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문제 정의
- 복합유전자요법에는 서로 완전히 기전이 다른 유전자를 복합하거나 서로 기전이 비슷한 유전자를 복합하는 방법이 있다. 본 연구에서는 서로 비슷한 기전을 가진 두 종류의 종양억제 유전자요법의 복합투여 효과를 연구하였다%
- 본 연구에서는 P53와 以6의 상호작용을 다른 각도 에서 연구하였다. p53에 의한 apoptosis의 유도와 간 접적인 G1/S 정지 및 pl6에 의한 G1/S 정지가 궁 극적으로 세포 성장의 억제를 유도하므로 두 종양억제 유전자의 상호 작용을 isobologram으로 측정하였다.
- 본 연구에서는 이러한 두 종양억제유전자의 작용을 이용하여 이 두 유전자를 동시에 암세포에 이입하고 그 복합효과를 관찰하고자 하였다.
제안 방법
- 본 연구에서는 p53 및 pl6。] 모두 비활성화 된 폐 암세포주를 대상으로 아데노바이 러스를 이용하여 p53 및 pl6을 동시에 이입하여 세포성장억제에 대한 상호 작용을 isobologram을 이용하여 검증하고 세포주기 및 체외 종양형성능에 미치는 영향을 연구하였다.
- enovirus-pl6은 본 연구실 에서 이미 제작되어 그, 효과를 보고하였다m”. 간단히 설명하면 p53 및 pl6의 eDNA의 전체 염기를 각각 아데노바이러스 제작용 아iiittk 벡터인 pAC CMVpLpA(미국 Texas Southwestern Medical Centere Rob쟜1% Gerard 교수로부터 제공 받음)의 pUC19 polyhnker■의 적당 제한효소 위치에 클로닝한 후 각각의 pAC CMV-p53 및 pAC CMVf16을 pJM17과 함께 인산칼슘침전방법으로 293 c国1에 이 입하고 세포독성 현상(cytopathic effect : CPE)이 나타나 재조합 아데노바이러스가 생산될 때까지 배양 하였다. 생산된 아데노바이러스는 plaque assay를 통해 순수분리 후 DNA 염기분석 및 Western blot 분석을 통해 성질을 확인하였다.
- 간단히 설명하면 p53 및 pl6의 eDNA의 전체 염기를 각각 아데노바이러스 제작용 아iiittk 벡터인 pAC CMVpLpA(미국 Texas Southwestern Medical Centere Rob쟜1% Gerard 교수로부터 제공 받음)의 pUC19 polyhnker■의 적당 제한효소 위치에 클로닝한 후 각각의 pAC CMV-p53 및 pAC CMVf16을 pJM17과 함께 인산칼슘침전방법으로 293 c国1에 이 입하고 세포독성 현상(cytopathic effect : CPE)이 나타나 재조합 아데노바이러스가 생산될 때까지 배양 하였다. 생산된 아데노바이러스는 plaque assay를 통해 순수분리 후 DNA 염기분석 및 Western blot 분석을 통해 성질을 확인하였다. 본 아데노바이러스는 E1 부위의 아데노바이러스 게놈이 소실되고 CMV promotor를 가진 스스로는 복제할 수 없는 아데노바 이러스이다.
- NCI H358 및 NCI H23세포주를 20moi(multiplicity of infection)의 adenovirus-p53 및 adenovirus 로 1시간 동안 감염 후 감염 안된 바이러스를 제거 후 완전배지에서 48시간 동안 배양 후 단백질을 추출하였다. Western blot 분석은 Amersham사의 ECL system을 이용하여 시행하였다.
- Adenorus-p53 혹은 을 NCI H358 및 NCI H23에 단독으로 투여 시 암세포의 성장에 미치는 영향을 알기 위해 96 well 배양판에 암세포를 5 xl03/w 曲로 분주 후 24시간 배양한 다음 ad쟝novirus~p53을 0, 1, 5, 10, 20, 50, 및 lOOmoi 로 1시간 동안 감염 후 완전배양액내에서 96시간 배 양 후 세포의 성장을 MTT assay 를 이용하여 측정하였다.
