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문제 정의
- 본 연구에서는, 면역체(immunome) 분석을 통하여(5, 12, 19) 탄저균에 존재하는 새로운 면역원성 항원의 발굴을 위한 첫 단계로서, 대장균 유래의 탄저균 전장유전자 발현 라이브러리(whole genomic expressin library) 구축을 시도하였다. 구축된 유전자 발현 라이브러리들에 대하여 무작위 DNA 염기서열분석을 통하여 클론 중복성을 조사하였고, 단백질 유도발현 여부를 확인하였음은 물론, 탄저균 항혈청을 이용한 colony blot을 통하여 양성반응을 보이는 클론이 존재함을 확인하고자 하였다. 본 연구에서 제시된 결과는, 구축된 탄저균 유전자 발현 라이브러리가 향후 새로운 in vivo-induced 면역원을 탐색하기 위한 탄저 면역체(immunome)분석에 적용될 수 있음을 암시한다.
- 이들 클론을 포함하는 -80℃ 분획으로부터 분리된 플라즈미드는 IPTG 첨가에 의해 단백질 유도발현이 가능하며, 프로테아제(protease)가 결핍된 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 그 결과물인 클론들을 유전자 발현 라이브러리로서 수집하였다. 본 연구에서 약 105개의 유전자 발현 라이브러리를 구축할 수 있었고, 클론 중복성을 확인하기 위하여 이들 중 111개의 무작위 클론들로부터 분리된 플라즈미드에 대한 삽입유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열 분석결과, 111개 중 56개(50.
- 효율적인 탄저후보백신의 개발을 위하여, 새로운 면역원의 발굴은 필수적이며, 특히 in vivo-induced 탄저균 항원의 발굴은 매우 중요한 과정이다. 본 연구에서는, 면역체(immunome) 분석을 통하여(5, 12, 19) 탄저균에 존재하는 새로운 면역원성 항원의 발굴을 위한 첫 단계로서, 대장균 유래의 탄저균 전장유전자 발현 라이브러리(whole genomic expressin library) 구축을 시도하였다. 구축된 유전자 발현 라이브러리들에 대하여 무작위 DNA 염기서열분석을 통하여 클론 중복성을 조사하였고, 단백질 유도발현 여부를 확인하였음은 물론, 탄저균 항혈청을 이용한 colony blot을 통하여 양성반응을 보이는 클론이 존재함을 확인하고자 하였다.
- 따라서, 인체에 적용 가능하며 보다 안전한 탄저 치료제 및 백신 개발이 요구되고 있으며, 최근 탄저균 아포 및 영양세포, 그리고 탄저독소(Anthrax toxins)에 대한 동시 면역을 유도하는 다가백신 개발이 보고된 바 있다. 본 연구에서는, 향후 탄저균에 대한 새로운 다가백신 후보물질 발굴을 위하여, 탄저균에 대한 전장 유전자 발현 라이브러리(whole genomic expression library)를 구축하였다. 라이브러리 구축을 위하여, 탄저균(ATCC 14578) 게놈 DNA를 Sau3AI으로 부분 제한효소 처리였고, 유도 발현이 가능한 pET30abc 벡터에 접합시킴으로써, 총 1×105개에 해당하는 대장균 BL21(DE3) 유래의 전장 유전자 발현 라이브러리를 구축하였다.
제안 방법
- 총 5 μg의 pET30abc를 BamHI 제한효소(20 unit)로 37℃에서 3시간 동안 반응시킨 다음, 자가 접합(self-ligation)을 방지하고자 10 unit의 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase; New England Biolaboratory, USA)로 37℃, 30분 동안 반응하였다. 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후, 벡터 플라즈미드를 Gel Extraction kit (Real Biotech Corporation)를 사용하여 추출하였다. 이후 탈인산화(dephosphorylation)되지 않은 벡터 플라즈미드를 제거하기 위하여 T4 ligase (New England Biolaboratory)로 4℃에서 16시간 동안 자가접합시킨 후, 1% 아가로즈겔에 전기영동하여 자가 접합되지 않은 벡터만을 Gel Extraction kit (Real Biotech Corporation)를 이용하여 회수하였다.
