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문제 정의
- 본 연구에서는 여러 Bacillus 종과 탄저균주들 간의 분자생물 학적인 분석과 탄저균들의 유전형의 차이를 RAPD-PCR을 이용 하여 규명하였다.
제안 방법
- 200μM의 deoxynucleotide triphosphate (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 각 PCR primer, 1 unit의 Taq DNA polymerase (Promega), 그리고 약 !0 ng의 genomic DNA를 사용하였다. PCR 반응조건은 94l, C 에서 5분 동안 denaturation한 후, 94"C에서 15초간 denaturation, 40℃에서 30초간 annealing, 그리고 72℃에서 60초간 extention 과정으로 30 cycle을 수행하였고. 72℃에서 8분간 final extension 을 한 후 15℃에서 보관하였다.
- )로 주줄한 후, pGEM-T easy vector system (Promega)을 사 용하여 클로닝 (pRAPDll)하였다. 즉, DNA 절편과 클로닝 vector (50 ng/μl)를 1대 3의 비율로 혼합하여, T4 DNA ligase 30 Weiss Units을 첨가한 후에 14"C에서 4시간 이상 반응시겼다. 반응물을 대장균 DH5a에 형질전환시켜.
- PCR 산물의 확인은 Tris-acetate (TAE) buffer를 사용하여 1.5% 또는 2.0% agarose gel 전기영동을 한 후 관찰하였다.
- Southern blotting에 사용한 DNA probe는 홍성에서 분리한 탄저균의 528 bp의 단편을 Qiaquick gel extraction kit (Qiagen)를 이용하여 1% agarose gel로부터 추출하고 ECL direct nucleic acid labelling and detection system (Amersham, UK)을 이용하여 표식화 하였다.
- 본 연구에서는 RAPD-PCR을 이용하여 여러 Bacillus 종사이 에서 탄저균의 분자생물학적인 동정과 탄저균 사이에서의 유전형의 차이를 구별할 수 있는 방법들을 적용하여 실험을 실시하였다. 그 결과 BAR5 primer를 이용하여 RAPD-PCR을 행한 후, 나타난 분획 양상에 의하여, 홍성과 경주에서 분리된 탄저균주는 서로 유전형의 차이가 있음을 나타냈다(Fig.
- 4 %[wt/vol| SDS)에 10분 동안 55"C에서 세척흔! 후, 2차 반응액(2X SSC)으로 실온에서 2회 세척하였다. 세척한 NC membrane을 detection solution (ECL kit, Amersham, UK)에 반응시킨 후, 암실에서 NC membrane 위에 X-ray 필름을 올려놓고 1시간 동안 노출시킨 후 현상하였다.
- 시험균과 대조균의 염색체 DNA 분리는 Hunter(14)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 즉, 보존 균주를 10 ml의 BHI 배지 에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 100 ml의 BHI액 체배지에서 대수기 말기까지 키운 후 약 5 g 정도의 균체에 10mg의 lysozyme을 포함한 10 ml의 TE를 넣고 용균이 완전히 될 때까지 3UC에서 처리하였다.
- 시험균주로 6종의 탄저균주, 대조균주로 11종의 Bacillus 균주에 BAR3 primer를 이용한 RAPD-PCR을 행한 후, 분획 양상을 본 결과는 Fig. 1에 나타내었다. 시험균주 중 B.
- 시험균과 대조균의 염색체 DNA 분리는 Hunter(14)의 방법을 약간 변형하여 사용하였다. 즉, 보존 균주를 10 ml의 BHI 배지 에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 100 ml의 BHI액 체배지에서 대수기 말기까지 키운 후 약 5 g 정도의 균체에 10mg의 lysozyme을 포함한 10 ml의 TE를 넣고 용균이 완전히 될 때까지 3UC에서 처리하였다. 용균된 용액에 1 ml의 20% SDS 를 넣은 후 서서히 혼합한 다음 1.
- 혼성화 완충액 (ECL kit. Amersham. UK)에 4TC에서 전혼성 화 시킨 후 표식화된 DNA 탐침을 첨가하여 8시간 동안 혼성화 결합을 실시하였다. 혼성화를 한 NC membrane을 1차 반응액 (0.
- 홍성에서 분리된 탄저균의 RAPD-PCR 결과로 얻어진 약 530 bp 크기의 DNA 절편을 Qiagen DNA elution system II (Qiagen Co.)로 주줄한 후, pGEM-T easy vector system (Promega)을 사 용하여 클로닝 (pRAPDll)하였다. 즉, DNA 절편과 클로닝 vector (50 ng/μl)를 1대 3의 비율로 혼합하여, T4 DNA ligase 30 Weiss Units을 첨가한 후에 14"C에서 4시간 이상 반응시겼다.
