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문제 정의
- 본 연구에서는 P. 의 미토콘드리아 선형 플라스미드 중 7.2 kb 플라스미드의 염기서열을 분석하고 ORF를 조사하여 DNA 중합 효소와 RNA 중합 효소의 보존서열이 존재하는지 살펴보고사 하였다.
제안 방법
- 염기서열 결정을 용이하게 하기 위하여 클로닝된 DNA의 연속 결손을 Erase-a-Base System을 이용하여 만들었다. 5' overhang을 생성하는 EcoRI 혹은 Xho] 등으로 절단하고, 3' overhang을 생성하는 Sphl과 BstXl 등으로 절단한 다음, 주어진 방법대로 시행 하였다.
- 7.2 kb 선형 플라스미드의 염기서열을 아미노산 서열로 전환 시켜 ORF를 조사하였다. 그 결과, 3개의 큰 ORF를 확인할 수 있었다.
- 7.2 kb의 ORF를 BLAST search를 하여, 다른 균주들의 미토 콘드리아 플라스미드와 비교 분석하였다. 그 결과, P.
- DNA 순수 분리를 위하여 Promega에서 Wizard Minipreps DNA Purification System고} Wizard Maxipreps DNA Purification System을 구입하여 사용하였으며, DNA 염기서열 분석을 위한 단일방향 결손에는 Erase-a-Base System (Promega)을 이용하였다.
- DNA 염기서열 분석은 주로 Sequenase™ Version 2.0 DNA Sequencing Kit을 이용하고, 이차구조 등으로 인하여 염기서열 분석이 어려운 부분은 CircumVent™ Thermal Cycle Dideoxy DNA Sequencing Kit을 이용하여 주어진 방법대로 수행하였다.
- 7% Agarose gel에서 전기영동 하였다. P. ostreatus가 갖는 크기가 다른 2종류 플라스미드 DNAU0.2 kb와 7.2 kb)중 7.2 kb 절편을 포함하는 Agarose gel을 절단 분리하여 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)을 이용하여 주어진 실험 방법대로 DNA를 추출하였다.
- P. owreams의 미토콘드리아 선형 플라스미드 DNA의 말단 부 위를 포함하는 DNA 절편을 클로닝하기 위해, 말단에 부착된 아 미노산을 알칼리 처리에 의해 제거하고 Hindill로 처리하여 생성된 절편을 /Hindill와 Smal으로 자른 pGEM 73] 클로닝하였다. 그 결과, 약 4.
- intermedia no. X55361), P. anserina (15) 등의 미토콘드리아 플라스미드의 DNA polymerase 암호부위와 이미노산 서열상 50% 이상의 유사성이 있으며, 알려진 3개의 DNA 중합효소의 motif와 유사성 을 비교 분석하였다(Fig. 2). 또한, 7.
- 5 ml의 DNA 용액에 bis-benzimide를 120 ㎍/μl 되게 넣고, CsCl를 1 g/ml 되게 넣고 녹인 다음, 초고속 원심분리기를 이용하여 300, 000Xg로 15℃에서 15 시간 동안 초원심분리 하였다. 긴 파장 UV lamp로 DNA 분리를 확인한 후 가장 위에 형성된 플라스미드 DNA 띠를 1 ml 주사기를 이용하여 뽑아내었다. TE(10 mM Tris-HCl, pH 8.
- 미토콘드리아 게놈 DNA로부터 플라스미드를 순수 분리하기 위하여 CsCl-bisbenzimide 밀도구배 원심 분리를 수행하였다.3.
- 선별된 형질전환체로부터 플라스미드 DNA는 Wizard minipreps DNA purification system을 사용하여 주어진 방법대로 순수 분리하여 사용하였다.
- 순수 분리한 선형 플라스미드를 각각 분리하기 위하여 0.7% Agarose gel에서 전기영동 하였다. P.
- 3 kb의 DNA를 Erase-a-Base system을 이용하여 연속결손 하였으며, rapid screening 법(1)을 이용하여 결손된 정도를 전기영동하여 겔에서 비교 분석하였다. 순차적으로 결손된 각각의 클론들을 선별하여 염기배열을 조사하였다.
- 연속 결손된 클론들의 염기서열을 서로 연결함으로서 4.7 kb와 2.3 kb의 DNA 염기서열을 전부 결정하였다. 분석 결과, 클로닝 된 4.
- 염기서열 결정을 용이하게 하기 위하여 클로닝된 DNA의 연속 결손을 Erase-a-Base System을 이용하여 만들었다. 5' overhang을 생성하는 EcoRI 혹은 Xho] 등으로 절단하고, 3' overhang을 생성하는 Sphl과 BstXl 등으로 절단한 다음, 주어진 방법대로 시행 하였다.
- 클로닝 된 4, 7 kb와 2.3 kb의 DNA를 Erase-a-Base system을 이용하여 연속결손 하였으며, rapid screening 법(1)을 이용하여 결손된 정도를 전기영동하여 겔에서 비교 분석하였다. 순차적으로 결손된 각각의 클론들을 선별하여 염기배열을 조사하였다.
대상 데이터
- DNA 염기서열 분석에는 Sequenase™ Version 2.0 DNA Sequencing Kit(USB)과 CircumVentTM Thermal Cycle Dideoxy DNA Sequencing Kit(NEB)을 구입 사용하였고, [a-꼬P]dATP (> 800 Ci/mmol)와 [a-%S]dATP (> 1000 Ci/mmol) 등의 방사선 동 위원소는 Amersham 제품을 사용하였다.
- P. ostreatus NFFA 2는 국립임업연구원에서 분양 았으며. 클로닝에 사용한 플라스미드는 Promega 제품인 pGEM 7Z f(+) 플라스미드를 사용하였다.