- 45 μm PVDF membrane (Immobilon P; Millipore, USA)에 semi-dry transfer system (Bio-Rad, USA)을 사용하여 전이시켰고, 5% (w/v) bovine serum albumin을 이용하여 blocking을 수행하였다. 1차 및 2차 항체로서 anti-histidine 항체(IG THERAPY, Korea)와 Horse radish peroxidase-labeled goat anti-mouse lgG 항체(Pierce, USA)를 각각 1:5,000, 1:20,000으로 희석하여 사용하였고, ECLTM Plus Western-blotting Detection kit (GE Healthcare Life Sciences, USA)를 사용하여 발현된 단백질을 검출하였다. Colony blot은 임의로 선발된 96개의 개별 clones에 대하여, 불활화된 비병원성 탄저포자에 대한 기니픽 항혈청(질병관리본부)을 가지고 Bio-Dot® microfiltration system (Bio-Rad)을 사용하여 수행하였다.
- Colony blot은 임의로 선발된 96개의 개별 clones에 대하여, 불활화된 비병원성 탄저포자에 대한 기니픽 항혈청(질병관리본부)을 가지고 Bio-Dot® microfiltration system (Bio-Rad)을 사용하여 수행하였다.
- The colony PCRs using the universal T7 promoter and terminator primers were performed for all the randomly selected clones. The PCR was carried out with an initial denaturation at 95℃ for 3 min, followed by 30 cycles of 95℃, 1 min, 62℃, 1 min, and 72℃, 3 min and a final extension at 72℃ for 10 min. All the PCR products were analyzed by 1% agarose gel electro-phoresis after EtBr staining.
- 결론적으로, 본 연구에서는 약 5.23 Mb로 알려진 탄저균 게놈 DNA (18)로부터 Sau3AI 제한효소의 부분절단에 의해 생산된 0.5-1.5 kb와 1.5-3.0 kb DNA 절편들을 회수하여 pET30abc에 접합시킴으로써 총 1×105개의 BL21(DE3) 유래탄저균 전장유전자 발현 라이브러리를 구축하였고, 구축된 라이브러리로부터 탄저균 단백질의 유도발현을 확인하였다.
- 고형배지 제조를 위하여, 동일한 액체배지 성분에 1.5%(w/v) agar를 첨가하였으며, 단백질 유도발현을 위하여 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 사용하였다.
- 구축된 전장유전자 발현 라이브러리로부터 탄저균 유전자산물의 발현 여부를 확인하고자, -80℃에 보관되어 있는 유전자 발현 라이브러리의 분획 일부를 ampicillin이 함유된 4 ml의 LB 배지에 접종한 후, 1 mM IPTG를 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가한 뒤 3시간 동안 추가 배양하였고, 배양액은 2× Laemmli sample buffer에 희석하여 95℃에서 10분 동안 단백질 변성시킨 후, 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 실시하였다.
- 라이브러리 구축을 위하여, 탄저균(ATCC 14578) 게놈 DNA를 Sau3AI으로 부분 제한효소 처리였고, 유도 발현이 가능한 pET30abc 벡터에 접합시킴으로써, 총 1×105개에 해당하는 대장균 BL21(DE3) 유래의 전장 유전자 발현 라이브러리를 구축하였다.
- 먼저 5 μg의 BamHI-digested pET30abc 벡터를 Calf intestinal alkaline phosphatase로 dephosphorylation 시킨 후 1% 아가로즈 겔로부터 회수하였고(Fig. 1A), 회수된 벡터는 T4 ligase를 이용하여 자가 접합처리하였다.
- 염기서열분석은 마크로젠(Marcrogen, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열정보는 BLAST 탐색을 통하여 동정하였다.
- 이후, -80℃에 보관된 분획으로부터 플라즈미드을 추출한 후, 상기에 기술된 조건에 따라 electroporation을 실시하여 발현 대장균주인 BL21(DE3)에 도입하였다. 선택배지를 통해 선발된 유전자 발현 라이브러리 클론들을 회수하여 -80℃에 보관하였으며, 분획 중 무작위로 선발된 111개의 클론에 대하여 클론 중복성을 분리된 플라즈미드에 존재하는 삽입절편의 염기서열 분석을 통하여 확인하였다. 염기서열분석은 마크로젠(Marcrogen, Korea)에 의뢰하여 수행하였다.
