[국내논문]폐암세포주에 대한 p53 및 $p16^{INK4a}$의 복합종양억제유전자요법의 효과 Enhanced Growth Inhibition by Combined Gene Transfer of p53 and $p16^{INK4a}$ in Adenoviral Vectors to Lung Cancer Cell Lines원문보기
배경 : 대표적인 종양억제유전자인 p53 및 p16은 세포주기 조절 및 자연괴멸 유도에서 서로 다른 역할을 하고 있으며 폐암에서는 동시에 비활성화 되어 있는 경우가 흔하다. 이 종양억제유전자들 동시에 이입시 서로 상호작용을 통해 효과가 증진되리라 기대되고 있다. 방법 : 본 연구에서는 p53 및 p16을 아데노바이러스벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologra을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다. 결과 : Isobologram을 이용한 분석에서 adeno-virus-p53와 adenovirus-p16의 복합투여는 NCI H358에서는 상승적인 성장억제를, NCI H23에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 p16의 복합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다. 결론 : 이러한 상승적인 p53 및 p16의 상호작용은 이 복합요법이 새로운 유전자치료법으로 발전할 수 있는 가능성을 보였다.
배경 : 대표적인 종양억제유전자인 p53 및 p16은 세포주기 조절 및 자연괴멸 유도에서 서로 다른 역할을 하고 있으며 폐암에서는 동시에 비활성화 되어 있는 경우가 흔하다. 이 종양억제유전자들 동시에 이입시 서로 상호작용을 통해 효과가 증진되리라 기대되고 있다. 방법 : 본 연구에서는 p53 및 p16을 아데노바이러스 벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologra을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다. 결과 : Isobologram을 이용한 분석에서 adeno-virus-p53와 adenovirus-p16의 복합투여는 NCI H358에서는 상승적인 성장억제를, NCI H23에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 p16의 복합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다. 결론 : 이러한 상승적인 p53 및 p16의 상호작용은 이 복합요법이 새로운 유전자치료법으로 발전할 수 있는 가능성을 보였다.
Background : Two tumor suppressor genes, p53 and p16, which have different roles in controlling the cell cycle and inducing apoptosis, are frequently inactivated during carcinogenesis including lung cancer. Single tumor suppressor gene therapies using either with p53 or p16 have been studied extensi...
Background : Two tumor suppressor genes, p53 and p16, which have different roles in controlling the cell cycle and inducing apoptosis, are frequently inactivated during carcinogenesis including lung cancer. Single tumor suppressor gene therapies using either with p53 or p16 have been studied extensively. However, there is a paucity of reports regarding a combined gene therapy using these two genes. Methods : The combined effect of p53 and p16 gene transfer by the adenoviral vector on the growth of lung cancer cell lines and its interactive mechanism was investigated. Results : An isobologram showed that the co-transduction of p53 and p16 exhibited a synergistic growth in hibitory effect on NCI H358 and an additive effect on NCI H23. Cell cycle analysis demonstrated the induction of a synergistic G1/S arrest by a combined p53 and p16 transfer. This synergistic interaction was again confirmed in a soft agar confirmed in a soft agar clonogenic assay. Conclusion : These observations suggest the potential of a p53 and p16 combination gene therapy as another potent strategy in cancer gene therapy.
Background : Two tumor suppressor genes, p53 and p16, which have different roles in controlling the cell cycle and inducing apoptosis, are frequently inactivated during carcinogenesis including lung cancer. Single tumor suppressor gene therapies using either with p53 or p16 have been studied extensively. However, there is a paucity of reports regarding a combined gene therapy using these two genes. Methods : The combined effect of p53 and p16 gene transfer by the adenoviral vector on the growth of lung cancer cell lines and its interactive mechanism was investigated. Results : An isobologram showed that the co-transduction of p53 and p16 exhibited a synergistic growth in hibitory effect on NCI H358 and an additive effect on NCI H23. Cell cycle analysis demonstrated the induction of a synergistic G1/S arrest by a combined p53 and p16 transfer. This synergistic interaction was again confirmed in a soft agar confirmed in a soft agar clonogenic assay. Conclusion : These observations suggest the potential of a p53 and p16 combination gene therapy as another potent strategy in cancer gene therapy.
