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문제 정의
- 이에 본 연구는 미백효과에 미치는 백출의 영향을 조사하고자 백출의 에탄올 추출물을 B16/F10 melanoma 세포에 처리하여 세포의 형태적 변화, 세포수의 변화, 멜라닌 양 및 tyrosinase 활성도를 측정하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 6에서 보는 바와 같이, forskolin 처리시 대조군에 비하여 약 4 배의 멜라닌생성이 증가하였으나, 백출을 농도별로 처리한 실험군에서는 모두 억제효과를 나타내었으며, 억제정도는 a-MSH 처리군과 마찬가지로 forskolin 처리군에 백출을 처리한 실험군이 고유 멜라닌화의 억제보다 효과가 크게 나타났다. B16/F10 melanoma 세포의 고유한 멜라닌 생성과 외부자극에 의해 멜라닌 생성이 유도된 경우에 미치는 백출의 영향을 비교, 관찰하기 위하여 어떤 처리도 하지 않은 군과 a-MSH 및 forskolin으로 멜라닌 생성을 유도한 군에 20|ig/m/ 백출 추출물을 처리하여 백출 추출물의 억제효과를 비교하였다(Fig. 7). 20飓徊 백출을 단독 처리한 경우에는 대조군에 비하여 16%의 억제효과를 보였다.
- 이를 더욱 분명하게 확인하고 외부자극에 의해 유발되는 B16/F10 melanoma 세포의 과색소침착에 미치는 백출의 저해효과를 관찰하기 위하여 a-MSH와 forskolin으로 자극함과 동시에 백출 추출물을 다양한 농도로 처리하여 외부자극에 의한 멜라닌화에 미치는 백출의 영향을 관찰하였다. Fig. 3에서 멜라닌 합성이 높게 나타나면서 농도가 낮은 1 nM의 a-MSH로 세포를 처리하고, 백출을 농도별로 처리한 다음 48 시간 배양한 후, tyrosinase 활성도와 멜라닌 양을 측정하였다. Fig.
- MTT Assay-시료의 처리농도를 결정하기 위한 MTT(3-(4, 5-dimethylthiazol-2-gl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) 정량은 Mosmann의 방법'紛을 변형하여 실시하였다. 세포를 48 시간 배양한 후 상층액을 버리고 당일 제조한 500 |ig/mZ MTT를 배양 용기당 1 m/씩 넣어 은박지로 포장한 후 3 시간 동안 배양하였다.
- Trypan blue 검사 - 대조군과 실험군의 각 well에 0.05% tyrosine-0.02% EDTA 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리수거하였다. 이 분리수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.
- 먼저 측정하였다. a-MSH가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 밝히기 위하여 a-MSH 처리 후에 tyrosinase의 활성도와 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig.
- a-MSH가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접 확인하기 위하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. Fig.
- 또한 세포의 형태학적 변화를 관찰해 본 결과 대조군과 큰 차이를 보이지 않았다. 따라서 이 범위에서 백출 추출물의 독성이 없는 것으로 생각되어 이 농도 범위에서 실험을 실시하였다.
- 4에서 보여준 고유 멜라닌화의 억제효과보다 a-MSH로 처리한 실험군에서의 억제효과가 더욱 크게 나타났다. 또한, 백출의 효능이 cAMP 매개에 의한 멜라닌 합성 증가를 억제하는 것인지 다시 확인, 조사하기 위하여 2.0 pM forsk이in과 백출을 농도별로 함께 처리하여 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig.
- 멜라닌 양 측정 - 멜라닌 양은 Hosoi19) 등의 방법을 변형하여 사용하였다. 세포를 배양하여 PBS로 2회 세척한 후 원심분리하여 세포 침전물을 만들었다.
- 백출 추출물을 1 μ以m/에서부터 50回m/끼지 단계적으로 첨가하여 48 시간 배양한 다음 tyrosinase 활성도를 측정하였다. Fig.
