까마중내 (Solanum nigrum L.) 항산화방어계의 항산화력 및 물질의 동정 Evaluation of the Antioxidant Potential and ldentification of Active Principles of Solanum nigrum L. on Antioxidant Defense Systems원문보기
까마중의 부위별 DPPH free radical 소거활성은 뿌리에서 가장 높았고, 줄기, 전부위, 열매 잎 그리고 꽃 순으로 높았다. 추출방법간의 DPPH free radical 소거활성은 80%methanol에 침지하여 추출한것보다는 $80^{\circ}C$에서 80% meth-anol에 흰류추출한것이 높았다. Sephades LH-20 column chromatography에 의하여 분획된 L6의 DPPH free radical 소거활성은 ethy acetate 분획 추출물보다 6.7배 높았다. 분획물내의주요물질은 2, 6-methano-3-benzazocin-11-ol, 2[1h]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5 methylbenzaldehyde로 phenolic 화 물이었다. 줄기와 뿌리의 POD및 SOD 활성은 타 부위에 비하여 높은 활성을 나타내었고, 생육기간에는 파종 후 60일후에서 활성이 가장 높았다. PODdmlehddnl gth 패턴은 뿌리에서 10개의 band로 가장 많았고 그중 8개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있어Tdmaul, SOD의 동위효소 패턴은 잎에 5개의 band로 가장 많았고 그중 2개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었다.이가 있었다.
까마중의 부위별 DPPH free radical 소거활성은 뿌리에서 가장 높았고, 줄기, 전부위, 열매 잎 그리고 꽃 순으로 높았다. 추출방법간의 DPPH free radical 소거활성은 80%methanol에 침지하여 추출한것보다는 $80^{\circ}C$에서 80% meth-anol에 흰류추출한것이 높았다. Sephades LH-20 column chromatography에 의하여 분획된 L6의 DPPH free radical 소거활성은 ethy acetate 분획 추출물보다 6.7배 높았다. 분획물내의주요물질은 2, 6-methano-3-benzazocin-11-ol, 2[1h]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5 methylbenzaldehyde로 phenolic 화 물이었다. 줄기와 뿌리의 POD및 SOD 활성은 타 부위에 비하여 높은 활성을 나타내었고, 생육기간에는 파종 후 60일후에서 활성이 가장 높았다. PODdmlehddnl gth 패턴은 뿌리에서 10개의 band로 가장 많았고 그중 8개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있어Tdmaul, SOD의 동위효소 패턴은 잎에 5개의 band로 가장 많았고 그중 2개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었다.이가 있었다.
Enzymes and non-enzymatic antioxidants are involved in defense of oxgen free radical intermediates in all aerobic cells. The non -enzymatic antioxidants and antioxidant enzyme from the extracts of Solanum nigrum L. known to be anticancer medicinal plant were examined in other to utilize the discover...
Enzymes and non-enzymatic antioxidants are involved in defense of oxgen free radical intermediates in all aerobic cells. The non -enzymatic antioxidants and antioxidant enzyme from the extracts of Solanum nigrum L. known to be anticancer medicinal plant were examined in other to utilize the discovery in natural products as cancer chem-opereventive agents. The DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) free radical scavening activity on plant position of Solanum nigrum L. was the highest in root, with stem, whole plant, seed, leaf and flower, at higher activities respectively. In extraction methods, the DPPH free radical scavenging activity by circulating extraction with 80 % MeOH. The DPPH activity of L6 fraction by LH-20 column chromatography showed about 6.7 times higher than that of ethyl acetate-fraction. These were identified as phenolic compounds such as 2-6-methano-3-benzazocin-11-ol, 2[1H]-phyidinethione and 2-hydroxy -5-methyl-benzaldehyde. Peroxidase(POD) and superoxide dismutase(SOD) activities of stem and root were higher than that of other plant positions and those of plant positions according to growing stage were the highest in 60 days after seeding. The numbers of isozyme pattern of POD and SOD showed 10 hands and 5 bands, respectively, especially, 8 bands of POD and 3 bands of SOC showed a difference according to plant positions.
