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문제 정의
- 본 연구에서는 환자들을 사상체질로 분류하여 체질에 맞게 질병을 치료해야 한다는 사상의학에 근거하여 지원자들을 태음인, 소양인 그리고 소음인으로 분류하였다. 그들의 혈액에서 분리한 사상체질 면역세포 모델을 이용하여 먼저 생식 원료(쌀, 보리, 율무, 가지, 무, 당근, 표고, 양송이, 목이)의 면역 활성을 알아보았고, 생식 원료의 면역 활성 결과를 활용하여 최상의 면역 활성을 가진 체질 맞춤형 생식제품을 개발하고자 하였다.
- 사상의학에서는 사람들은 각 개인의 체격, 얼굴형태, 성격, 정서 및 약물에 대한 반응성 등의 차이에 의해 4가지 체질 즉 태양인, 태음인, 소음인, 소양인으로 분류하며 이들 각 체질마다 약에 대한 효과가 다르기 때문에 체질마다 처방하는 약을 다르게 하였고(32), 체질에 맞는 약을 섭취하였을 때 체질이 맞지 않는 사람이 섭취했을 때보다 면역 활성이 증가하여 질병이 예방되거나 치료가 되는 것으로 알려져 있다(30). 따라서 체질에 따른 체질 맞춤형 건강기능성식품 개발은 최상의 건강기능성 효과를 얻을 수 있는 식품 개발 형태가 될 수 있을 것으로 판단되어 본 연구에서는 사상의학 개념을 도입하였다. 그리고 태음인, 소양인 및 소음인 지원자의 혈액에서 얻은 면역세포 모델이 체질 특이성을 그대로 가지고 있다는 연구보고들(30,33)에 의해 본 연구에서도 태음인, 소양인및 소음인 지원자의 혈액에서 얻은 세포 모델을 사용하였다.
- 생식 원료의 연구 결과를 바탕으로 생식제품 개발을 위한 혼합 원료를 제조하였고 이들 혼합 원료의 면역 활성을 알아보았다. 즉 태음인, 소양인 그리고 소음인 혈액에서 분리한 면역세포(림프구, 대식세포)에 배합비 1∼6(Mix 1∼6) 추출물을 처리하여 세포 증식율, NO 생성량 및 TNF-α 단백질 생성량을 알아본 결과는 Fig.
제안 방법
- cell/mL 농도의 세포를 96-well plate에 100 μL씩 분주한 후 시료(500 μg/mL) 20 μL와 LPS(2 μg/mL)를 첨가하여 다시 44시간 배양하였다. 대조군은 B세포 mitogen인 LPS만 처리 하였다.
- 0% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군은 대식세포를 활성화시키는 LPS만 처리하였다.
- 림프구는 시료의 세포 증식능 변화를 보기 위해 사용하였고, 부착된 monocyte를 대식세포로 활성화시켜 시료 처리후 NO 생성능과 TNF-α 분비능 변화를 알아보기 위해 사용 하였다.
- 본 연구에서는 환자들을 사상체질로 분류하여 체질에 맞게 질병을 치료해야 한다는 사상의학에 근거하여 지원자들을 태음인, 소양인 그리고 소음인으로 분류하였다. 그들의 혈액에서 분리한 사상체질 면역세포 모델을 이용하여 먼저 생식 원료(쌀, 보리, 율무, 가지, 무, 당근, 표고, 양송이, 목이)의 면역 활성을 알아보았고, 생식 원료의 면역 활성 결과를 활용하여 최상의 면역 활성을 가진 체질 맞춤형 생식제품을 개발하고자 하였다.
- 사상의학은 한국 고유의 전통 한의학으로 4가지 체질 즉 태양인, 태음인, 소음인, 소양인으로 분류한다. 새로운 기능성 생식제품을 개발하기 위하여 태음인(Taeumin), 소양인(Soyangin) 그리고 소음인(Soeumin)의 혈액으로부터 분리한 면역세포(림프구와 대식세포)를 이용하여 생식 원료(쌀, 보리, 율무, 콩, 팥, 차조, 가지, 무, 당근, 표고버섯, 양송이버섯, 목이버섯)와 생식제품의 면역 활성을 연구하였다. 생식 원료와 생식제품 추출물들을 처리한 면역세포에서 세포 증식율, NO와 TNF-α의 증가를 면역 활성의 지표로 사용하였다.
- 생식 원료와 생식제품 추출물들을 처리한 면역세포에서 세포 증식율, NO와 TNF-α의 증가를 면역 활성의 지표로 사용하였다.
