[국내논문]박쥐 맨아래구역 띠뇌실막세포의 Glial Fibrillary Acidic Protein에 대한 면역조직화학 및 면역세포화학적 연구 Immunohistochemical and Immunocytochemical Study about the Glial Fibrillary Acidic Protein in the Tanycytes of the Area Postrema of Bat원문보기
뇌실을 감싸는 뇌실막층은 대부분이 일반적인 뇌실막 세포로 이루어졌으나, 이들 세포 사이에 간혹 띠뇌실막 세포(tanycyte)가 분포하고 있다. 띠뇌실막세포는 일반적인 뇌실막세포와는 달리 뇌의 실질로 뻗은 매우 긴 기저돌기를 갖고 있다. 특히 제3뇌실의 뇌실막층에서 주로 연구된 띠뇌실막세포는 뇌실과 뇌실질의 혈관 혹은 신경세포와의 사이에 물질교환을 담당하는 것으로 추측되고 있으며, 띠뇌실막세포는 일반적인 뇌실막세포와는 달리 glial fibrillary acidic protein(GFAP)항체에 대해 양성반응을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 면역조직화학 및 면역금표지법을 이용하여 박쥐 맨아래구역을 감싸는 뇌실막층에서 GFAP 항체에 대해 양성반응을 보이는 세포의 분포여부 및 이의 미세 구조를 확인하고자 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 세로 절단한 절편을 대상으로 GFAP 항체를 이용하여 면역염색한 후 광학현미경으로 확인한 결과 맨아래구역을 감싸는 뇌실막층에 GFAP 양성반응을 보이는 세포가 관찰되었으며, 특히 맨아래구역의 목부분에서 양성반응 세포가 많이 모여 있었다. GFAP양성반응을 보이는 세포들은 매우 긴 기저돌기를 갖고 있었으며, 기저돌기에서도 매우 강한 GFAP 양성반응을 보였다. 세포체에서는 주변부에서 양성반응을 보였다. 전자현미경하에서 맨아래구역 띠뇌실막세포는 주로 ependymal tanycytes였으며, 자유면에 소수의 미세융모 및 세포질돌기가 관찰되었으나, 섬모는 관찰되지 않았다. 기저부에 특징적으로 긴 기저돌기를 갖고 있었으며 이 돌기에는 중간세사 및 세로로 길게 달리는 사립체가 발달되어 있었고, 세포체와 돌기에 지방방울이 산재되어 있었다. 금입자를 표지한 GFAP항체를 사용하여 면역 염색한 후 전자현미경으로 관찰한 결과 세포체에서 핵을 둘러싸는 중간세사에서 금입자를 관찰할 수 있었으며, 나머지 핵을 비롯한 다른 세포소기관이나 세포질에서는 관찰되지 많았다. 또한 기저돌기에서도 중간세사에서만 금입자를 관찰할 수 있었다. 이와 같은 본 실험의 결과는 박쥐 맨아래구역 뇌실막층에도 띠뇌실막세포가 존재하고 있으며, 이 세포의 발달된 긴 기저돌기는 띠뇌실막세포가 일반적인 뇌실막세포와는 다른 기능을 동면동물인 박쥐의 맨아래구역에서도 수행하고 있음을 암시하고 있으나 이를 확인하기 위해서 더욱 자세한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
뇌실을 감싸는 뇌실막층은 대부분이 일반적인 뇌실막 세포로 이루어졌으나, 이들 세포 사이에 간혹 띠뇌실막 세포(tanycyte)가 분포하고 있다. 띠뇌실막세포는 일반적인 뇌실막세포와는 달리 뇌의 실질로 뻗은 매우 긴 기저돌기를 갖고 있다. 특히 제3뇌실의 뇌실막층에서 주로 연구된 띠뇌실막세포는 뇌실과 뇌실질의 혈관 혹은 신경세포와의 사이에 물질교환을 담당하는 것으로 추측되고 있으며, 띠뇌실막세포는 일반적인 뇌실막세포와는 달리 glial fibrillary acidic protein(GFAP)항체에 대해 양성반응을 보이는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 면역조직화학 및 면역금표지법을 이용하여 박쥐 맨아래구역을 감싸는 뇌실막층에서 GFAP 항체에 대해 양성반응을 보이는 세포의 분포여부 및 이의 미세 구조를 확인하고자 시행하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 세로 절단한 절편을 대상으로 GFAP 항체를 이용하여 면역염색한 후 광학현미경으로 확인한 결과 맨아래구역을 감싸는 뇌실막층에 GFAP 양성반응을 보이는 세포가 관찰되었으며, 특히 맨아래구역의 목부분에서 양성반응 세포가 많이 모여 있었다. GFAP양성반응을 보이는 세포들은 매우 긴 기저돌기를 갖고 있었으며, 기저돌기에서도 매우 강한 GFAP 양성반응을 보였다. 세포체에서는 주변부에서 양성반응을 보였다. 전자현미경하에서 맨아래구역 띠뇌실막세포는 주로 ependymal tanycytes였으며, 자유면에 소수의 미세융모 및 세포질돌기가 관찰되었으나, 섬모는 관찰되지 않았다. 기저부에 특징적으로 긴 기저돌기를 갖고 있었으며 이 돌기에는 중간세사 및 세로로 길게 달리는 사립체가 발달되어 있었고, 세포체와 돌기에 지방방울이 산재되어 있었다. 금입자를 표지한 GFAP항체를 사용하여 면역 염색한 후 전자현미경으로 관찰한 결과 세포체에서 핵을 둘러싸는 중간세사에서 금입자를 관찰할 수 있었으며, 나머지 핵을 비롯한 다른 세포소기관이나 세포질에서는 관찰되지 많았다. 또한 기저돌기에서도 중간세사에서만 금입자를 관찰할 수 있었다. 이와 같은 본 실험의 결과는 박쥐 맨아래구역 뇌실막층에도 띠뇌실막세포가 존재하고 있으며, 이 세포의 발달된 긴 기저돌기는 띠뇌실막세포가 일반적인 뇌실막세포와는 다른 기능을 동면동물인 박쥐의 맨아래구역에서도 수행하고 있음을 암시하고 있으나 이를 확인하기 위해서 더욱 자세한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