- 위의 두 종류의 폐암세포주를 각각 96 well 배양판에 well 당 5x15개의 세포를 분주한 후 24시간 후 adenovirus-p53^ 0, 5, 10, 20, 50, 75, 100 moi 로, adenovirus-pl6은 역시 0, 5, 10, 20, 50, 75 및 lOOmoi의 농도로 모두 adenovirus-p53 및 adeno- vinis叩16의 농도의 조합하에 well에 감염시켰다. 한 종류의 농도의 조합올 3 well에 실시하였다.
- 한 종류의 농도의 조합올 3 well에 실시하였다. 96시간 동안 5% COz 배양기에서 배양 후 세포의 농도를 MTT 분석을 통해 측정하였다. 암세포 성장에 대한 adenovirus-p53 및 adenovirus-p 16상호작용은 isobologram> 통해 분석하였다盘」气
- 96시간 동안 5% COz 배양기에서 배양 후 세포의 농도를 MTT 분석을 통해 측정하였다. 암세포 성장에 대한 adenovirus-p53 및 adenovirus-p 16상호작용은 isobologram> 통해 분석하였다盘」气
- NCI H358 및 NCI H23세포주를 adenovirus-p53 (20moi)J adenovirus-p 16(20moi) 및 adenovirus -p53 (1 Omoi) + adenovirus-pl6 (1 Omoi) 세 군으 로 나누어 감염시킨 후 세포를 떼어낸 후 6 well 배양판*에 1% agarose underlay# 깔고 위에 0.2% agarose에 5x10, 개의 암세포를 섞은 후 분주한 다음 3주간 배양 후 125 이상의 콜로니를 즉정하여 체외 종양형성능을 측정하였다弋
- 본 연구에서는 P53와 以6의 상호작용을 다른 각도 에서 연구하였다. p53에 의한 apoptosis의 유도와 간 접적인 G1/S 정지 및 pl6에 의한 G1/S 정지가 궁 극적으로 세포 성장의 억제를 유도하므로 두 종양억제 유전자의 상호 작용을 isobologram으로 측정하였다. Isobologram 은 우사한 효과믈 나타내는 두 종류의 약 제를 복합 사용시 상호작용을 검증하는 방법으로 약제 를 단독 투여시의 약제농도-반응곡선에서 복합투여시 반응을 추론하여 상호작용을 측정하는 방법이다"T5.
- 본 연구에서는 p53 및 pl6을 아데노바이러스 벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용 을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologram을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주 기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다.
- 본 연구에서는 p53 및 pl6을 아데노바이러스 벡터를 이용하여 폐암세포주에 동시에 이입하여 그 상호작용 을 관찰하였다. 복합투여시 세포성장곡선을 분석하여 isobologram을 이용한 상호작용을 검증하고 세포주 기의 변화 및 체외종양형성능의 변화도 관찰하였다.
대상 데이터
- NCI H358 및 NCI H23의 두 종류의 인체 비소세포 폐암세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 구입하였다.
- 은 p53에 점돌연변이가 있는 세포주이다. 세포는 5% CO2 배양기내에서 10% 우태혈청을 포함한 RPMI1640 배 양액에서 배양하였다.
- 고농도의 아데노바이러스 농축액은 CsCl 초원심분리법을 이용하여 준비되었다技. 대조 아데노 바이러스로 adenovirus-fi-gal 혹은 adenovirus- m出을 사용하였다.
이론/모형
- 본 아데노바이러스는 E1 부위의 아데노바이러스 게놈이 소실되고 CMV promotor를 가진 스스로는 복제할 수 없는 아데노바 이러스이다. 고농도의 아데노바이러스 농축액은 CsCl 초원심분리법을 이용하여 준비되었다技. 대조 아데노 바이러스로 adenovirus-fi-gal 혹은 adenovirus- m出을 사용하였다.
- 세포주를 20moi(multiplicity of infection)의 adenovirus-p53 및 adenovirus 로 1시간 동안 감염 후 감염 안된 바이러스를 제거 후 완전배지에서 48시간 동안 배양 후 단백질을 추출하였다. Western blot 분석은 Amersham사의 ECL system을 이용하여 시행하였다.
성능/효과
- Adenovirus-p53 및 adenovirus™pl6 단독 人] 두 폐암세포주에서 투여 농도에 비례하여 성장이 억제 됨을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- Adenoviruszp53와 adenovirus-pl6 상호 작용 을 알기 위해 0, 1, 5, 10, 10, 50, 100moi의 농도의 모든 조합으로 두 바이러스를 투여 후 세포의 성장을 MTT 방법으로 측정한 상호 작용을 isobologram< 이용하여 분석한 결과 NCI H358에서는 상승작용 (synergistic)을, NCI H23에서는 부가적 작용 (additiveX 확인할 수 있었다(Fig. 3).
