-inflammatory, and anti-proliferative activities. In the second year, we prepared eighty-five different kinds of solvent fractions of rice wine lees and nuruk extracts and investigated their effect on cell viability and nitric oxide (NO) production in mouse RAW 264.7 cells. Among the treated solvent fractions, only three solvent fractions (KSD-E1-3, KSD-E2-3 and KSD-E4-3) significantly decreased NO production in LPS-activated RAW 264.7 cells without affecting cell viability. And, they also reduced the expression of pro-inflammatory genes such as COX-2, TNF-alpha and iNOS. To underst nd the molecular mechanisms involved in the inhibition of inflammation in (KSD-E4-3)-treated RAW 264.7 cells, we carried out oligo DNA microarray analysis using Agilent Mouse microarray. To confirm microarray data, 6 genes (IL-1F6, iNOS, IL-10, Fabp4, IL-1RN and CSF2) were selected and performed RT-PCR and quantitative real-time PCR analysis with gene specific primers. The results of RT-PCR and real-time PCR agreed with microarray data. Overall, our results suggest that rice wine lees can be a novel resource for the development of foods and drugs which possess anti-inflammatory activity. And, also, we investigated their anti-proliferative activities against human colorectal cancer HCT116 cells. HCT116 cells were treated with eighty-five solvent fractions of lees extracts and then the cell viability was measured by using MTS assay. Among the treated solvent fractions, three solvent fractions (KSD-E1-3, KSD-E2-3 and KSD-E4-3) were selected based on cell viability assay. In addition, we performed oligo DNA microarray analysis to analyze gene expression changes by treatment of KSD-E1-3 in HCT116 cells. Among the up-regulated genes, we selected 4 genes (NAG-1, ATF3, p21, and DDIT3) and performed RT-PCR using gene specific primers. Among treated solvent fractions, KSD-E1-3 dramatically induced expression of four selected genes. In addition, we investigated whether up-regulation of those genes were dependent on transcription factor p53 presence or not using p53 null HCT116 cells. The results indicate that up-regulation of NAG-1, ATF3, and DDIT3 is not dependent on p53 presence, whereas p21 is dependent on p53 presence. These findings may help to understand the molecular mechanisms of anti-proliferative activity mediated by rice wine lees in human colorectal cancer cell. In the third year, we prepared ethanol extracts and their subsequent organic solvent fractions from lees of sweet potato soju and investigated their effects on cell viability and nitric oxide production in mouse macrophage RAW 264.7 cells. Among the organic solvent fractions, the ethyl acetate fraction of lees extracts significantly decreased nitric oxide production in LPS-activated RAW 264.7 cells without affecting cell viabilities. The ethyl acetate fraction reduced the expression of pro-inflammatory genes such as COX-2, iNOS and TNF-alpha and also decreased protein expression of COX-2 and iNOS. In addition, the treatment of the ethyl acetate fraction did inhibit p-ERK1/2 protein expression indicating that the ethyl acetate fraction regulates LPS-induced inflammatory response via suppressing ERK1/2 signaling pathway. Overall, these results may contribute to understand the molecular mechanism of anti-inflammatory activity by lees extracts of sweet potato soju. And also, we prepared ethanol extracts and their subsequent organic solvent fractions from lees of Ehwa Makgeolli containing oriental herbs, one of commercialized Korean traditional rice wines. We investigated their effects on cell viability and on the expression of pro-apoptotic NAG-1 and ATF3 genes in human colorectal HCT116 cells. Among the organic solvent fractions, the hexane fraction and the ethyl acetate fraction of lees extracts significantly reduced cell viability and these two fractions decreased cell viability in a dose dependent manner. And also, they induced expression of pro-apoptotic NAG-1 and ATF-3 genes. Especially, PARP cleavage was detected by the treatment of the ethyl acetate fraction and the PARP cleavage was recovered by transfection of NAG-1 small interfering RNA. These results indicate that NAG-1 is one of the genes responsible for apoptosis by the ethyl acetate fraction of lees extracts. Overall, our findings may help to understand the molecular mechanisms of anti-proliferative and pro-apoptotic activities mediated by lees of Ehwa Makgeolli. Finally, we purified eleven kinds of pure compounds from lees of Korean traditional rice wines and their effects on nitric oxide (NO) production in mouse macrophage RAW 264.7 cells were investigated. Among the pure compounds, hesperetin and naringenin significantly reduced NO production in LPS-stimulated RAW 264.7 cells without affecting cell viabilities. They also dramatically reduced the expression of pro-inflammatory genes such as COX-2, iNOS and TNF-alpha in a dose-dependent manner. In addition, hesperetin did inhibit phosphorylation of p38 MAP kinase indicating that hesperetin regulates LPS-induced inflammatory response via suppressing p38 MAP kinase signaling. Overall, the results may contribute to understand the molecular mechanism of the anti-inflammatory effects mediated by hesperetin purified from lees of Korean traditional rice wines.