- 홍성에서 분리한 탄저균의 DNA 절편을 pGEM-T easy vector 에 클로닝한 후, 염기서열분석을 하였다. 염기서열은 (주) 바이오 넥스에 의뢰하여 분석하였고, 얻어진 염기서열은 BLAST 프로그램 (http://wwwmcbi.
대상 데이터
- 반응물을 대장균 DH5a에 형질전환시켜. X-gal 800 ㎛과 ampicillin 600㎍을 포함하는 LB 평판배지에 배양하여 백색 클 론이 형성된 균주를 선별하였다.
- 72℃에서 8분간 final extension 을 한 후 15℃에서 보관하였다. 실험에 사용된 10 bp oligonucleotide primer (BAR3; 5-GCGATCCCCA-3'. BAR5; 5'- AACGCGCAAC-3)는 GenoTech에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 홍성에서 분리한 탄저균의 DNA 절편을 pGEM-T easy vector 에 클로닝한 후, 염기서열분석을 하였다. 염기서열은 (주) 바이오 넥스에 의뢰하여 분석하였고, 얻어진 염기서열은 BLAST 프로그램 (http://wwwmcbi.nlm.nih.gov/blast)을 사용하여 이미 알려진 염기 서열과 비교 분석하였다.
성능/효과
- 65. 0.53, 0.4, 및 0.25 kbp의 분획 양상을 나타내어 다른 Bacillus 종과 확연히 구분되었으며, 탄저균 내에서도 서로 다른 유전형의 차이(genotype)가 나타났다. 즉, 경주주에서는 약 560 bp의 단분획을, 홍성주에서는 약 530 bp의 단분획을 나타내 국내에서 발견된 탄저균은 서로 다른 분획 양상을 보였으며.
- 본 연구에서는 RAPD-PCR을 이용하여 여러 Bacillus 종사이 에서 탄저균의 분자생물학적인 동정과 탄저균 사이에서의 유전형의 차이를 구별할 수 있는 방법들을 적용하여 실험을 실시하였다. 그 결과 BAR5 primer를 이용하여 RAPD-PCR을 행한 후, 나타난 분획 양상에 의하여, 홍성과 경주에서 분리된 탄저균주는 서로 유전형의 차이가 있음을 나타냈다(Fig. 3). 경주에서 분리된 탄저균은 B.
- lane 2-8). 대조균주인 11종의 Bacilluse: 각각 독특한 분획 양상을 보임으로써, 모두 탄저균과는 다른 양상을 나타내 탄저균과 구분되었다(Fig. 1. lane 9-19).
- AF360859). 이를 확인하기 위하여 얻어진 단분획을 이용하여 Southren blotting 분석을 실시한 결과(Fig. 4), 탄저균들은 모두 약 5.2. 그리고 1.
- mycoides 등은 구입하지 못하여 비교할 수 없었다. 홍성과 경주에서 발견된 균주를 포함한 탄저균은 약 2.4, 1.3, 0.95, 0.5, 그리고 0.22 kbp의 뚜렸한 5개의 분획이 나타나는 양상을 보였다 (Fig. 1. lane 2-8). 대조균주인 11종의 Bacilluse: 각각 독특한 분획 양상을 보임으로써, 모두 탄저균과는 다른 양상을 나타내 탄저균과 구분되었다(Fig.
- anthracis ATCC14185 주와 같은 분획 양상을 나타냈다. 홍성에서 분리된 탄저균의 RAPD에서 얻어진 528 bp 단분획의 염기서열 분석 결과(자료생략)는, 알려진 염기서열과 유사하지 않은 결과를 보였고 또한 BLAST 프로그램을 사용하여 기존에 밝혀진 염기서열과 비교 분석하였을 경우에도 일치하는 것이 없어서. 탄저균만의 독특한 염기서열로 인정되었다(NCB1 GenBank accession no.
후속연구
- 5 kbp의 분획을 나타냈다. 이 단편의 클로닝에 의한 완전한 염기서열을 분석이 가능할 것으로 생각하며. 이를 이용할 경우 Ba813과(22) 같은 탄저균 검색을 위한 DNA탐침으로의 활용 및 단백질의 구조, 기능 등의 연구에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 보여 진다.
- 이 단편의 클로닝에 의한 완전한 염기서열을 분석이 가능할 것으로 생각하며. 이를 이용할 경우 Ba813과(22) 같은 탄저균 검색을 위한 DNA탐침으로의 활용 및 단백질의 구조, 기능 등의 연구에 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 보여 진다.
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