There are a few tanycytes between the general ependymal cells lining the ependymal layer of the brain ventricle. These cells are considered as modified ependymal cells which possess a long basal process. Tanycytes are known to have an ability to communicate by absorbing substances from cerebrospinal...
There are a few tanycytes between the general ependymal cells lining the ependymal layer of the brain ventricle. These cells are considered as modified ependymal cells which possess a long basal process. Tanycytes are known to have an ability to communicate by absorbing substances from cerebrospinal fluid and transporting them to the blood vessels and/or to the neurons in the CNS. The third and fourth ventricular tanycytes were mainly studied as subjects but it's rare to find reports about the tanycytes of the area postrema. Glial fibrillary acidic protein is an intermediate filament protein that is expressed especially in astrocytes of the CNS. But GFAP is also found in filament of the tanycytes and its process. Therefore this study was carried out for the examination of the GFAP immunoreactive tanycytes lining the area postrema of the bat, and we also examined the ultrastructure of tanycytes using electron microscope. GFAP immunoreactive tanycytes were located in the caudal portion of the fourth ventricle, and especially mainly in the transitional zone between the floor of the caudal fourth ventricle and ependymal layer lining the area postrema. A few GFAP immunoreactive tanycytes were also found in the ependymal layer lining the area postrema, and some groups of tanycytes were found in the ependymal layer of the area postrema near the floor of the caudal fourth ventricle , The processes of tanycytes were stained deeply with anti-GFAP antibody. Especially the GFAP immunoreactive tanycytes lining the area postrema had very long processes that cross the whole width of the area postrema. In the electron microscope, the cell body of ependymal tanycyte was located on the ependymal layer and had a long basal process. Intermediate filaments were observed around the nucleus and well developed in the process of tanycrte. Longitudinal oriented long mitochondria and a few lipid droplets were also found in this process. After immunocytocheical staining, the gold particles were found only in the intermediate filaments. We could not determine the function of the tanycytes in the area postrema. Thus, further investigation is required to determine the functional relationship between the tanycytes and the area postrema in hibernating animal, the bat.