Participation company 1: Korean traditional alcoholic beverage that uses Nuruk and grains, oriental herbs or fruits for fermentation. The purpose of this study was to develop cosmetic ingredients using Jubak, which is a by-product of alcoholic fermentation of traditional liquor. To investigate whitening, and anti-aging effects of Jubak, we prepared extract of Jubak and its solvent fractions. Ethyl acetate fraction of Makgeolli(KSD E1-3, KSD E2-3), Oriental herbal liquor (KSD E4-3) significantly inhibited in vitro mushroom tyrosinase activity and reduced the melanin contents in mouse melanoma melanocyte, B16F10 cells. In the studies on signaling pathways for skin whitening, Jubak extracts treated cells resulted in a decrease in the expression of tyrosinase, tyrosine-related protein (TRP-1, TRP-2), and microphthalmia-associated transcription factor (MITF). Treatment of cells with Jubak extracts attenuated the phosphorylation of protein kinase A (PKA) and dephosphorylated cAMP-responsive element binding protein (CREB). These results suggest that Jubak extracts suppresses melanogenesis through the inhibition of cAMP-PKA-CREB-mediated MITF and tyrosinase expression and could be a great potential candidate as cosmeceutical ingredients for skin whitening.
For anti-aging effects, inhibition of matrix metallo-proteinase (MMPs) expression was evaluated using human keratinocyte, HaCaT cells. Treatment of HaCaT cells with KSD E4-3 reduced expression of MMP-1, -2, -9 and inhibited proteolytic activities of MMP-2, -9. These results suggest that KSD E4-3 induces down-regulation of cellular melanogenesis and protects against photo-aging induced by UVB-induced damage. Thus KSD E4-3 could potentially be a valuable cosmetic ingredient. Jubak extracts reduced sodium lauryl sulfate-induced irritation in the human skin. We determined detoxication activities of Jubak powder. The effects of Jubak powder on removal of Pb and Cd were increased proportionally to the contents of Jubak powder. It means that Jubak powder could be a valuable cosmetic ingredient for removing heavy metal and particulate matter. Based on the results, we developed three cosmetic ingredients and also we made four types of cosmetic products.

목차 Contents

• 표지 ... 1
• 제 출 문 ... 3
• 요 약 문 ... 5
• SUMMARY ... 14
• CONTENTS ... 19
• 목차 ... 20
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 및 성과목표 ... 21
• 제 1 절 연구개발의 목적, 필요성 및 범위 ... 21
• 1. 연구개발의 목적 ... 21
• 2. 연구개발의 필요성 ... 21
• 3. 연구개발의 범위 ... 23
• 제 2 절 연구성과 목표 대비 실적 ... 24
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 32
• 제 1 절 국내외 관련분야 기술개발 현황 ... 32
• 1. 관련분야 국외 기술개발 현황 ... 32
• 2. 관련분야 국내 기술개발 현황 ... 33
• 제 2 절 연구결과가 국내외 기술개발 현황에서 차지하는 위치 ... 34
• 제 3 장 연구개발수행 내용 및 결과 ... 36
• 제 1 절 1세부과제 연구개발수행 내용 및 결과 ... 38
• 제 2 절 2세부과제 연구개발수행 내용 및 결과 ... 73
• 제 3 절 협동과제 연구개발수행 내용 및 결과 ... 109
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 143
• 제 1 절 1차년도 연구목표에 입각한 연구개발 목표 달성도 ... 143
• 제 2 절 2차년도 연구목표에 입각한 연구개발 목표 달성도 ... 144
• 제 3 절 3차년도 연구목표에 입각한 연구개발 목표 달성도 ... 145
• 제 4 절 연구수행에 따른 관련분야 기술발전 기여도 ... 146
• 제 5 장 연구개발 성과 및 성과활용 계획 ... 147
• 제 1 절 실용화․산업화 계획(기술실시 등) ... 147
• 제 2 절 교육․지도․홍보 등 기술확산 계획 등 ... 150
• 제 3 절 특허, 품종, 논문 등 지식재산권 확보계획 등현재 ... 150
• 제 4 절 추가연구, 타연구에 활용 계획 등 ... 150
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 151
• 제 1 절 관련분야 해외과학기술 정보 ... 151
• 제 7 장 연구시설 장비 현황 ... 152
• 제 8 장 연구실 안전관리 이행실적 ... 153
• 제 1 절 연구실 안전점검 체계 및 실시 ... 153
• 제 2 절 연구실 안전점검 이행실적 ... 155
• 제 9 장 참고문헌 ... 159
• 첨부 특허, 논문 및 시장분석 보고서 ... 170
• 끝페이지 ... 175