- 선택배지를 통해 선발된 유전자 발현 라이브러리 클론들을 회수하여 -80℃에 보관하였으며, 분획 중 무작위로 선발된 111개의 클론에 대하여 클론 중복성을 분리된 플라즈미드에 존재하는 삽입절편의 염기서열 분석을 통하여 확인하였다. 염기서열분석은 마크로젠(Marcrogen, Korea)에 의뢰하여 수행하였다. 분석된 염기서열정보는 BLAST 탐색을 통하여 동정하였다.
- 3). 이들 클론을 포함하는 -80℃ 분획으로부터 분리된 플라즈미드는 IPTG 첨가에 의해 단백질 유도발현이 가능하며, 프로테아제(protease)가 결핍된 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 그 결과물인 클론들을 유전자 발현 라이브러리로서 수집하였다. 본 연구에서 약 105개의 유전자 발현 라이브러리를 구축할 수 있었고, 클론 중복성을 확인하기 위하여 이들 중 111개의 무작위 클론들로부터 분리된 플라즈미드에 대한 삽입유전자의 염기서열 분석을 실시하였다.
- 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후, 벡터 플라즈미드를 Gel Extraction kit (Real Biotech Corporation)를 사용하여 추출하였다. 이후 탈인산화(dephosphorylation)되지 않은 벡터 플라즈미드를 제거하기 위하여 T4 ligase (New England Biolaboratory)로 4℃에서 16시간 동안 자가접합시킨 후, 1% 아가로즈겔에 전기영동하여 자가 접합되지 않은 벡터만을 Gel Extraction kit (Real Biotech Corporation)를 이용하여 회수하였다.
- 이후, -80℃에 보관된 분획으로부터 플라즈미드을 추출한 후, 상기에 기술된 조건에 따라 electroporation을 실시하여 발현 대장균주인 BL21(DE3)에 도입하였다. 선택배지를 통해 선발된 유전자 발현 라이브러리 클론들을 회수하여 -80℃에 보관하였으며, 분획 중 무작위로 선발된 111개의 클론에 대하여 클론 중복성을 분리된 플라즈미드에 존재하는 삽입절편의 염기서열 분석을 통하여 확인하였다.
- unit이 되도록 이진희석한 Sau3AI 제한효소를 가지고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이후, 1% 아가로즈겔 상에서 제한효소에 의해 최적의 부분절단(partial digestion) 양상을 보여준 농도를 결정하였다. 확립된 조건하에서 부분절단된 DNA 절편을 1% 아가로즈겔 전기영동 후, 0.
- 배양된 클론들을 모두 회수한 후, 분획하여 -80℃에 보존하였다. 임의로 선발된 클론들에 대하여 T7 promoter/T7 terminator primers을 사용한 colony PCR을 실시하여 삽입절편의 존재를 확인하였다. PCR은 95℃에서 3분간 열처리한 후, 95℃에서 1분, 62℃에서 1분, 72℃에서 3분간 반응을 30회 반복하고, 최종적으로 72℃에서 10분간 수행하였다.
- 준비된 벡터와 삽입유전자 절편은 1:10 농도 비율(25 ng 벡터 : 250 ng 삽입유전자 절편)로 섞어 T4 ligase (10 units)를 사용하여 4℃에서 16시간 반응시켰고, 이후 대장균 DH5α에 25 μFD, 200 W, 2.5 kV 그리고 200 ohm의 조건을 가지고 electroporation을 실시하여 접합된 플라즈미드를 도입하였다.
- 탄저균 게놈 DNA는 0.5-1.5 kb와 1.5-3.0 kb에 해당하는 유전자 절편을 최적으로 생산하는 제한효소의 농도 및 반응 조건을 알아내기 위하여, 1 μg의 게놈 DNA를 연속 2진 희석시킨 Sau3AI 제한효소로 반응시킨 후, 1% 아가로즈겔 전기영동을 통하여 절단양상(restriction profile)을 확인하였다(Fig. 2A).
- pET30abc 발현벡터는 T7 promoter에 의해 전사 조절되며 3가지의 가능한 reading frame으로 삽입 유전자의 발현을 극대화 할 수 있다. 탄저균 게놈 DNA로부터 선발된 유전자의 효율적인 cloning을 위하여, pET30abc 발현벡터는 두 개의 연속적인 실험 과정을 거쳐 정제 농축하였다. 먼저 5 μg의 BamHI-digested pET30abc 벡터를 Calf intestinal alkaline phosphatase로 dephosphorylation 시킨 후 1% 아가로즈 겔로부터 회수하였고(Fig.