Enzymes and non-enzymatic antioxidants are involved in defense of oxgen free radical intermediates in all aerobic cells. The non -enzymatic antioxidants and antioxidant enzyme from the extracts of Solanum nigrum L. known to be anticancer medicinal plant were examined in other to utilize the discovery in natural products as cancer chem-opereventive agents. The DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) free radical scavening activity on plant position of Solanum nigrum L. was the highest in root, with stem, whole plant, seed, leaf and flower, at higher activities respectively. In extraction methods, the DPPH free radical scavenging activity by circulating extraction with 80 % MeOH. The DPPH activity of L6 fraction by LH-20 column chromatography showed about 6.7 times higher than that of ethyl acetate-fraction. These were identified as phenolic compounds such as 2-6-methano-3-benzazocin-11-ol, 2[1H]-phyidinethione and 2-hydroxy -5-methyl-benzaldehyde. Peroxidase(POD) and superoxide dismutase(SOD) activities of stem and root were higher than that of other plant positions and those of plant positions according to growing stage were the highest in 60 days after seeding. The numbers of isozyme pattern of POD and SOD showed 10 hands and 5 bands, respectively, especially, 8 bands of POD and 3 bands of SOC showed a difference according to plant positions.
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문제 정의
본 연구에서는 항암 약초로 알려진 까마중을 부위별로 비효소 및 효소적 항산화계의 활성을 조사하고, 그물질을 동정하여 새로운 천연 항산화제로의 사용 가능성을 검토하기 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
Cuvette 내에 농도별 시료와 300 #M DPPHdiphenyb2-picryl-hydrazyl) 용액을(홉 광도가 L。이 되도록 용액을 희석) 넣고 37'C에서 30분간 반응 후 515 nm에서 대조구와의 홉광도 차이를 측정하였다. 시료처리에 의한 헉제율은 DMSO (dimethylsulfoxide)?} 처리된 대조구와 비교하여 계산하였고, IC50 (Inhibitor Concentration 50%)값은 50% DPPH free radical을 제어시키는 시료 농도를 계산하였다.
LH-20 column chromatography로 항산화물질을 정제한 후 항산화 활성이 가장 높았던 (Fig. 3) L6추출물을 분석한 결과(Table 3), 3가지의 단일 물질을 동정하였다. 분획물의 항산화 활성이 column 분획전인 Ethyl acetate 분획에 비하여 6.
8) 5 ml과 함께 마쇄한 후, 4'C에서 14, 000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻었다. POD 활성은 pyrogallol (Sig ma, Cot# P-0381)을 기질로 사용하고 0.1 mi 조효소액에 2.9 ml assay buffer를 첨가하여 420 nm에서 20초간 상온에서 홉 광도 변화를 조사하였다.
POD의 동위효소 패턴은 12% acrylamide gel을 사용하여 15 mV에서 15분, 25 mV에서 45분간 단백질을 전기영동하였고, 발색 반응은 benzidine solution과 3% hydrogen peroxide를 1 : 1로 혼합해서 사용하였다. SOD의 동위효소 패턴은 13% acrylamide gel에서 215 V로 40분간 전기영동하였고, gel의 염색은 negative 염색 용액으로 30분간 암 상태에서 발색반응을 보았다. 단백질 정량은 Bradford[5] 방법에 준하여 실시하였다.
Cuvette 내에 농도별 시료와 300 #M DPPHdiphenyb2-picryl-hydrazyl) 용액을(홉 광도가 L。이 되도록 용액을 희석) 넣고 37'C에서 30분간 반응 후 515 nm에서 대조구와의 홉광도 차이를 측정하였다. 시료처리에 의한 헉제율은 DMSO (dimethylsulfoxide)?} 처리된 대조구와 비교하여 계산하였고, IC50 (Inhibitor Concentration 50%)값은 50% DPPH free radical을 제어시키는 시료 농도를 계산하였다.
까마중의 항산화 활성물질의 분리는 80% methanol로 환류추출한 ethyl acetate 분획을 silicagel (110 g) column chromatography (chloroform —> chloroform : methanol = 7 : 1 t ethyl acetate ->methanol)를 실시하여 50 ml씩 분취하였다, 각 분 취액을 TLC (thin layer chromatographyz chloroform : methanol = 7 : 1)로 확인하여 유사한 분 획끼리 합하고 농죽하여 6개의 분획물을 얼었고, 이분획들의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하였다言.이중 활성이 가장 높았던 분획을 Sephadex LH-20 coluim^ chroma- tography에 의하여 7개의 소분획으로 분리한 후 DPFH free radical 소거 활성을 측정하였다.
비효소적 항산화 방어계의 추출은 음건세절한 시료 1kg을 80% methanol에 3일간 칩지 하여 여과한 추줄물과, 80% methan이에 6시간 환류추출한 후 여과한methanol추촐불 을 각각 농축하여 Fig. 1과 같은 방법으로 분획하였다.