There are a few tanycytes between the general ependymal cells lining the ependymal layer of the brain ventricle. These cells are considered as modified ependymal cells which possess a long basal process. Tanycytes are known to have an ability to communicate by absorbing substances from cerebrospinal fluid and transporting them to the blood vessels and/or to the neurons in the CNS. The third and fourth ventricular tanycytes were mainly studied as subjects but it's rare to find reports about the tanycytes of the area postrema. Glial fibrillary acidic protein is an intermediate filament protein that is expressed especially in astrocytes of the CNS. But GFAP is also found in filament of the tanycytes and its process. Therefore this study was carried out for the examination of the GFAP immunoreactive tanycytes lining the area postrema of the bat, and we also examined the ultrastructure of tanycytes using electron microscope. GFAP immunoreactive tanycytes were located in the caudal portion of the fourth ventricle, and especially mainly in the transitional zone between the floor of the caudal fourth ventricle and ependymal layer lining the area postrema. A few GFAP immunoreactive tanycytes were also found in the ependymal layer lining the area postrema, and some groups of tanycytes were found in the ependymal layer of the area postrema near the floor of the caudal fourth ventricle , The processes of tanycytes were stained deeply with anti-GFAP antibody. Especially the GFAP immunoreactive tanycytes lining the area postrema had very long processes that cross the whole width of the area postrema. In the electron microscope, the cell body of ependymal tanycyte was located on the ependymal layer and had a long basal process. Intermediate filaments were observed around the nucleus and well developed in the process of tanycrte. Longitudinal oriented long mitochondria and a few lipid droplets were also found in this process. After immunocytocheical staining, the gold particles were found only in the intermediate filaments. We could not determine the function of the tanycytes in the area postrema. Thus, further investigation is required to determine the functional relationship between the tanycytes and the area postrema in hibernating animal, the bat.
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문제 정의
또한 이전에는 띠뇌실막세포의 분포 여부 및 광학현미경적인 연구는 주로 도은법을 이용하여수행하여 왔으나, 이 glial fibrillary acidic pro- tein(GFAP) 항체를 이용한 면역조직화학 염색법에 양성반응을 보인다는 보고(Redecker, 1989) 이후 띠뇌실막세포를 확인하는데 GFAP 면역염색법을 많이 사용하고 있다. 따라서 본 연구에서는 띠 뇌실막세포의 맨아래구역에서의 기능과 관련한 형태적인 연구의 일환으로 우선 GFAP 항체를 이용한 면역조직 및 면역세포화학 염색 법과 투과전자현미경을 이용하여 박쥐를 대상으로 GFAP 면역염색성 및 미세구조를 밝히고자 한다.
제안 방법
포획한 박쥐를 ether로 마취시킨 후 좌심실을 통하여 0.9% NaCl을 포함하는 0.1 M 인산염 완충액(PBS; pH 7.4, 4°C)으로 관류방혈시킨 다음 4°C 의 4% paraformaldehyde 고정액 (pH 7.4) 및 2% paraformaldehye-2.5% glutaraldehyde 고정 액으로 각각 관류고정한 후 뇌를 적출하였다. 이후 해부현미경하에서 맨아래구역을 확인하고 이를 절취하여 실험재료로 사용하였다.
1 M PBS로 수세한 다음 통상적인 방법에 따라 파라핀에 포매하였다. 이어서 7㎛ 두께의 연속절편을 제작한 후 일부는 광학현미경적 형태를 관찰하기 위하여 HE 염색을 시행하고, 일부는 GFAP에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다.
5°C에서 3일간 항온처리한 후 xylene으로 파라핀을 제거하였다. 면역염색은 ABC kit(Vector,USA)를 이용하였으며, 각 단계의 과정이 끝난 다음에는 항체의 조직투과성을 높이기 위해0.1% triton X-100을 포함하는 0.1 M PBS로 10분간 수세하였다. 면역조직염색에 앞서 우선 paraforamlde- hyde에 의한 항원성의 차단을 제거하기 위하여 0.