- 1에서 보는 바와 같이, 백출 추출물에 의한 세포의 생존율은 최고 50 [ig/ml 처리시에도 유의할만한 변화를 나타내지 않았다. 백출 추출물을 처리하고 세포수를 조사해본 즏 .과 세포수의 변화가 유의성 있게 나타나지 않았다.
- 백출 추출물이 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌화에 미치는 영향을 조사하기 전에 a-MSH에 의한 영향을 먼저 측정하였다. a-MSH가 멜라닌 합성에 미치는 영향을 밝히기 위하여 a-MSH 처리 후에 tyrosinase의 활성도와 멜라닌 생성을 측정하였다.
- 백출 추출물이 in 0沥7에서 멜라닌 합성에 미치는 영향을 직접적으로 확인하기 위하여 최종산물인 멜라닌 양을 측정하였다. 세포를 24시간 배양한 후 배양액을 교체하고, 백출 추출물을 에서부터 50 Ug/mZ까지 다양하게 처리한 다음 전체 멜라닌 양을 측정한 결과는 Fig.
- 백출의 에탄올 추출물이 피부의 멜라닌 색소 형성에 어떠한 영향을 나타내는지를 규명하기 위하여, B16/F10 melanoma 세포에 다양한 농도의 백출 추출물을 처리하여, 백출에 의한 B16/F10 melanoma 세포의 형태적 변화, 수적 변화, 멜라닌 양의 변화 및 tyrosinase 활성도를 측정하였으며, 백출에 의한 멜라닌 저해의 반응경로를 알아보기 위하여, a・MSH와 forskolin에 의한 멜라닌 생성을 비교하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 백출이 B16/F10 Melanoma 세포의 멜라닌화에 미치는 영향 - 백출이 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 밝히기 위하여 백출 추출물 처리 후에 멜라닌 합성 과정에서 중요한 효소인 tyrosinase 활성도를 측정하였다. 멜라닌 생합성 과정의 주된 효소인 tyrosinasee 생체내에서 tyrosine을 dopa(o-diphenol)로 산화시키는 tyrosine oxidase의 기능과 dopa를 dopaquinone으로 산화시키는 dopa oxidase의 기능을 갖는다.
- 세포를 48 시간 배양한 후 상층액을 버리고 당일 제조한 500 |ig/mZ MTT를 배양 용기당 1 m/씩 넣어 은박지로 포장한 후 3 시간 동안 배양하였다. 살아 있는 세포는 MTT와 반응하여 보라색 불용성 formazan 침전물이 형성되며 이것을 용해시키기 위하여 상층액을 버리고 10% DMSO를 200 以씩 넣고 15분간 실온에서 방치한 후 ELISA reader로 570nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 세포생존율에 미치는 영향 - 백출 추출물이 B16/F10 melanoma 세포의 증식에 어떤 영향을 미치는가를 알아보기 위하여 백출 추출물을 1 μ以E에서 50 ng/m/까지의 다양한 농도로 처리하고, 48 시간 후에 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig.
- )이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 penicillin-streptomycin(Sigma Chemical Co., USA) 100 I.U.-100 ug硕를 첨가하였으며, 약 24 시간 주기로 DMEM 배양액을 교체하였다.
- 멜라닌 양은 합성 멜라닌 (Sigma Co.>을 사용하여 작성된 표준 직선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다.
- 02% EDTA 용액을 가하여, 각 well에서 세포를 분리수거하였다. 이 분리수거한 세포를 PBS로 2회 세척한 후 0.02 m/와 동량의 0.4%(wv) trypan blue를 잘 섞은 다음 hemocytometer에 넣고 광학현미경을 이용하여 trypan blue에 염색되지 않은 살아 있는 세포수를 측정하였다.
- 4의 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 더욱 분명하게 확인하고 외부자극에 의해 유발되는 B16/F10 melanoma 세포의 과색소침착에 미치는 백출의 저해효과를 관찰하기 위하여 a-MSH와 forskolin으로 자극함과 동시에 백출 추출물을 다양한 농도로 처리하여 외부자극에 의한 멜라닌화에 미치는 백출의 영향을 관찰하였다. Fig.