- 이 혼합액을 다시 4개의 50 mL-conical tube에 반으로 나눈 후 혈액과 DPBS 혼합층이 ficoll 층 위로 뜰 수있도록 ficoll-paque(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)를 conical tube 아래로 조심스럽게 넣어준 후 원심분리(53×g, 15 min)하였다. 원심분리 후 혈액에서 ficoll 층 위쪽의 면역세포층을 얻어 DPBS로 3회 세척과 원심분리를 반복하여 순수한 면역세포를 얻었다. RPMI 1640 배지로두 번 더 세척하여 남아있는 DPBS를 완전히 제거하였다.
- 위의 방법으로 제조된 생식 원료 추출물을 dimethyl sulfoxide( DMSO; Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 녹인 후 RPMI 1640(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA) 배지에 첨가하여 500 μg/mL 농도로 제조한 후 0.45μm Millipore membrane filters(Sartorius, Goettingen, Germany)로 여과하여 실험에 사용하였다.
- 이러한 결과를 근거하여 생식제품 개발을 위하여 생식 원료의 종류와 배합비율을 달리하여 배합비 1∼6(Mix 1∼6)을 개발하였다.
- 즉 TNF-α ELISA kit에서 제공하는 희석용액 50 μL를 96-well plate에 분주한 후 배양액 시료 또는 제공된 표준용액을 각각 50 μL씩 첨가하고 실온에서 2시간반응시켰다.
- 즉 배양된 세포에 배지 100 μL와 Griess reagent 시약 100 μL를 혼합하여 570 nm에서 ELISA reader(BioTek Instruments)를 사용하여 측정하였다.
대상 데이터
- 각 지원자들로부터 혈액 채취는 강원대학교 부속 병원 임상병리과 전문가의 지원을 받아 혈액 50 mL씩 2회 채취한후 신속히 아이스박스에 넣어서 20분 이내 실험실로 운반하여 본 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 생식 원료인 쌀(백미), 보리, 율무, (노란)콩, 팥, 차조, 가지, 무, 당근, 표고버섯, 양송이버섯, 목이버섯은 춘천 시내 대형마트(Chuncheon, Korea)에서 구입 하였거나 체질식 전문 업체 (주)쓰리앤포바이오(Wonju, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다.
- 본 연구의 연구대상은 강원대학교 식품생명공학 전공 재학생들 중 질병이 없고 건강한 지원자들 중 Choi 등(30)이 개발한 체질 감별법을 통해 정확한 체질이 판별된 태음인(Taeumin), 소양인(Soyangin) 그리고 소음인(Soeumin) 각각 6명씩 선발하였다. 선발된 지원자들(나이: 20∼25세)에게 실험 전 본 연구 목적에 대하여 설명한 후 개별적으로 서면동의를 받았다.
- 선발된 지원자들(나이: 20∼25세)에게 실험 전 본 연구 목적에 대하여 설명한 후 개별적으로 서면동의를 받았다.
- 쌀(milled rice), 팥(adzuki bean), 무(radish) 그리고 표고버섯(Lentinus edodes)을 태음인을 위한 생식 원료로 선택하였고, 보리(barley), 콩(soybean), 가지(eggplants) 그리고 양송이버섯(Agaricus bisporus)을 소양인을 위한 생식 원료로 선택하였으며, 율무(Job's tears), 팥(adzuki bean), 당근(carrot) 그리고 목이버섯(Auricularia auricula- judae)을 소음인을 위한 생식 원료로 선택하였다.
- 여액을 회전식진공 농축기(EYELA, Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 후 동결건조하여 4°C 냉장고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Mean values with different letters (a-c) on the bars in the same constitution are significantly different (P<0.05) according to Duncan's multiple range test.
- Mean values with different letters (a-d) on the bars in the same constitution are significantly different (P<0.05) according to Duncan's multiple range test.
- 실험 결과의 통계처리는 SPSS ver 12.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 평균값을 분산분석(oneway ANOVA test) 후 Duncan의 다중검정법으로 P<0.05수준에서 유의적 차이를 검정하였다.
이론/모형
- Choi 등(30)의 방법에 따라 배양 후 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, Sigma-Aldrich Co.] 용액을 DPBS에 5 mg/mL의 농도로 희석하여 20 μL씩 각 well에 첨가하여 4시간 동안 재배양 하였다.
- TNF-α능은 상업적 human TNF-α ELISA kit(Amersham Biosciences, Glattbrugg, Switzerland)을 사용하여 Amersham Biosciences 사에서 제공한 제품 사용설명서에 따라 측정하였다.