5% 과산화수소를 포함하는 methyl alcohol에 30분간 처리하였다. 이어서 조직내 비특이 면역반응을 없애기 위해 normal goat serum에 2시간 동안 처리한 후 1차 힝체로는 mouse anti-GFAP antiserum(Biogenex, USA)을 사용하였으며, 이어서 2차 항체로 biotinylated IgG를, 3차 항체로 avidin- bio tin - peroxidase complex (ABC)를 사용하였다. 면역염색이 끝난 조직절편은 0.
이어서 조직내 비특이 면역반응을 없애기 위해 normal goat serum에 2시간 동안 처리한 후 1차 힝체로는 mouse anti-GFAP antiserum(Biogenex, USA)을 사용하였으며, 이어서 2차 항체로 biotinylated IgG를, 3차 항체로 avidin- bio tin - peroxidase complex (ABC)를 사용하였다. 면역염색이 끝난 조직절편은 0.05% diaminobenzidine을 용해한 0.05M tris-HCl 완충액 (pH 7.6)에 0.01% 과산화수소를 첨가한 용액으로 발색시킨 후 광학현미경으로 관찰하였다.
4% paraformaldehyde로 관류고정한 재료를 동일한 고정액에 2시간 동안 더 고정한 다음 오스미움산에 의한 후고정 없이 알콜 농도순으로 탈수하고 LR white를 침투시킨 후 60°C에서 24시간 동안 중합시켜 포매하였다. 이후 Sorvall MT-5,000 ultramicotome을 이용하여 1㎛ 두께의 절편을 제작하고 광학현미경으로 맨아래 구역을 확인한 후 초박절편을 작성하고 nickel grid에 부착시켰다.
침투시킨 후 60°C에서 24시간 동안 중합시켜 포매하였다. 이후 Sorvall MT-5,000 ultramicotome을 이용하여 1㎛ 두께의 절편을 제작하고 광학현미경으로 맨아래 구역을 확인한 후 초박절편을 작성하고 nickel grid에 부착시켰다.
조직절편을 포함하고 있는 nickel grid를 증류수에 잠깐 띄워 함수시킨 다음 0.01 M 인산염완충액 (pH 7.2)에 용해시킨 1% bovine serum albumin에 10분간 처리하여 비특이면역염색반응을 차단하였다. 이후 절편을 rat anti-GFAP antiserum (1 : 200, Zymed, USA)에 실온에서 2시간 동안 처리한 후, 0.
2)에 용해시킨 1% bovine serum albumin에 10분간 처리하여 비특이면역염색반응을 차단하였다. 이후 절편을 rat anti-GFAP antiserum (1 : 200, Zymed, USA)에 실온에서 2시간 동안 처리한 후, 0.01 M 인산염 완충액 (pH 7.2)으로 세척하고 이 어서 입자크기 6nm의금입자를 포함하는 gold-conjugated IgG(l: 100, Jack-son, USA)> 실온에서 1시간 동안 처리하여 금 입자를 표지시켰다. 위의 전과정에서 각 단계의 시약 처리는 조직절편이 아래쪽을 향하도록 grid를 띄워서 실시하였다.
Immunogold labelling이 끝난 조직절편은 인산염 완충액과 증류수로 각각 세척하고 건조시킨 후 uranylacetate 및 lead citrate로 이중 염색하여 Joel 1,200 EXII 투과전자현미경으로 관찰하였다.
2% paraformaldehyde -2.5 % glutaraldehyde로 관류고정한 재료를 동일한 고정액에서 2시간 동안 더 고정시키고, 0.1 M 인산염완충액 (pH 7.4, 4°C)으로 수세하였다. 이어서 4°C의 1% 오스미움산 용액에서 1시간 동안 후고정하고 동일한 완충액으로 수세한 후, 통상적 인 방법에 따라 epon 혼합액에 포매하였다.
