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문제 정의
- 우리는 이 실험에서 집단식중독을 일으킨 황색포도상구균을 분리동정하고 enterotoxin형 및 항생제 감수성을 조사하여 황색포도상구균의 특성을 조사하고자 하였다.
제안 방법
- PCR 산물은 1.5% agarose(0.5X Tris boric acid, EDTA) gel에서 100V로 전기 영동하고 ethidium bromide (5 Jlg/ml)로 염색한 후 transilluminatorS- 확인하였다. 산물의 크기는 100 bp molecular weight ladder(DNA Molecular Weight Marker XIV:Boerhinger Mannheim)를 사용하여 측정하였다.
- 황색포도상구균 enterotoxin 형별 multiplex PCR 은 thermocycler(T-Gradient: Biometra)를 사용하여 실시하였다. PCR용량은 50卩1으로 하였으며, 시약은 IX Taq polymerase buffer, 4 mM MgCl2, 300 nM primer, 400 卩M dNTP, 5U of Taq polymerase 및 시험균 DNA template 50ng으로 조제하였다. PCR조건은 95°C denatxiration 1분, 68°C anneal ing 45초 및 72°C extension 1 분을 15회 반복하고 95°C denaturation 1분, 64°C annealing 45초 및 72°C extension 1 분을 16회 반복하였으며 72°C최종 extension을 10분하고 정지하였다.
- PCR용량은 50卩1으로 하였으며, 시약은 IX Taq polymerase buffer, 4 mM MgCl2, 300 nM primer, 400 卩M dNTP, 5U of Taq polymerase 및 시험균 DNA template 50ng으로 조제하였다. PCR조건은 95°C denatxiration 1분, 68°C anneal ing 45초 및 72°C extension 1 분을 15회 반복하고 95°C denaturation 1분, 64°C annealing 45초 및 72°C extension 1 분을 16회 반복하였으며 72°C최종 extension을 10분하고 정지하였다.
- enterotoxin과 Toxic Shock syndrome toxin-l(TSST-l)은 Monday와 Bohach의 방법에 따라 실시하였다가)황색포도상 구균의 genomic DNA는 Bohach 등의 방법에 따라 lyso- staphin처리에 의해 얻었으며'phenol chloroform 처리 및 ethanol 침전법에 의해 순수 정제하였다“)DNA는 원심 분 리하여 회수하고 진공 건조시키고 증류수 200卩1에 재차 녹인 다음 260 및 280 nm의 흡광도를 측정하여 최종농도가 lOng/ul로 조절하였다.
- 5X Tris boric acid, EDTA) gel에서 100V로 전기 영동하고 ethidium bromide (5 Jlg/ml)로 염색한 후 transilluminatorS- 확인하였다. 산물의 크기는 100 bp molecular weight ladder(DNA Molecular Weight Marker XIV:Boerhinger Mannheim)를 사용하여 측정하였다.
- 시료는 MSEY 및 Baird-Parker medium에 도말한 후 37 °C 4内간 배양한 후 MSEY medium에서는 황색의 불투명 황색환을 형성한 집락과 Baird-Parker medium에서는 흑색의 투명환을 형성한 집락을 황색포도상구균으로 추정하여 분리한 후 혈액배지에 도말 배양하여 순수 분리하였다. 순수 분리한 집락은 API staph kit(bioMerieux)에 의한 생화학시험에 의해 황색포도상구균임을 동정하였다.
- 36°C에 배양하고 6시간 후 응고물질 형성을 주기적으로 검사하였다. 시험관을 옆으로 기울일 때 응고된 상태로 되어 있는 것을 양성으로 판정하였다.
- 황색포도상구균 enterotoxin 형별 multiplex PCR 은 thermocycler(T-Gradient: Biometra)를 사용하여 실시하였다. PCR용량은 50卩1으로 하였으며, 시약은 IX Taq polymerase buffer, 4 mM MgCl2, 300 nM primer, 400 卩M dNTP, 5U of Taq polymerase 및 시험균 DNA template 50ng으로 조제하였다.