- 따라서 체질에 따른 체질 맞춤형 건강기능성식품 개발은 최상의 건강기능성 효과를 얻을 수 있는 식품 개발 형태가 될 수 있을 것으로 판단되어 본 연구에서는 사상의학 개념을 도입하였다. 그리고 태음인, 소양인 및 소음인 지원자의 혈액에서 얻은 면역세포 모델이 체질 특이성을 그대로 가지고 있다는 연구보고들(30,33)에 의해 본 연구에서도 태음인, 소양인및 소음인 지원자의 혈액에서 얻은 세포 모델을 사용하였다. 본 연구에서 사상체질 중에서 태양인을 제외한 태음인, 소양인 그리고 소음인 그룹뿐인 것은 태양인은 한국인의 전체 인구의 0.
- 즉 배양된 세포에 배지 100 μL와 Griess reagent 시약 100 μL를 혼합하여 570 nm에서 ELISA reader(BioTek Instruments)를 사용하여 측정하였다. 배양한 후에 생성된 NO는 Griess법으로 측정하였다.
- 시료의 NO 생성 저해 활성은 Nitrite Assay(30)를 사용 하여 측정하였다. 즉 배양된 세포에 배지 100 μL와 Griess reagent 시약 100 μL를 혼합하여 570 nm에서 ELISA reader(BioTek Instruments)를 사용하여 측정하였다.
성능/효과
- NO 생성과 TNF-α의 단백질 생성량도 세포 생존율과 유사한 경향을 나타났으나 소음인에서 분리한 대식세포의 경우 쌀과 율무 추출물 처리군은 NO 생성량이 비슷한 수준으로 증가하였고 보리 추출물보다 높았다.
- NO 생성량 및 TNF-α 단백질 생성량 증가를 알아보기 위해서는 이들 추출물을 태음인, 소양인 그리고 소음인의 혈액에서 분리된 대식세포에 처리한 결과 세포 생존율과 유사한 경향을 나타내었다(Fig. 4B, 4C).
- 가지, 무 그리고 당근 추출물을 태음인, 소양인 그리고 소음인의 혈액에서 분리된 대식세포에 처리하여 NO 생성량과 TNF-α 단백질 생성량을 알아본 결과 세포 증식율과 유사한 경향을 나타내었다(Fig. 3B, 3C).
- 그리고 TNF-α의 단백질 생성량은 태음인에서 분리한 대식세포에 쌀과 율무 추출물을 처리한 군은 비슷하게 증가하였으나 보리 추출물 처리군보다 높았다.
- 대식세포에서 분비된 NO 생성량과 TNF-α 생성량도 배합비 1과 2의 추출물 처리군이 다른 처리군보다 높았다.
- 따라서 태음인의 면역력 증진을 위해서는 배합비 1(Mix 1: 쌀 70%, 팥 20%, 무 5%, 표고 5%)과 배합비 2(Mix 2; 쌀 60%, 팥 20%, 무 10%, 표고 10%)가 적당하고 특히 무와 표고버섯의 비율이 높은 배합비 2가 배합비 1보다 태음인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다. 소양인의 면역력증진을 위해서는 배합비 3(Mix 3: 보리 70%, 콩 20%, 가지 5%, 양송이 5%)과 배합비 4(Mix 4: 보리 60%, 콩 20%, 가지 10%, 양송이 10%)가 적당하고 특히 가지와 양송이버섯 비율이 높은 배합비 4가 배합비 3보다 소양인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다.
- 4). 따라서 표고버섯과 목이버섯은 태음인과 소음인에게 좋은 음식이고 양송이버섯은 소양인에게 좋은 음식인 것으로 생각된다.
- 배합비 3과 4를 처리한 소양인의 혈액에서 분리된 림프구와 대식세포는 다른 처리군보다 림프구 증식율이 높았고, 대식세포의 NO 생성량과 TNF-α 단백질 생성량도 다른 처리군보다 배합비 3과 4 추출물 처리군에서 높았다.
- 배합비 6(Mix 6: 율무 60%, 팥 20%, 당근 10%, 목이 10%)를 처리한 면역세포의 면역 활성 증가는 다른 5개의 추출물들(Mix 1∼5)보다 높았다.
- 세포 증식율, NO 생성율 증가 및 TNF-α 단백질 수준 증가율 결과를 종합하여 보면, 태음인과 소음인의 면역 활성을 위해서는 3가지 추출물들 중 팥과 차조 섭취가 좋고, 소양인에게 좋은 음식은 콩이라는 것을 알 수 있었다.
- 소양인의 면역 활성은 6개의 배합비(Mix 1∼6) 추출물 중에서 배합비 4(Mix 4: 보리 60%, 콩 20%, 가지 10%, 양송이 10%) 처리에 의해 최고로 높았다.