대상 데이터
- 검액조제 - 본 연구에 사용한 백출은 원광대학교 한의과대학 한방병원에서 구입한 것을 검정받아 사용하였다. 백출을 잘게 썰어 11.
- 세포배양 -B16/F10 melanoma 세포는 CO2 세포배양기 (37℃, 5% CO)에서 10% fetal bovine serum (Gibco. Co.)이 포함된 DMEM 배지를 사용하였다. 여기에 penicillin-streptomycin(Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's T-test를 이용하였다.
- 통계방법 -실험결과는 평균±표준편차로 표시하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성에 대한 검증은 Student's T-test를 이용하였다.
이론/모형
- Tyrosinase 활성도 측정 - Matinez-Esparz/S의 방법에 의하여 측정하였다. 각 well의 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 만들고, 100 山의 lysis buffer(1% Triton X-100, 10 mM Sodium phosphate, 0.
성능/효과
- 1.백출 추출물은 B16/F10 melanoma 세포의 형태 및 세포수에 영향을 주지 않았다.
- 2. Tyrosinase 활성도 및 멜라닌 생성이 백출 처리군 모두에서 통계적으로 유의한 억제효과를 보였다. 3.
- Tyrosinase 활성도 및 멜라닌 생성이 백출 처리군 모두에서 통계적으로 유의한 억제효과를 보였다. 3. a-MSH와 forskolin 유도에 의한 멜라닌 생성에 더 큰 억제효과를 보였다.
- 2-3)색소침착과 피부 흑화 현상의 원인인 멜라닌은 자외선 등에 의한 피부의 광노화나 일광각화증을 억제하고 보호하는 긍정적인 기능令과 미용적인 측면에서 색소침착 뿐만 아니라 멜라닌 전구물질들에 의한 독성으로 세포의 사멸을 촉진하는 부정적인 기능도 가지고 있다.A) 특히 흰 피부에 대한 선호도가 높은 우리나라의 경우 피부의 과색소침착은 미용의 큰 장애가 아닐 수 없다. 이러한 피부의 과색소침착을 예방하고 개선하기 위한 미백제 연구가 많이 수행 되었으며, hydroquinone, arbutin, kojic acid, vitamin C 등이 함유된 미백 화장품 및 의약품이 시판되고 있으나, 실질적인 임상효과가 만족스럽지 못하여 지속적으로 개선된 원료개발을 위한 연구가 매우 활발하게 진행되고 있다, 9)
- 3에서 멜라닌 합성이 높게 나타나면서 농도가 낮은 1 nM의 a-MSH로 세포를 처리하고, 백출을 농도별로 처리한 다음 48 시간 배양한 후, tyrosinase 활성도와 멜라닌 양을 측정하였다. Fig. 5에서 보는 바와 같이, 백출 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 a-MSH에 의한 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 백출 추출물의 처리농도가 증가함에 따라 억제하는 효과를 나타내었고, 억제 정도는 Fig. 4에서 보여준 고유 멜라닌화의 억제효과보다 a-MSH로 처리한 실험군에서의 억제효과가 더욱 크게 나타났다. 또한, 백출의 효능이 cAMP 매개에 의한 멜라닌 합성 증가를 억제하는 것인지 다시 확인, 조사하기 위하여 2.
- 0 pM forsk이in과 백출을 농도별로 함께 처리하여 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성을 측정하였다. Fig. 6에서 보는 바와 같이, forskolin 처리시 대조군에 비하여 약 4 배의 멜라닌생성이 증가하였으나, 백출을 농도별로 처리한 실험군에서는 모두 억제효과를 나타내었으며, 억제정도는 a-MSH 처리군과 마찬가지로 forskolin 처리군에 백출을 처리한 실험군이 고유 멜라닌화의 억제보다 효과가 크게 나타났다. B16/F10 melanoma 세포의 고유한 멜라닌 생성과 외부자극에 의해 멜라닌 생성이 유도된 경우에 미치는 백출의 영향을 비교, 관찰하기 위하여 어떤 처리도 하지 않은 군과 a-MSH 및 forskolin으로 멜라닌 생성을 유도한 군에 20|ig/m/ 백출 추출물을 처리하여 백출 추출물의 억제효과를 비교하였다(Fig.