대상 데이터
- 황색포도상구균을 Muller Hinton broth 5诫에 접종한 후 37°C에서 150rpm으로 진탕배양하였다. 배양 균액은 0.5 McFarland turbidity stamdrd에 맞추어 희석하였다、 대조균액으로 E. 也侬 ATCC®25922), S. aureus(ATCC® 25923)를 사용하였다. 항생제 디스크는 다음의 것들을 사용하였다(BBL®):Penicillin G(P, 10U), Ampicillin(AM, 10p.
- 식중독 설사환자의 분변 413건을 조사하여 총 105건(25.4 %)의 황색포도상구균을 분리하였다. 이 분리균 중 15주는 설사 환자에서 분리한 것이며, 90건은 건강보균자에서 분리한 것이다.
- 푸 두상구균 식중독은 1884년 Vaughan과 Sternberg에 의해 최초로 보고되었다. 이 사례는 미국 미시간주에서 체다치즈를 먹은 300명이 발생한 대규모의 식중독 사건이었다.2)30 년이 지난 후 Baber는 필리핀의 한 농장에서 유방염에 걸린 젖소에서 착유한 우유에 의한 식중독을 보고하였다.
- aureus(ATCC® 25923)를 사용하였다. 항생제 디스크는 다음의 것들을 사용하였다(BBL®):Penicillin G(P, 10U), Ampicillin(AM, 10p.g), Cephalothin(CF, 30|丄g), Erythromycin(E, 15 p.g), Chloram- phenicol(C, 3이丄g), Clindamycin(CC, 2 |lg), Nitrofurantoin (F/M, 300 |ig), SXT(Trimethoprim/sulfa-methoxazole, 1.25/23.75 pg), Vancomycin(Va, 30 gg), Kanamycin(K, 30 |Llg), Amikacin(AN, 30 jig), Methicillin(DP, 5 卩g). 감수성 은 National Commette for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)⑸의 기준에 의하여 판정하였다
이론/모형
- coagulase 생산 시험은 시험관법으로 조사하였다. 분리균 은 37°C에서 24시간 배양한 후 의심되는 집락을 saline broth가 0.
- aureus균을 BHI broth 에서 37°C 16〜18시간 배양하고 여과멸균하여 여과액을 시험액으로 사용하였다. enterotoxin으 SET-RPLA(Denka Seiken,Japan)# 이용하였으며 제조회사의 시험방법에 따라 시험하 였다.
- 75 pg), Vancomycin(Va, 30 gg), Kanamycin(K, 30 |Llg), Amikacin(AN, 30 jig), Methicillin(DP, 5 卩g). 감수성 은 National Commette for Clinical Laboratory Standards(NCCLS)⑸의 기준에 의하여 판정하였다
- 항생제 감수성시험은 Kirby-Bauer 디스크 시험법에 의하여 실시하였다. 황색포도상구균을 Muller Hinton broth 5诫에 접종한 후 37°C에서 150rpm으로 진탕배양하였다.
성능/효과
- 罚 양젖에서 SEA와 SED가 전체의 35%를 차지하였으며, 축산제품과 식육제품에서 96%가 SEA라고 보고하였다.3°)그러나 본 실험에서는 42.9%에서 enterotoxin0] 분리되었으며, 이 중 SEA가 전체의 20%, SEH가 73.3%를 차지하여, 매우 다른 양상을 보였다. 특히 국내에서 분리된 유방염유래 포도상구균의 30%에서 enterotoxin이 검출되고 이중 2/3가 sea/e, 1/3이 seb/c로 확인된 것과는 매우 다른 양상을 나타내었다.