- 따라서 태음인의 면역력 증진을 위해서는 배합비 1(Mix 1: 쌀 70%, 팥 20%, 무 5%, 표고 5%)과 배합비 2(Mix 2; 쌀 60%, 팥 20%, 무 10%, 표고 10%)가 적당하고 특히 무와 표고버섯의 비율이 높은 배합비 2가 배합비 1보다 태음인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다. 소양인의 면역력증진을 위해서는 배합비 3(Mix 3: 보리 70%, 콩 20%, 가지 5%, 양송이 5%)과 배합비 4(Mix 4: 보리 60%, 콩 20%, 가지 10%, 양송이 10%)가 적당하고 특히 가지와 양송이버섯 비율이 높은 배합비 4가 배합비 3보다 소양인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다. 소음인의 면역력 증진을 위해서는 배합비 5(Mix 5: 율무 70%, 팥 20%, 당근 5%, 목이 5%)와 배합비 6(Mix 6: 율무 60%, 팥 20%, 당근 10%, 목이 10%)이 적당하고 특히 당근과 목이버섯 비율이 높은 배합비 6이 배합비 5보다 소음인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다.
- 소양인의 면역력증진을 위해서는 배합비 3(Mix 3: 보리 70%, 콩 20%, 가지 5%, 양송이 5%)과 배합비 4(Mix 4: 보리 60%, 콩 20%, 가지 10%, 양송이 10%)가 적당하고 특히 가지와 양송이버섯 비율이 높은 배합비 4가 배합비 3보다 소양인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다. 소음인의 면역력 증진을 위해서는 배합비 5(Mix 5: 율무 70%, 팥 20%, 당근 5%, 목이 5%)와 배합비 6(Mix 6: 율무 60%, 팥 20%, 당근 10%, 목이 10%)이 적당하고 특히 당근과 목이버섯 비율이 높은 배합비 6이 배합비 5보다 소음인의 면역 증진에 더 좋은 배합비로 판단된다.
- 소음인의 혈액에서 분리한 림프구와 대식세포에 배합비 1∼6의 추출물을 각각 처리한 결과 배합비 5와 6이 다른 처리군보다 림프구 증식율, 대식세포의 NO 생성량과 TNF-α 단백질 생성량이 증가하였고, 특히 배합비 6 추출물 처리는 세포 증식율, NO 생성량과 TNF-α 단백질 생성량 모두 다른 처리군보다 유의적으로 증가하였다.
- 본 실험에 사용한 배합비는 Table 1과 같다. 즉 배합비 1(Mix 1)은 쌀 70%, 팥 20%, 무 5% 그리고 표고 5%, 배합비 2(Mix 2)는 쌀 60%, 팥 20%, 무 10% 그리고 표고 10%, 배합비 3(Mix 3)은 보리 70%, 콩 20%, 가지 5% 그리고 양송이 5%, 배합비 4(Mix 4)는 보리 60%, 콩 20%, 가지 10% 그리고 양송이 10%, 배합비 5(Mix 5)는 율무 70%, 팥 20%, 당근 5% 그리고 목이 5%, 배합비 6(Mix 6)은 율무 60%, 팥 20%, 당근 10% 그리고 목이 10%였다.
- 즉 태음인과 소음인은 무와 당근 추출물을 처리한 군이 가지 추출물 처리군보다 더 효과적으로 NO와 TNF-α 단백질 생성량을 증가시켰고, 소양인의 혈액에서 분리된 대식세포에 가지와 무 추출물을 각각 처리한 군은 당근 추출물 처리군보다 NO와 TNF-α 단백질 생성량이 높았다.
- 태음인, 소양인 그리고 소음인 혈액에서 분리한 면역세포(림프구, 대식세포)에 표고버섯(Lentinus edodes), 양송이버섯(Agaricus bisporus) 및 목이버섯(Auricularia auricula- judae) 추출물 처리에 의한 면역 활성에 미치는 영향력을 알아본 결과(Fig. 4), 표고버섯과 목이버섯 추출물은 태음인과 소음인의 혈액에서 분리한 림프구의 세포 증식율을 소양인의 그것보다 높게 증가시켰으나, 소양인의 림프구의 세포 증식율은 양송이버섯 추출물 처리에 의해 가장 높게 증가하였다(Fig. 4A). NO 생성량 및 TNF-α 단백질 생성량 증가를 알아보기 위해서는 이들 추출물을 태음인, 소양인 그리고 소음인의 혈액에서 분리된 대식세포에 처리한 결과 세포 생존율과 유사한 경향을 나타내었다(Fig.