까마중의 항산화 활성물질의 분리는 80% methanol로 환류추출한 ethyl acetate 분획을 silicagel (110 g) column chromatography (chloroform —> chloroform : methanol = 7 : 1 t ethyl acetate ->methanol)를 실시하여 50 ml씩 분취하였다, 각 분 취액을 TLC (thin layer chromatographyz chloroform : methanol = 7 : 1)로 확인하여 유사한 분 획끼리 합하고 농죽하여 6개의 분획물을 얼었고, 이분획들의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하였다言.이중 활성이 가장 높았던 분획을 Sephadex LH-20 coluim^ chroma- tography에 의하여 7개의 소분획으로 분리한 후 DPFH free radical 소거 활성을 측정하였다.
8) 5 ml과 함께 마쇄한 후 4'c게서 14, 000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻어진 상 등액을 사용하였다. 활성 측정은 Xanthine / xanthine oxidase system을 superoxide radicals (O2 . )의 공급원으로 이용하여 superoxide radical에 의한 환원 속도를 550 nm에서 150초간 홉광도 변화를 측정하였다. SOD의 1 unit은 25 °C 에서 반응을 시작하여 15Q 초간 550 nm에서 홉 광도 변화를 조사하여, xanthine oxidase 활성이 50% 억제되는 것으로 정의하였다.
대상 데이터
까마중(SoXmmz nigrum L.)의 비효소적 항산화 방어계를 조사하기 위하여 경북 안동시 송천동에서 자생한 것을 2000년 8월에 채취하여 각 부위별로 세척 후 음건세절하 여 사용하였고, 항산화 효소계는 부위별 생체시료를 -28°C에 냉동 보관하여 사용하였다.
항산화물질의 동정은 GC/MS (Hewlett Packard 6890/ 5973)를 사용하였고/ column은 Ultra-2 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane)z oven 조건은 60'C에서 시작하여 분당 2KC씩 23CTC까지 승온하 있다. 운반기체는 He 가스를 사용하였으며, 유속은 0.8 ml/mi다로 분석하였다. Fig.
이론/모형
POD, SOD의 동위효소 패턴은 Beauchamp와 Fridovich [3]의 방법에 준하여 수행하였다.POD의 동위효소 패턴은 12% acrylamide gel을 사용하여 15 mV에서 15분, 25 mV에서 45분간 단백질을 전기영동하였고, 발색 반응은 benzidine solution과 3% hydrogen peroxide를 1 : 1로 혼합해서 사용하였다.
SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome C를 이용한 McCord와 Fridovich[16]의 방법에 따라 측정하였다. 조효소액은 1 g을 0.
SOD의 동위효소 패턴은 13% acrylamide gel에서 215 V로 40분간 전기영동하였고, gel의 염색은 negative 염색 용액으로 30분간 암 상태에서 발색반응을 보았다. 단백질 정량은 Bradford[5] 방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
3배 각각 높았다. SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다. 본 실험에서 SOD 활성이 높았던 식물체의 뿌리와 줄기에서 비효소적 항산화 방어계인 I기가3H free radical 소거활성도 높았다.
Sephadex LH-20 column chromatography에 의하여 분획된 L6의 DPPH free radical 소거 활성은 ethyl acetate 분획 추출물보다 6.7배 높았다. 분획물 내의 주요 물질은 2, 6-methano- 3-benzazocin -ll-ol, 2[lh]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5- methylbenzaldehyde로 phenolic 화합물이었다.
까마중의 각 부위와 전 식물체의 ethyl acetate 추출물 및 환류추출물에 따른 DPPH free radical 소거 활성을 조사한 결과(Table 1), DPPH free radical 소거 활성은 뿌리, 줄기, 전 부위. 열매 그리고 잎순으로 높게 나타났으며, 꽃에서는 활성이 없었다.
까마중의 부위별 DPPH free radical 소거 활성은 뿌리에서 가장 높았고, 줄기, 전 부위, 열매, 잎 그리고 꽃순으로 높았다. 추출방법 간의 DPPH free radical 소거 활성은 80% methanol에 침지하여 추출한 것보다는 80。(:에서 80% meth- anol에 환류추출한 것이 높았다.
까마중의 부위별 POD 및 SOD 동위효소 패턴을 조사한 결과(Fig. 8), POD 동위효소 패턴은 뿌리, 줄기, 잎.꽃, 열매에서 각각 10개, 6개, 5개 4개ZI리고 2개의 동위효소 패턴이 나타났다-이들 band를 전기 이동도에 따라서 POD 1 에서 POD 10으로 명명하였다.
까마중의 부위별 항산화 효소 활성을 조사한 결과(Fig. 4,5) POD 활성은 줄기와 뿌리에서 가장 높았으며 꽃, 잎 그리고 열매 순으로 높게 나타났다. 줄기는 뿌리와 비슷한 활성을 나타내었고, 꽃과 잎 그리고 열매에 비하여 31배, 3.