- 그 밖의 B-F, J〜H형 enterotoxin 및 TSST gene은 검출되지 않았다. SET-RPLA에 의한 enterotoxin의 면역학적 시험에서 SEA enterotoxin만 9주 검출되었고 나머지 균주는 SET-RPLA 음성이었다. 또한 SET-RPLA SEA enterotoxin 양성균주는 PCR법에 의한 enterotoxin 시험에서 동일한 SEA gene을 갖고 있음이 확인되었다.
- 즉 모든 균은 chloramphenicol, clindamycin, cephalothin, trimethoprim/sulfamethoxazole 및 vancomycin에 대하여 감수성을 나타내었다. amikacin(99.0%), nitrofurantoin(99.0 %), methicillin(98.1%), erythromycin(97.1 %) 및 kanamycin(96.2%)에 대해서는 높은 감수성을 나타내었으나 ampicillin (50.5%)과 penicillin(l%)은 감수성이 매우 낮았다. 특히 ampi- cillin오卜 penicillin의 중등도 내성은 각각 42.
- 그는 원인식품에서 포도상구균을 분리하여 그 배양액을 토끼에게 주사하였더니 심한 설사를 하고 폐사하는 것을 관찰하였다. 더욱이 3명의 임상자에서 배양액을 마시게 한 즉 3시간 후에 전원 식중독 증상을 나 타내는 것을 확인하고 이 포도상구균에 의한 식중독을 보고 한 그 해에 Jordan丘 프에토리코에서 만든 치즈에서 분리한 포도상구균을 W유로 배양하고 그 우유를 임상실험자에게 마시게 하였더니 똑같은 식중독 증상이 일어나는 것을 확인하 였다. 이와 같이 Dack나 Jordan의 연구성과에서 포도상구균 식중독은 enterotoxin에 의해 일어나는 것임이 입증되었고, 그 이후 세계 각 국에서 이 균에 의한 식중독이 수없이 보 고되었다.
- SET-RPLA에 의한 enterotoxin의 면역학적 시험에서 SEA enterotoxin만 9주 검출되었고 나머지 균주는 SET-RPLA 음성이었다. 또한 SET-RPLA SEA enterotoxin 양성균주는 PCR법에 의한 enterotoxin 시험에서 동일한 SEA gene을 갖고 있음이 확인되었다.
- 본 실험에서 penicillin은 내성 38.1%, 중등도 내성 61%이었으며 1주만이 감수성을 나타내어 높은 내성을 나타내었으며, ampicillin 내성 6.7%, 중등도 내성 42.9%로 [3- lactam계 항생제에 대하여 내성을 나타내었다. 그러나 methicillin에 대한 내성은 없었고 중등도 내성 1.
- 2제 이상의 항생물질에 대하여 내성을 나타낸 균주는 7주 (7%)이었다. 시험한 황색포도상구균 105주 중, 4주(8.3%)는 penicillin-ampicillin 다제내성 이었으며, 1주(2.1 %) penicillinkanamycin 및 penicillin-amikacin에 대하여 내성이 나타내었으며, 1주는 penicillin-ampicillin-nitrofurantoin 3제 내성이었다(Table 4).
- 시험한 황색포도상구균 105주 중에서 48주(46%)는 적어도 한 항생물질에 대하여 내성을 나타내었다. 34주(70.
- 황색포도상구균의 항생제 감수성 결과는 Table 3과 같았다. 즉 모든 균은 chloramphenicol, clindamycin, cephalothin, trimethoprim/sulfamethoxazole 및 vancomycin에 대하여 감수성을 나타내었다. amikacin(99.
- 황색포도상구균으로 동정된 105건에 대하여 enterotoxin 형별시험을 한 결과는 Table 2와 같았다. 총 45주(42.9%)에서 enterotoxin이 분리되었으며, A형 enterotoxin은 9주(20.0 %)에서 검출되었으며, 鶴 enterotoxin은 33주(73.3%)에서 발견되었다. G형 enterotoxin은 2주(4.
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