4, 4°C)으로 수세하였다. 이어서 4°C의 1% 오스미움산 용액에서 1시간 동안 후고정하고 동일한 완충액으로 수세한 후, 통상적 인 방법에 따라 epon 혼합액에 포매하였다. 포매된 시료를 ultramicrotome으로 두께의 절편을 제작한 후 toluidin blue로 염색하여 광학현미경으로 맨 아래 구역을 확인하고 초박절편을 작성하여 uranylacetate 및 lead citrate로 이중 염색한 후 Joel 1200 EXII 투과전자현미경으로 관찰하였다.
이어서 4°C의 1% 오스미움산 용액에서 1시간 동안 후고정하고 동일한 완충액으로 수세한 후, 통상적 인 방법에 따라 epon 혼합액에 포매하였다. 포매된 시료를 ultramicrotome으로 두께의 절편을 제작한 후 toluidin blue로 염색하여 광학현미경으로 맨 아래 구역을 확인하고 초박절편을 작성하여 uranylacetate 및 lead citrate로 이중 염색한 후 Joel 1200 EXII 투과전자현미경으로 관찰하였다.
1 M PBS로 10분간 수세하였다. 면역조직염색에 앞서 우선 paraforamlde- hyde에 의한 항원성의 차단을 제거하기 위하여 0.4% pepsin을 포함하는 0.01 N HCl 용액에 37°C 에서 30분간 처리하고, 내재하고 있는 조직내 과산화효소의 활성을 제거하기 위하여 0.5% 과산화수소를 포함하는 methyl alcohol에 30분간 처리하였다. 이어서 조직내 비특이 면역반응을 없애기 위해 normal goat serum에 2시간 동안 처리한 후 1차 힝체로는 mouse anti-GFAP antiserum(Biogenex, USA)을 사용하였으며, 이어서 2차 항체로 biotinylated IgG를, 3차 항체로 avidin- bio tin - peroxidase complex (ABC)를 사용하였다.
대상 데이터
1. 실험재료
실험동물로는 강원도 원주시 신림면 소재 자연동굴에서 포획한 안주애기박쥐 (Vesperlilo superans)를 사용하였다. 포획한 박쥐를 ether로 마취시킨 후 좌심실을 통하여 0.
5% glutaraldehyde 고정 액으로 각각 관류고정한 후 뇌를 적출하였다. 이후 해부현미경하에서 맨아래구역을 확인하고 이를 절취하여 실험재료로 사용하였다.
성능/효과
1). 세로절단한 절편에서 맨아래구역을 감싸는 뇌실막세포층에 GFAP 양성반응을 보이는 세포가 비교적 잘 관찰되었으며, 특히 맨아래구역의 목 부분에는 GFAP 양성반응을 보이는 세포들이 집단을 이루고 있음을 알 수 있었다. GFAP 양성반응 세포들은 대부분 긴 기저돌기를 갖고 있었으며, 기저돌기 역시 GFAP에 양성반응을 보였다.
전자현미경을 이용하여 관찰한 결과 맨아래구역의띠뇌실막세포는 대부분 세포체가 뇌실면에 존재하는ependymal tanycyte였으며 , subependymal tanycyte는관찰할 수 없었다. 맨아래구역을 감싸는 일반적인 뇌실막세포는 비교적 납작한 모양을 이루는데 비해 띠뇌실막세 포는 불규칙한 원주모양이었다.
, 1981). 본 실험에서 동면동물인 박쥐의 맨아래구역을 감싸는 뇌실면에서 일반적인 뇌실막세포 사이에 긴 기저돌 기를 갖고 있는 세포를 관찰할 수 있었는데 전자현미 경하에서 이 세포는 띠뇌실막세포의 특징인(Brawer & Walsh, 1982; Flament-Durand & Brion, 1985) 기저 돌기에 발달한 중간세사와 세로로 길게 달리는 사립 체가 관찰되 었고, 세포체 및 기저돌기에서 지방방울 이 관찰되었다. 또한 GFAP 항체를 이용한 면역염색 에 이 세포가 양성반응을 보여 띠뇌실막세포임을 확 인할 수 있었고, 면역금입자를 표지한 후 전자현미경 하에서 관찰한 결과 금입자는 이 세포의 중간세사에 서만 나타났다.