- 이후, 1% 아가로즈겔 상에서 제한효소에 의해 최적의 부분절단(partial digestion) 양상을 보여준 농도를 결정하였다. 확립된 조건하에서 부분절단된 DNA 절편을 1% 아가로즈겔 전기영동 후, 0.5-1.5 kb와 1.5-3.0 kb에 해당하는 2개의 부위를 Gel Extraction kit (Real Biotech Corporation)를 이용하여 회수 및 농축하여, 라이브러리 구축에 사용하였다.
대상 데이터
- 질병관리본부로부터 분양받은 탄저균(ATCC 14578) 게놈 DNA 1 μg을 20에서 2-8 unit이 되도록 이진희석한 Sau3AI 제한효소를 가지고, 37℃에서 1시간 반응시켰다.
- 탄저균(ATCC 14578) 게놈 DNA를 이용한 전장유전자 발현 라이브러리 구축을 위한 플라즈미드 및 숙주균주로서 pET30abc(Novagen, Germany)와 대장균 BL21(DE3) (Novagen) 혹은 DH5α를 사용하였다.
- 플라즈미드 pET123abc는 HiYield™ Plasmid Mini kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)를 이용하여 분리⋅정제하였다.
성능/효과
- 1A), 회수된 벡터는 T4 ligase를 이용하여 자가 접합처리하였다. Dephosphorylation 되지 않은 벡터는 자가접합하며, 이러한 결과산물을 1% 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하였을 때, DNA 위상학적 차이에 의해 자가 접합된 벡터는 선형(linearized) 벡터보다 천천히 이동함을 확인하였고(Fig. 1B, arrow), 겔로부터 선형 벡터만을 회수하였다(Fig. 1C). 이렇게 준비된 벡터는 50 ng/μl로 정량화하였으며, 대장균에 도입하였을 때 10개 미만의 자가 접합 클론들을 생산하였다(자료 미제시).
- 구축된 전장유전자 발현 라이브러리는 histidine 에피톱이 아미노 말단(N terminus)에 부착된 탄저균 재조합단백질을 발현하므로, IPTG를 첨가하여 단백질을 유도 발현시킨 후 anti-histidine에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있었고(Fig. 4A), 이는 탄저균 재조합 단백질이 발현됨을 암시한다. 따라서, 본 연구에서는 탄저균 항혈청을 이용하여 무작위 96개의 개별 클론들에 대한 colony blot을 수행하여, 탄저균 감염숙주에서 면역반응을 유도할 수 있는 면역원을 검출을 시도하였던 바, 2개의 클론에서 양성반응을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 구축된 전장유전자 발현 라이브러리의 일부 클론들에 대하여 colony PCR을 수행한 결과, 대부분의 클론들이 0.5-3.0 kb에 해당하는 삽입유전자를 가지고 있음을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 이들 클론을 포함하는 -80℃ 분획으로부터 분리된 플라즈미드는 IPTG 첨가에 의해 단백질 유도발현이 가능하며, 프로테아제(protease)가 결핍된 대장균 BL21(DE3)에 도입하였고, 그 결과물인 클론들을 유전자 발현 라이브러리로서 수집하였다.
- 따라서 모든 게놈 DNA 삽입유전자 절편은 이러한 조건 하에서 제한효소 처리하였으며, Fig. 2B는 이렇게 회수된 유전자 절편을 아가로즈겔로부터 분리ㆍ회수되었음을 보여주고 있으며, 회수된 삽입유전자들은 100 ng/μl의 농도로 정량화하였다.
- 4A), 이는 탄저균 재조합 단백질이 발현됨을 암시한다. 따라서, 본 연구에서는 탄저균 항혈청을 이용하여 무작위 96개의 개별 클론들에 대한 colony blot을 수행하여, 탄저균 감염숙주에서 면역반응을 유도할 수 있는 면역원을 검출을 시도하였던 바, 2개의 클론에서 양성반응을 확인 할 수 있었다(Fig. 4B). 이러한 결과는 구축된 전장유전자 발현 라이브러리를 이용하여, 탄저균 항혈청에 반응하는 새로운 면역원을 탐색할 수 있음을 암시한다.