- 실험에 사용한 HindWl 및 T4 DNA polymerase 등 수식효소들 은 Promega에서 구입하여 사용하였고, pronase E, amylase와 RNase A 는 Sigma에서 구입하여 사용하였다. Sequencing용 primer는 SP6 primer와 T7 primer (Promega)와 주문 합성된 몇 종류의 oligomer (Bio-Synthesis Inc.)를 이용하였다.
- 100% 에탄올등은 일제 특급시약을 이용하였다. Sucrose, boric acid, acrylamide, urea, chloroform, N, N-methylenebisacrylamide, TEMED 등은 Merk 제품을 이용하 였고, agarose, Trizma base, sodium lauryl sarcosine, bromophenol bkie, xylene cyanol, SDS, ammonium persulfate, bis- benzymide와 MOPS 등은 Sigma 품을, HEPES는 Gibco 제품을 이용하였다.
- 그외 에탄올, 메탄올등 기타 일반 시약은 국내 시판 일급 이상의 분석용 시약을 이용하였으며, spin-column과 sephacryl S-400 은 Promega에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 HindWl 및 T4 DNA polymerase 등 수식효소들 은 Promega에서 구입하여 사용하였고, pronase E, amylase와 RNase A 는 Sigma에서 구입하여 사용하였다. Sequencing용 primer는 SP6 primer와 T7 primer (Promega)와 주문 합성된 몇 종류의 oligomer (Bio-Synthesis Inc.
- ostreatus NFFA 2는 국립임업연구원에서 분양 았으며. 클로닝에 사용한 플라스미드는 Promega 제품인 pGEM 7Z f(+) 플라스미드를 사용하였다.
- 형질전화 숙주 세포로 E. coli DH5a와 E. coli JM 109를 사용하였다.
이론/모형
- Yui 등(32)의 방법에 따라 미토콘드리아 선형 플라스미드를 분리하였다. P- ostreatHs는 Malt 한천배지(malt extract 10 g, dextrose 5 g, yeast extract 5 g, agar 1.
- 형질전환체는 rapid screening 법(1)에 따라 플라스미드를 추출하고 0.7% Agarose gel에 전기영동하여 선별하였다.
성능/효과
- 2 kb의 ORF를 BLAST search를 하여, 다른 균주들의 미토 콘드리아 플라스미드와 비교 분석하였다. 그 결과, P. ostreatus 의 7.2 kb 미토콘드리아 플라스미드는 Neumspora. intermedia no.
- owreams의 미토콘드리아 선형 플라스미드 DNA의 말단 부 위를 포함하는 DNA 절편을 클로닝하기 위해, 말단에 부착된 아 미노산을 알칼리 처리에 의해 제거하고 Hindill로 처리하여 생성된 절편을 /Hindill와 Smal으로 자른 pGEM 73] 클로닝하였다. 그 결과, 약 4.7 kb와 2.3 kb의 DNA를 가지는 클론 2개를 최종적으로 분리하였다(Fig. 1).
- 2). 또한, 7.2 kb의 염기서열 중 일부는 N. intermedia, N. crassa 등의 미토콘드리아 플라스미드의 RNA 중합효소 암호부위와도 50% 이상의 아미노산 서열상의 유사성을 보였으며, RNA 중합효소의 11개의 motif와도 유사성이 있는 것으로 나타났다(Fi응. 3).
- 3 kb의 DNA 염기서열을 전부 결정하였다. 분석 결과, 클로닝 된 4.7 kb와 2.3 kb의 크기는 4691 bp 와 2314 bp 임을 확인하였으며, 7.2 kb 미토콘드리아 플라스미드 중에서 양쪽 말단의 200 bp 내외를 제외한 7005 bp의 염기서열을 확인하였다 (GenBank accession no. AF355103).
- lactis 의 pGIKll와 pGIK12(ll), bacteriophage Φ29(29), Adenovirus(i) 등에서 발견된 DNA 중합효소의 염기 서열 motif는 3가지 정도 이며(27), '옥수수의 S2(24), bacteriophage SP6(22), Saccharomyces cerevisiaee] mitochondrial RNA polymerase 유전;자(25), bacteriophage T3(26) 등에서는 RNA 중합효소의 motif 11 개가 보고된 바 있다(27). 지금까지 알려진 DNA 및 RNA 중합 효소의 아미 노산 서열과 P. ostreatus 7.2 kb 선형 플라스미드 DNA 중 클로 닝된 7 kb의 상동성을 비교한 결과, ORF1은 DNA polymerase 보존서열이 있고, ORF2는 RNA polymerase의 보존 서열이 있음을 확인하였다(Fig. 2, 3). 반면, ORF3는 Plasmodium 속의 phosphatase(lO), Mycoplasma의 adhesine(13) 등과 유사성이 있는 것으로 나타났으나, 이 유전자의 동정과 기능을 밝히기 위해서는 더 연구가 필요한 것으로 판단된다.
- 현재 P. ostreatus의 10.2 kb 선형 플라스미드 DNA에 대한 염기서열이 보고되어진 바 있다(21), 본 연구에서는 P. ostreatus에서 10.2 kb와 공존하는 또 다른 선형 플라스미드인 7.2 kb를 클로닝 하고 염기서열을 분석하였으며, 다른 종류의 곰팡이 등에서 보고된 DNA 중합효소나 RNA 중합효소의 보존서열이 P. oWrems의 7, 2 kb에도 존재하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 2, 3). 반면, ORF3는 Plasmodium 속의 phosphatase(lO), Mycoplasma의 adhesine(13) 등과 유사성이 있는 것으로 나타났으나, 이 유전자의 동정과 기능을 밝히기 위해서는 더 연구가 필요한 것으로 판단된다.
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