까마중의 생육 시기별 POD 및 9OD 활성을 조사한 결과(Fig. 6, 7), 줄기와 뿌리에서의 POD 및 9OD 활성은 파종 후 60일에서 공히 가장 높게 나타났고 엽중의 POD 및 SOD 활성은 생육시기별로 일정한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 식물체 영양생장기 동안에는 증가하였으나, 개화 후기(파종 후 80일)부터 감소하는 것으로 사료된다.
6, 7), 줄기와 뿌리에서의 POD 및 9OD 활성은 파종 후 60일에서 공히 가장 높게 나타났고 엽중의 POD 및 SOD 활성은 생육시기별로 일정한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 식물체 영양생장기 동안에는 증가하였으나, 개화 후기(파종 후 80일)부터 감소하는 것으로 사료된다.
SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다. 본 실험에서 SOD 활성이 높았던 식물체의 뿌리와 줄기에서 비효소적 항산화 방어계인 I기가3H free radical 소거활성도 높았다. ascorbic acid 및 catechin, curcuminz lecithin, glutathion과 같은 항산화물질들이 SOD 유사활 성을 나타내며 flavonoid 중에서 quercetin, myricetin, rutin 등도 superoxide anion radical을 저해하는 것으로 알려져 있다 [13, 14, 20, 25].
24], 이러한 방법은 많은 식물추 출물들의 항산화 활성을 탐색하는 데 이용되어진다.본 실험의 IC50 (ug/ml) 값은 Lee[ 15]가본 실험과 동일한 방법으로 700여종의 식물 추출물 중 102종이 200 ug/ml 이하의 활성을 나타내었다는 보고 를 미루어 보면, 까마중의 전 식물체 및 부위별 추출물의 IGo값은 62〜145 ug/ml의 범위로 DPPH free radical 소거 활성이 높은 것으로 평가되었다.
전 식물체를 80% methanol로 3일간 침지한 추출과 80% methanal로 6시간 환류추줄한 것을 Fig. 1과 같이 분획하여, 주요 항산화 물질들을 비교 조사해 본 결과(Table 2), 조사된 물질들은 대부분 phenolic 화합물이었다. 침지한 추출물에 비하여 환류추출에 의한 추출물은 GC/MS에 의하여 조사된 화합물의 함량이 높았으며, 특히 2[1HJ-pyridinethione, 2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde/ 2- phenoxyanilin 및 4-[3-hydroxy- 1-propenyl] -2- metho phenol 등의 phenolic 화합물이 높았다.
전 식물체의 환류추출한 ethyl acetate 추출물 분획을 정제하기 위하여 silicagel column chmmatography룰 사용한 결과, DPPH free radical 소거 활성 이 38.7 ug/ml인 높은 항산화분획을 얻었다. 이 분획을 Sephadex LH-20 column 를 사용하여 정제한 결과(Fi& 3), 7개의 소분획을 얼었다.
4,5) POD 활성은 줄기와 뿌리에서 가장 높았으며 꽃, 잎 그리고 열매 순으로 높게 나타났다. 줄기는 뿌리와 비슷한 활성을 나타내었고, 꽃과 잎 그리고 열매에 비하여 31배, 3.7배, 그리고 7.3배 각각 높았다. SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다.
분획물 내의 주요 물질은 2, 6-methano- 3-benzazocin -ll-ol, 2[lh]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5- methylbenzaldehyde로 phenolic 화합물이었다. 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 타 부위에 비하여 높은 활성을 나타내었고, 생육시 기간에는 파종 후 60일에서 활성이 가장 높았다 POD의 동위효소 패턴은 뿌리에서 10개의 band로 가장 많았고 그 중 8개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었으며, 9OD의 동위효소 패턴은 잎에서 5개의 band로 가장 많았고 그 중 2개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었다
1과 같이 분획하여, 주요 항산화 물질들을 비교 조사해 본 결과(Table 2), 조사된 물질들은 대부분 phenolic 화합물이었다. 침지한 추출물에 비하여 환류추출에 의한 추출물은 GC/MS에 의하여 조사된 화합물의 함량이 높았으며, 특히 2[1HJ-pyridinethione, 2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde/ 2- phenoxyanilin 및 4-[3-hydroxy- 1-propenyl] -2- metho phenol 등의 phenolic 화합물이 높았다. 이와 같은 경향은 침지 추출물보다 환류 추출 방법에서 DPPH free radical 소거 활성이 높았던(Table.
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