본 실험에서 동면동물인 박쥐의 맨아래구역을 감싸는 뇌실면에서 일반적인 뇌실막세포 사이에 긴 기저돌 기를 갖고 있는 세포를 관찰할 수 있었는데 전자현미 경하에서 이 세포는 띠뇌실막세포의 특징인(Brawer & Walsh, 1982; Flament-Durand & Brion, 1985) 기저 돌기에 발달한 중간세사와 세로로 길게 달리는 사립 체가 관찰되 었고, 세포체 및 기저돌기에서 지방방울 이 관찰되었다. 또한 GFAP 항체를 이용한 면역염색 에 이 세포가 양성반응을 보여 띠뇌실막세포임을 확 인할 수 있었고, 면역금입자를 표지한 후 전자현미경 하에서 관찰한 결과 금입자는 이 세포의 중간세사에 서만 나타났다. 이처럼 GFAP에 대한 면역양성반응으 로 인해 띠뇌실막세포를 태생기 방사아교세포에서 유 래하였을 것이라는 주장이 있으나(Edward et al.
또한 세포질 및 기저돌 기에서 관찰된 발달된 사립체와 기저돌기에 발달한 GFAP 양성 반응을 보이는 중간세사 등은 기저돌기 를 통한 물질수송을 할 수 있는 또다른 증거라 할 수 있다. 이에 연관하여 제4뇌실의 띠뇌실막세포의 기저 돌기는 뇌실질의 monoaminergic 신경원과 뇌척수액 사이 에 물질교환을 매개 한다는 보고 (Cunnings & Felton, 1979)로 미루어 맨아래구역 띠뇌실막세포도 맨 아래구역 실질의 혈관은 물론 monoamine 성 신경원 과 관계를 이룰 수 있는 것으로 사료되며,본 연구에 서도 이 구역의 띠뇌실막세포의 기저돌기가 혈관이 나 신경원과 관계하여 주행하는 것을 전자현미경하 에서 확인할 수 있었다.
후속연구
띠뇌실막세포의 기능과 관련하여 이 세포가 steroid (Brawer & Walsh, 1982)나 serotonin (Knigge et al., 1976) 등을 합성하여 분비하는 것으로 주장하는 연구 자도 있으나, 본 연구에서 띠뇌실막세포의 세포질에 이들을 합성하는 세포소기관인 rER이나 sER 혹은 polyribosome 등의 발달을 관찰할 수 없었으므로 띠 뇌실막세포가 물질을 합성하는 기능이 있다면 매우 한정된 범위일 것으로 사료된다. 박쥐 맨아래구역의 뇌실막층에 분포하는 띠뇌실막세포의 자유면에서 섬 모가.
, 1997), 본 연구에서 띠뇌실막세포의 기 저돌기가 혈관과 연관되게 분포하는 것이 관찰되었 으므로 맨아래구역 띠뇌실막세포의 동면에 따른 형 태변화를 추론할 수 있다. 본 연구에서 확인된 맨아 래구역 띠뇌실막세포의 기저돌기가 신경세포와 관여 하며 주행하는 결과와 제4뇌실 띠뇌실막세포가 뇌실 질의 monoamine 성 신경세포와 관여한다는 사실 (Cunnings & Felton, 1979)을 연계시켜 볼 때 맨아래 구역의 띠뇌실막세포 역시 이 구역에 존재하는 mon-oamine성 신경세포 특히 세로토닌이나 카테콜아민 신경세포와 관여할 수도 있는 것으로 사료되며, 따라 서 띠뇌실막세포가 수면 또는 동면과도 기능적인 연 관성을 갖고 있을 것으로 추론할 수 있으나, 이를 확 인하기 위해서는 앞으로 각 monoamine에 대한 항체 와 GFAP 항체를 이용한 이중 금표지 방법 등으로 보다 자세한 연구가 요구되는 것으로 사료된다.
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