- 태음인, 소양인 그리고 소음인 혈액에서 분리한 면역세포에 콩(노란콩; soybean), 팥(adzuki bean) 및 차조(millet) 추출물 처리에 의한 면역 활성에 미치는 영향력을 알아 본 결과, 태음인과 소음인의 혈액에서 분리한 림프구에서 팥과 차조 추출물 처리가 콩 추출물보다 세포 생존율이 더 증가하였으나 콩과 팥 추출물은 통계학적 유의적 차이는 나타나지 않았다(Fig. 2A). 콩 추출물 처리는 소양인의 세포 생존율이 태음인과 소음인보다 높았다(Fig.
- 태음인과 소음인 혈액에서 분리한 림프구에 쌀, 보리 그리고 율무 추출물을 처리했을 때 보리와 율무 추출물보다 쌀 추출물 처리에 의해 더 효과적으로 림프구 증식율이 증가하였으나, 소양인에서 분리한 림프구에서는 보리 추출물이 쌀과 율무 추출물 처리군보다 더 높은 림프구 증식율을 나타내었다(Fig. 1A). NO 생성과 TNF-α의 단백질 생성량도 세포 생존율과 유사한 경향을 나타났으나 소음인에서 분리한 대식세포의 경우 쌀과 율무 추출물 처리군은 NO 생성량이 비슷한 수준으로 증가하였고 보리 추출물보다 높았다.
- 3은 태음인, 소양인 그리고 소음인 혈액에서 분리한 면역세포(림프구, 대식세포)에 가지(eggplants), 무(radish) 및 당근(carrot) 추출물 처리에 의한 면역 활성에 미치는 영향력을 나타낸 것이다. 태음인과 소음인의 혈액에서 분리된 림프구에 무와 당근 추출물을 처리하면 가지 추출물 처리보다 더 높은 세포 증식율을 나타내었고, 소양인은 가지와 무 추출물이 당근 추출물보다 림프구 증식율을 더 증가시켰다(Fig. 3A). 가지, 무 그리고 당근 추출물을 태음인, 소양인 그리고 소음인의 혈액에서 분리된 대식세포에 처리하여 NO 생성량과 TNF-α 단백질 생성량을 알아본 결과 세포 증식율과 유사한 경향을 나타내었다(Fig.
- 태음인과 소음인의 혈액에서 분리한 면역세포는 팥 추출물과 차조 추출물 그리고 소양인의 혈액에서 분리한 면역세포는 콩 추출물이 다른 추출물보다 세포 생존율, NO 생성량 그리고 TNF-α 단백질 생성량이 높았다.
- 태음인은 세 가지 곡류 추출물들과 비교하여 쌀 추출물 처리에 의해 면역 활성이 가장 높게 증가하였고, 소음인은 세포 생존율 결과를 제외하고 율무 추출물에 의해 면역 활성이 가장 높게 증가하였으며, 소양인은 보리 추출물 처리에 의해 면역 활성이 가장 높게 증가하였다. 따라서 쌀은 태음인의 면역 활성에 좋은 곡류이고 율무는 소음인 그리고 보리는 소양인에게 좋은 곡류인 것으로 생각된다.
- 이러한 결과를 근거하여 생식제품 개발을 위하여 생식 원료의 종류와 배합비율을 달리하여 배합비 1∼6(Mix 1∼6)을 개발하였다. 태음인의 면역 활성은 배합비 1, 배합비 2, 배합비 3, 배합비 4, 배합비 5 또는 배합비 6 추출물을 처리한 면역 세포 중에서 배합비 2(Mix 2; 쌀 60%, 팥 20%, 무 10%, 표고 10%) 추출물을 처리한 면역세포에서 가장 높았다. 소양인의 면역 활성은 6개의 배합비(Mix 1∼6) 추출물 중에서 배합비 4(Mix 4: 보리 60%, 콩 20%, 가지 10%, 양송이 10%) 처리에 의해 최고로 높았다.
- 태음인의 혈액에서 분리된 림프구와 대식세포에 배합비 1∼6의 추출물을 각각 처리한 결과 배합비 1과 2의 추출물이 다른 추출물보다 더 높은 림프구 증식율을 나타내었다.
- 표고버섯과 목이버섯 추출물 처리군은 세포 증식율, NO 생성량 및 TNF-α 단백질 생성량이 소양인에서 분리된 면역세포에서보다 태음인과 소음인에서 분리한 면역세포에서더 높이 증가되었고, 소양인의 면역세포에 양송이버섯 추출물을 처리했을 때 다른 체질에서 분리된 면역세포에 처리한 것보다 더 높았다(Fig. 4).
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