- 2%)는 BLAST 탐색에서 일치하는 유전자를 찾지 못하였다. 또한 웨스턴 분석을 통하여 단백질 유도발현을 확인하였으며, 탄저균 항혈청에 대한 colony blot으로부터 양성반응을 보이는 일부 클론들을 확인할 수 있었다. 이러한 결과물들은, 구축된 전장 유전자 발현 라이브러리가 향후 탄저균에 대한 면역체(immunome) 분석을 위해 적용 가능함을 암시한다.
- 본 연구에서 약 105개의 유전자 발현 라이브러리를 구축할 수 있었고, 클론 중복성을 확인하기 위하여 이들 중 111개의 무작위 클론들로부터 분리된 플라즈미드에 대한 삽입유전자의 염기서열 분석을 실시하였다. 염기서열 분석결과, 111개 중 56개(50.5%)가 탄저균 유전자로 확인되었으며, 17개(15.3%)는 벡터 유전자였고, 38개(34.2%)는 BLAST 탐색에서 일치하는 서열을 찾지 못하였다(Table 1). 확인된 탄저균 유전자는 D-alanine carrier protein, oligopeptide ABC transporter protein, pXO1 유래 유전자, transcription terminator, trans-cription activator, Methenyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase, sensor histidine kinase/permease, pyruvate kinase, ComG operon protein, 그리고 neutral protease 등 이었다(Table 2).
- 라이브러리 구축을 위하여, 탄저균(ATCC 14578) 게놈 DNA를 Sau3AI으로 부분 제한효소 처리였고, 유도 발현이 가능한 pET30abc 벡터에 접합시킴으로써, 총 1×105개에 해당하는 대장균 BL21(DE3) 유래의 전장 유전자 발현 라이브러리를 구축하였다. 염기서열분석을 통한 중복성(redun-dancy) 확인 결과, 111개의 무작위 클론 중 56개(50.5%)가 탄저균 유전자로 확인되었으며, 17개(15.3%)는 벡터 유전자였고, 38개(34.2%)는 BLAST 탐색에서 일치하는 유전자를 찾지 못하였다. 또한 웨스턴 분석을 통하여 단백질 유도발현을 확인하였으며, 탄저균 항혈청에 대한 colony blot으로부터 양성반응을 보이는 일부 클론들을 확인할 수 있었다.
- 2%)는 BLAST 탐색에서 일치하는 서열을 찾지 못하였다(Table 1). 확인된 탄저균 유전자는 D-alanine carrier protein, oligopeptide ABC transporter protein, pXO1 유래 유전자, transcription terminator, trans-cription activator, Methenyl-tetrahydrofolate cyclohydrolase, sensor histidine kinase/permease, pyruvate kinase, ComG operon protein, 그리고 neutral protease 등 이었다(Table 2).
후속연구
- 구축된 유전자 발현 라이브러리들에 대하여 무작위 DNA 염기서열분석을 통하여 클론 중복성을 조사하였고, 단백질 유도발현 여부를 확인하였음은 물론, 탄저균 항혈청을 이용한 colony blot을 통하여 양성반응을 보이는 클론이 존재함을 확인하고자 하였다. 본 연구에서 제시된 결과는, 구축된 탄저균 유전자 발현 라이브러리가 향후 새로운 in vivo-induced 면역원을 탐색하기 위한 탄저 면역체(immunome)분석에 적용될 수 있음을 암시한다.
- 또한 웨스턴 분석을 통하여 단백질 유도발현을 확인하였으며, 탄저균 항혈청에 대한 colony blot으로부터 양성반응을 보이는 일부 클론들을 확인할 수 있었다. 이러한 결과물들은, 구축된 전장 유전자 발현 라이브러리가 향후 탄저균에 대한 면역체(immunome) 분석을 위해 적용 가능함을 암시한다.
- 0 kb DNA 절편들을 회수하여 pET30abc에 접합시킴으로써 총 1×105개의 BL21(DE3) 유래탄저균 전장유전자 발현 라이브러리를 구축하였고, 구축된 라이브러리로부터 탄저균 단백질의 유도발현을 확인하였다. 이러한 구축된 유전자 발현 라이브러리를 기반으로 탄저균 면역체 분석을 실시 혹은 적용함으로써 기존에 알려지지 않았던 새로운 면역원 혹은 in vivo induced antigens의 탐색에 기여 할 수 있을 것으로 사료된다.
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