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문제 정의
- 본 연구에서는 항암 약초로 알려진 까마중을 부위별로 비효소 및 효소적 항산화계의 활성을 조사하고, 그물질을 동정하여 새로운 천연 항산화제로의 사용 가능성을 검토하기 위한 기초자료를 얻고자 하였다.
제안 방법
- Cuvette 내에 농도별 시료와 300 #M DPPHdiphenyb2-picryl-hydrazyl) 용액을(홉 광도가 L。이 되도록 용액을 희석) 넣고 37'C에서 30분간 반응 후 515 nm에서 대조구와의 홉광도 차이를 측정하였다. 시료처리에 의한 헉제율은 DMSO (dimethylsulfoxide)?} 처리된 대조구와 비교하여 계산하였고, IC50 (Inhibitor Concentration 50%)값은 50% DPPH free radical을 제어시키는 시료 농도를 계산하였다.
- LH-20 column chromatography로 항산화물질을 정제한 후 항산화 활성이 가장 높았던 (Fig. 3) L6추출물을 분석한 결과(Table 3), 3가지의 단일 물질을 동정하였다. 분획물의 항산화 활성이 column 분획전인 Ethyl acetate 분획에 비하여 6.
- 8) 5 ml과 함께 마쇄한 후, 4'C에서 14, 000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻었다. POD 활성은 pyrogallol (Sig ma, Cot# P-0381)을 기질로 사용하고 0.1 mi 조효소액에 2.9 ml assay buffer를 첨가하여 420 nm에서 20초간 상온에서 홉 광도 변화를 조사하였다.
- POD의 동위효소 패턴은 12% acrylamide gel을 사용하여 15 mV에서 15분, 25 mV에서 45분간 단백질을 전기영동하였고, 발색 반응은 benzidine solution과 3% hydrogen peroxide를 1 : 1로 혼합해서 사용하였다. SOD의 동위효소 패턴은 13% acrylamide gel에서 215 V로 40분간 전기영동하였고, gel의 염색은 negative 염색 용액으로 30분간 암 상태에서 발색반응을 보았다. 단백질 정량은 Bradford[5] 방법에 준하여 실시하였다.
- Cuvette 내에 농도별 시료와 300 #M DPPHdiphenyb2-picryl-hydrazyl) 용액을(홉 광도가 L。이 되도록 용액을 희석) 넣고 37'C에서 30분간 반응 후 515 nm에서 대조구와의 홉광도 차이를 측정하였다. 시료처리에 의한 헉제율은 DMSO (dimethylsulfoxide)?} 처리된 대조구와 비교하여 계산하였고, IC50 (Inhibitor Concentration 50%)값은 50% DPPH free radical을 제어시키는 시료 농도를 계산하였다.
- 까마중의 항산화 활성물질의 분리는 80% methanol로 환류추출한 ethyl acetate 분획을 silicagel (110 g) column chromatography (chloroform —> chloroform : methanol = 7 : 1 t ethyl acetate ->methanol)를 실시하여 50 ml씩 분취하였다, 각 분 취액을 TLC (thin layer chromatographyz chloroform : methanol = 7 : 1)로 확인하여 유사한 분 획끼리 합하고 농죽하여 6개의 분획물을 얼었고, 이분획들의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하였다言.이중 활성이 가장 높았던 분획을 Sephadex LH-20 coluim^ chroma- tography에 의하여 7개의 소분획으로 분리한 후 DPFH free radical 소거 활성을 측정하였다.
- 비효소적 항산화 방어계의 추출은 음건세절한 시료 1kg을 80% methanol에 3일간 칩지 하여 여과한 추줄물과, 80% methan이에 6시간 환류추출한 후 여과한methanol추촐불 을 각각 농축하여 Fig. 1과 같은 방법으로 분획하였다.
- 까마중의 항산화 활성물질의 분리는 80% methanol로 환류추출한 ethyl acetate 분획을 silicagel (110 g) column chromatography (chloroform —> chloroform : methanol = 7 : 1 t ethyl acetate ->methanol)를 실시하여 50 ml씩 분취하였다, 각 분 취액을 TLC (thin layer chromatographyz chloroform : methanol = 7 : 1)로 확인하여 유사한 분 획끼리 합하고 농죽하여 6개의 분획물을 얼었고, 이분획들의 DPPH free radical 소거 활성을 측정하였다言.이중 활성이 가장 높았던 분획을 Sephadex LH-20 coluim^ chroma- tography에 의하여 7개의 소분획으로 분리한 후 DPFH free radical 소거 활성을 측정하였다.