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문제 정의
복합유전자요법에는 서로 완전히 기전이 다른 유전자를 복합하거나 서로 기전이 비슷한 유전자를 복합하는 방법이 있다. 본 연구에서는 서로 비슷한 기전을 가진 두 종류의 종양억제 유전자요법의 복합투여 효과를 연구하였다%
본 연구에서는 P53와 以6의 상호작용을 다른 각도 에서 연구하였다. p53에 의한 apoptosis의 유도와 간 접적인 G1/S 정지 및 pl6에 의한 G1/S 정지가 궁 극적으로 세포 성장의 억제를 유도하므로 두 종양억제 유전자의 상호 작용을 isobologram으로 측정하였다.
본 연구에서는 이러한 두 종양억제유전자의 작용을 이용하여 이 두 유전자를 동시에 암세포에 이입하고 그 복합효과를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
본 연구에서는 p53 및 pl6。] 모두 비활성화 된 폐 암세포주를 대상으로 아데노바이 러스를 이용하여 p53 및 pl6을 동시에 이입하여 세포성장억제에 대한 상호 작용을 isobologram을 이용하여 검증하고 세포주기 및 체외 종양형성능에 미치는 영향을 연구하였다.
enovirus-pl6은 본 연구실 에서 이미 제작되어 그, 효과를 보고하였다m”. 간단히 설명하면 p53 및 pl6의 eDNA의 전체 염기를 각각 아데노바이러스 제작용 아iiittk 벡터인 pAC CMVpLpA(미국 Texas Southwestern Medical Centere Rob쟜1% Gerard 교수로부터 제공 받음)의 pUC19 polyhnker■의 적당 제한효소 위치에 클로닝한 후 각각의 pAC CMV-p53 및 pAC CMVf16을 pJM17과 함께 인산칼슘침전방법으로 293 c国1에 이 입하고 세포독성 현상(cytopathic effect : CPE)이 나타나 재조합 아데노바이러스가 생산될 때까지 배양 하였다. 생산된 아데노바이러스는 plaque assay를 통해 순수분리 후 DNA 염기분석 및 Western blot 분석을 통해 성질을 확인하였다.
간단히 설명하면 p53 및 pl6의 eDNA의 전체 염기를 각각 아데노바이러스 제작용 아iiittk 벡터인 pAC CMVpLpA(미국 Texas Southwestern Medical Centere Rob쟜1% Gerard 교수로부터 제공 받음)의 pUC19 polyhnker■의 적당 제한효소 위치에 클로닝한 후 각각의 pAC CMV-p53 및 pAC CMVf16을 pJM17과 함께 인산칼슘침전방법으로 293 c国1에 이 입하고 세포독성 현상(cytopathic effect : CPE)이 나타나 재조합 아데노바이러스가 생산될 때까지 배양 하였다. 생산된 아데노바이러스는 plaque assay를 통해 순수분리 후 DNA 염기분석 및 Western blot 분석을 통해 성질을 확인하였다. 본 아데노바이러스는 E1 부위의 아데노바이러스 게놈이 소실되고 CMV promotor를 가진 스스로는 복제할 수 없는 아데노바 이러스이다.
NCI H358 및 NCI H23세포주를 20moi(multiplicity of infection)의 adenovirus-p53 및 adenovirus 로 1시간 동안 감염 후 감염 안된 바이러스를 제거 후 완전배지에서 48시간 동안 배양 후 단백질을 추출하였다. Western blot 분석은 Amersham사의 ECL system을 이용하여 시행하였다.
Adenorus-p53 혹은 을 NCI H358 및 NCI H23에 단독으로 투여 시 암세포의 성장에 미치는 영향을 알기 위해 96 well 배양판에 암세포를 5 xl03/w 曲로 분주 후 24시간 배양한 다음 ad쟝novirus~p53을 0, 1, 5, 10, 20, 50, 및 lOOmoi 로 1시간 동안 감염 후 완전배양액내에서 96시간 배 양 후 세포의 성장을 MTT assay 를 이용하여 측정하였다.
위의 두 종류의 폐암세포주를 각각 96 well 배양판에 well 당 5x15개의 세포를 분주한 후 24시간 후 adenovirus-p53^ 0, 5, 10, 20, 50, 75, 100 moi 로, adenovirus-pl6은 역시 0, 5, 10, 20, 50, 75 및 lOOmoi의 농도로 모두 adenovirus-p53 및 adeno- vinis叩16의 농도의 조합하에 well에 감염시켰다. 한 종류의 농도의 조합올 3 well에 실시하였다.