- After the treatment of Atractylodis Rhizoma alba for 48 h, melanin contents and tyrosinase activity were measured at 405 nm. Results were expressed as % control and data were mean ± SD of at least five determinations, esignificantly different from control group (*p< 0.01, **p<0.05).
- After 안le treatment otAtractylodis Rhizoma alba for 48 h, melanin contents and tyrosinase activity were measured at 405 nm. Results were expressed as % control and data were mean ± SD of at least five determinations, esignificantly different from control group *p< 0.01, **p<0.05).
- a-MSH와 forskoHn에 의한 멜라닌 생성에 미치는 백출의 영향 - 백출이 B16/F10 melanoma 세포의 고유 멜라닌 합성의 억제에 관여한다는 것을 Fig. 4의 결과를 통하여 알게 되었다. 이를 더욱 분명하게 확인하고 외부자극에 의해 유발되는 B16/F10 melanoma 세포의 과색소침착에 미치는 백출의 저해효과를 관찰하기 위하여 a-MSH와 forskolin으로 자극함과 동시에 백출 추출물을 다양한 농도로 처리하여 외부자극에 의한 멜라닌화에 미치는 백출의 영향을 관찰하였다.
- 20飓徊 백출을 단독 처리한 경우에는 대조군에 비하여 16%의 억제효과를 보였다. a-MSH와 백출 추출물을 동시에 처리한 실험군에서는 2.4 배 증가를 1.8 배로 억제시켜 약 40%의 더 큰 억제효과를 보였고, forskolin과 백출 추출물을 동시에 처리한 군에서는 3.1 배 증가를 2 배로 억제시켜 약 70%의 더 큰 억제효과를 보였다.
- 생성을 억제하는 것으로 사료된다. 동일 농도의 백출 처리에 의한 멜라닌 생성의 억제정도가 a-MSH와 forskolin正로 유도한 군에서 더 크게 나타나는 것으로 볼 때, 백출에 의한 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 억제효과는 cAMP 의존형 신호전달 경로인 PKA 반응경로와 관련이 있을 것으로 추정된다. 또한 백출추출물의 억제효과가 a-MSH나 forskolin 같은 외부자극에 의해 유도된 멜라닌화에 더 크게 나타나므-로 멜라닌 세포의 과색소침착을 보이는 병변에서 더 큰 억제효과가 있을 것으로 기대된다.
- 01). 백출 추출물을 세포에 처리했을 때 tyrosinase 활성도와 멜라닌 생성이 대조군에 비하여 모두 감소하는 경향을 보였다. 이것은 백출 추출물을 처리했을 때 B16/F10 melanoma 세포 내에서 tyrosinase가 비활성화되고 멜라닌 생성이 억제되는 것으로 해석된다.
- 이상의 결과를 종합해보면, 백출 추출물은 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 생성을 억제하며, oc-MSH와 forskolin으로 처리한 군에서 더 큰 억제효과가 나타나는 것으로 볼 때, cAMP의존형 신호전달 경로인 PKA반응경로와 관련이 있을 것으로 추정된다.
후속연구
- 동일 농도의 백출 처리에 의한 멜라닌 생성의 억제정도가 a-MSH와 forskolin正로 유도한 군에서 더 크게 나타나는 것으로 볼 때, 백출에 의한 B16/F10 melanoma 세포의 멜라닌 억제효과는 cAMP 의존형 신호전달 경로인 PKA 반응경로와 관련이 있을 것으로 추정된다. 또한 백출추출물의 억제효과가 a-MSH나 forskolin 같은 외부자극에 의해 유도된 멜라닌화에 더 크게 나타나므-로 멜라닌 세포의 과색소침착을 보이는 병변에서 더 큰 억제효과가 있을 것으로 기대된다.
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