- 8) 5 ml과 함께 마쇄한 후 4'c게서 14, 000 rpm으로 20분간 원심분리하여 얻어진 상 등액을 사용하였다. 활성 측정은 Xanthine / xanthine oxidase system을 superoxide radicals (O2 . )의 공급원으로 이용하여 superoxide radical에 의한 환원 속도를 550 nm에서 150초간 홉광도 변화를 측정하였다. SOD의 1 unit은 25 °C 에서 반응을 시작하여 15Q 초간 550 nm에서 홉 광도 변화를 조사하여, xanthine oxidase 활성이 50% 억제되는 것으로 정의하였다.
대상 데이터
- 까마중(SoXmmz nigrum L.)의 비효소적 항산화 방어계를 조사하기 위하여 경북 안동시 송천동에서 자생한 것을 2000년 8월에 채취하여 각 부위별로 세척 후 음건세절하 여 사용하였고, 항산화 효소계는 부위별 생체시료를 -28°C에 냉동 보관하여 사용하였다.
- 항산화물질의 동정은 GC/MS (Hewlett Packard 6890/ 5973)를 사용하였고/ column은 Ultra-2 (Crosslinked 5% PH ME Siloxane)z oven 조건은 60'C에서 시작하여 분당 2KC씩 23CTC까지 승온하 있다. 운반기체는 He 가스를 사용하였으며, 유속은 0.8 ml/mi다로 분석하였다. Fig.
이론/모형
- POD, SOD의 동위효소 패턴은 Beauchamp와 Fridovich [3]의 방법에 준하여 수행하였다.POD의 동위효소 패턴은 12% acrylamide gel을 사용하여 15 mV에서 15분, 25 mV에서 45분간 단백질을 전기영동하였고, 발색 반응은 benzidine solution과 3% hydrogen peroxide를 1 : 1로 혼합해서 사용하였다.
- SOD 활성은 xanthine oxidase와 cytochrome C를 이용한 McCord와 Fridovich[16]의 방법에 따라 측정하였다. 조효소액은 1 g을 0.
- SOD의 동위효소 패턴은 13% acrylamide gel에서 215 V로 40분간 전기영동하였고, gel의 염색은 negative 염색 용액으로 30분간 암 상태에서 발색반응을 보았다. 단백질 정량은 Bradford[5] 방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 3배 각각 높았다. SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다. 본 실험에서 SOD 활성이 높았던 식물체의 뿌리와 줄기에서 비효소적 항산화 방어계인 I기가3H free radical 소거활성도 높았다.
- Sephadex LH-20 column chromatography에 의하여 분획된 L6의 DPPH free radical 소거 활성은 ethyl acetate 분획 추출물보다 6.7배 높았다. 분획물 내의 주요 물질은 2, 6-methano- 3-benzazocin -ll-ol, 2[lh]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5- methylbenzaldehyde로 phenolic 화합물이었다.
- 까마중의 각 부위와 전 식물체의 ethyl acetate 추출물 및 환류추출물에 따른 DPPH free radical 소거 활성을 조사한 결과(Table 1), DPPH free radical 소거 활성은 뿌리, 줄기, 전 부위. 열매 그리고 잎순으로 높게 나타났으며, 꽃에서는 활성이 없었다.
- 까마중의 부위별 DPPH free radical 소거 활성은 뿌리에서 가장 높았고, 줄기, 전 부위, 열매, 잎 그리고 꽃순으로 높았다. 추출방법 간의 DPPH free radical 소거 활성은 80% methanol에 침지하여 추출한 것보다는 80。(:에서 80% meth- anol에 환류추출한 것이 높았다.
- 까마중의 부위별 POD 및 SOD 동위효소 패턴을 조사한 결과(Fig. 8), POD 동위효소 패턴은 뿌리, 줄기, 잎.꽃, 열매에서 각각 10개, 6개, 5개 4개ZI리고 2개의 동위효소 패턴이 나타났다-이들 band를 전기 이동도에 따라서 POD 1 에서 POD 10으로 명명하였다.
- 까마중의 부위별 항산화 효소 활성을 조사한 결과(Fig. 4,5) POD 활성은 줄기와 뿌리에서 가장 높았으며 꽃, 잎 그리고 열매 순으로 높게 나타났다. 줄기는 뿌리와 비슷한 활성을 나타내었고, 꽃과 잎 그리고 열매에 비하여 31배, 3.
- 까마중의 생육 시기별 POD 및 9OD 활성을 조사한 결과(Fig. 6, 7), 줄기와 뿌리에서의 POD 및 9OD 활성은 파종 후 60일에서 공히 가장 높게 나타났고 엽중의 POD 및 SOD 활성은 생육시기별로 일정한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 식물체 영양생장기 동안에는 증가하였으나, 개화 후기(파종 후 80일)부터 감소하는 것으로 사료된다.