한 종류의 농도의 조합올 3 well에 실시하였다. 96시간 동안 5% COz 배양기에서 배양 후 세포의 농도를 MTT 분석을 통해 측정하였다. 암세포 성장에 대한 adenovirus-p53 및 adenovirus-p 16상호작용은 isobologram> 통해 분석하였다盘」气
96시간 동안 5% COz 배양기에서 배양 후 세포의 농도를 MTT 분석을 통해 측정하였다. 암세포 성장에 대한 adenovirus-p53 및 adenovirus-p 16상호작용은 isobologram> 통해 분석하였다盘」气
NCI H358 및 NCI H23세포주를 adenovirus-p53 (20moi)J adenovirus-p 16(20moi) 및 adenovirus -p53 (1 Omoi) + adenovirus-pl6 (1 Omoi) 세 군으 로 나누어 감염시킨 후 세포를 떼어낸 후 6 well 배양판*에 1% agarose underlay# 깔고 위에 0.2% agarose에 5x10, 개의 암세포를 섞은 후 분주한 다음 3주간 배양 후 125 이상의 콜로니를 즉정하여 체외 종양형성능을 측정하였다弋
본 연구에서는 P53와 以6의 상호작용을 다른 각도 에서 연구하였다. p53에 의한 apoptosis의 유도와 간 접적인 G1/S 정지 및 pl6에 의한 G1/S 정지가 궁 극적으로 세포 성장의 억제를 유도하므로 두 종양억제 유전자의 상호 작용을 isobologram으로 측정하였다. Isobologram 은 우사한 효과믈 나타내는 두 종류의 약 제를 복합 사용시 상호작용을 검증하는 방법으로 약제 를 단독 투여시의 약제농도-반응곡선에서 복합투여시 반응을 추론하여 상호작용을 측정하는 방법이다"T5.
본 연구에서는 p53 및 pl6을 아데노바이러스 벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용 을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologram을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주 기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다.
본 연구에서는 p53 및 pl6을 아데노바이러스 벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용 을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologram을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주 기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다.
대상 데이터
NCI H358 및 NCI H23의 두 종류의 인체 비소세포 폐암세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다.
은 p53에 점돌연변이가 있는 세포주이다. 세포는 5% CO2 배양기내에서 10% 우태혈청을 포함한 RPMI1640 배 양액에서 배양하였다.
고농도의 아데노바이러스 농축액은 CsCl 초원심분리법을 이용하여 준비되었다技. 대조 아데노 바이러스로 adenovirus-fi-gal 혹은 adenovirus- m出을 사용하였다.
이론/모형
본 아데노바이러스는 E1 부위의 아데노바이러스 게놈이 소실되고 CMV promotor를 가진 스스로는 복제할 수 없는 아데노바 이러스이다. 고농도의 아데노바이러스 농축액은 CsCl 초원심분리법을 이용하여 준비되었다技. 대조 아데노 바이러스로 adenovirus-fi-gal 혹은 adenovirus- m出을 사용하였다.
세포주를 20moi(multiplicity of infection)의 adenovirus-p53 및 adenovirus 로 1시간 동안 감염 후 감염 안된 바이러스를 제거 후 완전배지에서 48시간 동안 배양 후 단백질을 추출하였다. Western blot 분석은 Amersham사의 ECL system을 이용하여 시행하였다.
성능/효과
Adenovirus-p53 및 adenovirus™pl6 단독 人] 두 폐암세포주에서 투여 농도에 비례하여 성장이 억제 됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
Adenoviruszp53와 adenovirus-pl6 상호 작용 을 알기 위해 0, 1, 5, 10, 10, 50, 100moi의 농도의 모든 조합으로 두 바이러스를 투여 후 세포의 성장을 MTT 방법으로 측정한 상호 작용을 isobologram< 이용하여 분석한 결과 NCI H358에서는 상승작용 (synergistic)을, NCI H23에서는 부가적 작용 (additiveX 확인할 수 있었다(Fig. 3).
유세포분석기를 DNA histogram에서 두 세포주 모 두에서 adenovirus-pl6은 adenovirus-p53 보다는 더 강력한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- pl.
유세포분석기를 DNA histogram에서 두 세포주 모 두에서 adenovirus-pl6은 adenovirus-p53 보다는 더 강력한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- pl.6과 adgoviru$ip53틀 동시에 각각 10moi스식 투여한 경우는 adenovirus~p53 (20moi) 나 adeno- virus-pl6(20moi)< 단독으로 투여한 경우보다 약간 강한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- p53에 비해 adenovirus-pl6세포주기억제 효과가 현저한 점으로 보아 aderioviriis-p53(10rnoi) 와 adeiRvirus-pl6(10moi)를 복합투여한 경우가 ade* novirus~pl6(20moi) 단독 투여한 경우보다 G1/S 억제가 강력한 점은 서로간의 상승작용을 의미한다.
체외종양형성 능력의 변화를 알기 위해 시행한 soft agar clonogenic g的에서 ad쟝noving~p53(20moi)및 ^如如^讣淄-皿故即口凶)으로 처리한 폐암세포주는 종양형성 능력이 현저 허 감소하였고 adenovirus- p53(10moi) 및 adenoviE¥pl6(10moi)를 동시에 투여한 경우 단독 투여시보다 더 강력한 억제현상을 관찰할 수 있었다(Table 1).
p53는 앞에서 설명한대로 손상을 받은 세포에 apoptosis 를 유도하거나 p21WAFa] 유도를 통한 G1/ S 정지를 간접적으로 일으킨다" p2iw財는 WAF family에 속하는 세포주기억제인자이며 pl6은 INK4 family의 대표적인 세포주기억제인자로 이 둘이 복합 적으로 작용시 세포주기의 진행을 여러 단계에서 억제 할 수 있어 더 효율적일 것이라고 생 각된다μ 区. 본 연구의 결과에서도 adenovirus-p53(20moi) 이나 ade- novirus-16(20moi)을 단독투여시 유도되는 G1/S arrest 보다 adenovirus-p53 (lOmoi) 및 adeno- virus-pl6(10moi)를 동시에 투여한 경우의 G1/S arrest가 더 현저하였다. 특히 주된 작备이 G1/S arrest인 adenovirus-pl6을 20moi의 농도로 투여 한 것보다 adenovirus-pl6을 lOmoi만 사용하고 adenovirus-p53을 lOmoi만 사용하여 총 adeno- virus의 용량을 20mo로 같이 한 경우가 동등하거나 더 강력한 효과를 보인 점은 p53와 pl6의 상호작용 이 상승적으로 일어났음을 의미한다.
Isobologram 은 우사한 효과믈 나타내는 두 종류의 약 제를 복합 사용시 상호작용을 검증하는 방법으로 약제 를 단독 투여시의 약제농도-반응곡선에서 복합투여시 반응을 추론하여 상호작용을 측정하는 방법이다"T5. 본 연구에서는 p53 및 pl6의 활성이 억제되어 있는 두 폐암세포주를 대상으로 검사한 결과 NCI H358에 서는 상승작용을, NCI H23에서는 부가적 작용을 보 임을 관찰할 수 있어 P53 및 pl6의 복합투여의 이 론적 타당성을 검증할 수 있었다.
이러한 세포성장 억제 및 세포주기 억제에서의 상호 작용은 soft agar clonogenic assay를 통한 체외 종 양형성능 검사에서도 증명되었다. 즉 adenovirus- p53(lOmoi) 및 adenovirus-pl6(1 Omoi)2] 복합투 여가 20moi의 adenovirus-p53 혹은 adenovirus- P16의 단독 투여보다 강력한 종양형성능력의 억제를 보였다.
Isobologram을 이용한 분석에서 adeno-virus-p53 와 adenovirus-pl6의 복합투여는 NCI H358에서는 상승적인 성장억제를, NCI H23에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 pl6의 복 합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다.
에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 pl6의 복 합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다.
이러한 상승적인 p53 및 pl6의 상호작용은 이 복합 요.법이 새로운 유전자치료법으로 발전할 수 있는 가능성을 보였다.
후속연구
체외에서 폐암세포주를 이용한 검사라는 제한점은 있으나 이상의 결과는 두 종류의 종양억제유전자를 이 두 종류의 유전자 기능이 소실된 암세포에 투여함으로 써 세포주기 억제 및 암세포의 성장을 억제하는 상승 또는 부가적인 효과를 보여 우수한 전임상 결과에도 불구하고 임상연구에서 한계를 보이고 있는 p53 단독 종양억제유전자 요법河, ”의 새로운 돌파구가 될 가능성을 보여 주었다. 특히 비소세포폐암에서 p53 및 pl6의 종양억제유전자의 기능이 동시에 소실되어 있는 경우가 많아 이 복합유전자요법의 좋은 대상이 되 리라 생각된다.
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