- 6, 7), 줄기와 뿌리에서의 POD 및 9OD 활성은 파종 후 60일에서 공히 가장 높게 나타났고 엽중의 POD 및 SOD 활성은 생육시기별로 일정한 경향을 나타내지 않았다. 따라서 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 식물체 영양생장기 동안에는 증가하였으나, 개화 후기(파종 후 80일)부터 감소하는 것으로 사료된다.
- SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다. 본 실험에서 SOD 활성이 높았던 식물체의 뿌리와 줄기에서 비효소적 항산화 방어계인 I기가3H free radical 소거활성도 높았다. ascorbic acid 및 catechin, curcuminz lecithin, glutathion과 같은 항산화물질들이 SOD 유사활 성을 나타내며 flavonoid 중에서 quercetin, myricetin, rutin 등도 superoxide anion radical을 저해하는 것으로 알려져 있다 [13, 14, 20, 25].
- 24], 이러한 방법은 많은 식물추 출물들의 항산화 활성을 탐색하는 데 이용되어진다.본 실험의 IC50 (ug/ml) 값은 Lee[ 15]가본 실험과 동일한 방법으로 700여종의 식물 추출물 중 102종이 200 ug/ml 이하의 활성을 나타내었다는 보고 를 미루어 보면, 까마중의 전 식물체 및 부위별 추출물의 IGo값은 62〜145 ug/ml의 범위로 DPPH free radical 소거 활성이 높은 것으로 평가되었다.
- 전 식물체를 80% methanol로 3일간 침지한 추출과 80% methanal로 6시간 환류추줄한 것을 Fig. 1과 같이 분획하여, 주요 항산화 물질들을 비교 조사해 본 결과(Table 2), 조사된 물질들은 대부분 phenolic 화합물이었다. 침지한 추출물에 비하여 환류추출에 의한 추출물은 GC/MS에 의하여 조사된 화합물의 함량이 높았으며, 특히 2[1HJ-pyridinethione, 2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde/ 2- phenoxyanilin 및 4-[3-hydroxy- 1-propenyl] -2- metho phenol 등의 phenolic 화합물이 높았다.
- 전 식물체의 환류추출한 ethyl acetate 추출물 분획을 정제하기 위하여 silicagel column chmmatography룰 사용한 결과, DPPH free radical 소거 활성 이 38.7 ug/ml인 높은 항산화분획을 얻었다. 이 분획을 Sephadex LH-20 column 를 사용하여 정제한 결과(Fi& 3), 7개의 소분획을 얼었다.
- 4,5) POD 활성은 줄기와 뿌리에서 가장 높았으며 꽃, 잎 그리고 열매 순으로 높게 나타났다. 줄기는 뿌리와 비슷한 활성을 나타내었고, 꽃과 잎 그리고 열매에 비하여 31배, 3.7배, 그리고 7.3배 각각 높았다. SOD 활성은 뿌리와 줄기에서 높은 활성을 보였으며, 꽃, 열매 ' 그리고 잎순으로 높았다.
- 분획물 내의 주요 물질은 2, 6-methano- 3-benzazocin -ll-ol, 2[lh]-pyridinethione 및 2-hydroxy-5- methylbenzaldehyde로 phenolic 화합물이었다. 줄기와 뿌리의 POD 및 SOD 활성은 타 부위에 비하여 높은 활성을 나타내었고, 생육시 기간에는 파종 후 60일에서 활성이 가장 높았다 POD의 동위효소 패턴은 뿌리에서 10개의 band로 가장 많았고 그 중 8개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었으며, 9OD의 동위효소 패턴은 잎에서 5개의 band로 가장 많았고 그 중 2개의 band가 식물체의 부위별로 차이가 있었다
- 1과 같이 분획하여, 주요 항산화 물질들을 비교 조사해 본 결과(Table 2), 조사된 물질들은 대부분 phenolic 화합물이었다. 침지한 추출물에 비하여 환류추출에 의한 추출물은 GC/MS에 의하여 조사된 화합물의 함량이 높았으며, 특히 2[1HJ-pyridinethione, 2-hydroxy-5-methylbenzaldehyde/ 2- phenoxyanilin 및 4-[3-hydroxy- 1-propenyl] -2- metho phenol 등의 phenolic 화합물이 높았다. 이와 같은 경향은 침지 추출물보다 환류 추출 방법에서 DPPH free radical 소거 활성이 높았던(Table.
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