- 유세포분석기를 DNA histogram에서 두 세포주 모 두에서 adenovirus-pl6은 adenovirus-p53 보다는 더 강력한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- pl.
- 유세포분석기를 DNA histogram에서 두 세포주 모 두에서 adenovirus-pl6은 adenovirus-p53 보다는 더 강력한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- pl.6과 adgoviru$ip53틀 동시에 각각 10moi스식 투여한 경우는 adenovirus~p53 (20moi) 나 adeno- virus-pl6(20moi)< 단독으로 투여한 경우보다 약간 강한 G1/S 억제현상을 보였다. Adenovirus- p53에 비해 adenovirus-pl6세포주기억제 효과가 현저한 점으로 보아 aderioviriis-p53(10rnoi) 와 adeiRvirus-pl6(10moi)를 복합투여한 경우가 ade* novirus~pl6(20moi) 단독 투여한 경우보다 G1/S 억제가 강력한 점은 서로간의 상승작용을 의미한다.
- 체외종양형성 능력의 변화를 알기 위해 시행한 soft agar clonogenic g的에서 ad쟝noving~p53(20moi)및 ^如如^讣淄-皿故即口凶)으로 처리한 폐암세포주는 종양형성 능력이 현저 허 감소하였고 adenovirus- p53(10moi) 및 adenoviE¥pl6(10moi)를 동시에 투여한 경우 단독 투여시보다 더 강력한 억제현상을 관찰할 수 있었다(Table 1).
- p53는 앞에서 설명한대로 손상을 받은 세포에 apoptosis 를 유도하거나 p21WAFa] 유도를 통한 G1/ S 정지를 간접적으로 일으킨다" p2iw財는 WAF family에 속하는 세포주기억제인자이며 pl6은 INK4 family의 대표적인 세포주기억제인자로 이 둘이 복합 적으로 작용시 세포주기의 진행을 여러 단계에서 억제 할 수 있어 더 효율적일 것이라고 생 각된다μ 区. 본 연구의 결과에서도 adenovirus-p53(20moi) 이나 ade- novirus-16(20moi)을 단독투여시 유도되는 G1/S arrest 보다 adenovirus-p53 (lOmoi) 및 adeno- virus-pl6(10moi)를 동시에 투여한 경우의 G1/S arrest가 더 현저하였다. 특히 주된 작备이 G1/S arrest인 adenovirus-pl6을 20moi의 농도로 투여 한 것보다 adenovirus-pl6을 lOmoi만 사용하고 adenovirus-p53을 lOmoi만 사용하여 총 adeno- virus의 용량을 20mo로 같이 한 경우가 동등하거나 더 강력한 효과를 보인 점은 p53와 pl6의 상호작용 이 상승적으로 일어났음을 의미한다.
- Isobologram 은 우사한 효과믈 나타내는 두 종류의 약 제를 복합 사용시 상호작용을 검증하는 방법으로 약제 를 단독 투여시의 약제농도-반응곡선에서 복합투여시 반응을 추론하여 상호작용을 측정하는 방법이다"T5. 본 연구에서는 p53 및 pl6의 활성이 억제되어 있는 두 폐암세포주를 대상으로 검사한 결과 NCI H358에 서는 상승작용을, NCI H23에서는 부가적 작용을 보 임을 관찰할 수 있어 P53 및 pl6의 복합투여의 이 론적 타당성을 검증할 수 있었다.
- 이러한 세포성장 억제 및 세포주기 억제에서의 상호 작용은 soft agar clonogenic assay를 통한 체외 종 양형성능 검사에서도 증명되었다. 즉 adenovirus- p53(lOmoi) 및 adenovirus-pl6(1 Omoi)2] 복합투 여가 20moi의 adenovirus-p53 혹은 adenovirus- P16의 단독 투여보다 강력한 종양형성능력의 억제를 보였다.
- Isobologram을 이용한 분석에서 adeno-virus-p53 와 adenovirus-pl6의 복합투여는 NCI H358에서는 상승적인 성장억제를, NCI H23에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 pl6의 복 합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다.
- 에서는 부가적인 성장 억제를 보였다. 유세포분석기를 이용한 세포주기의 분석 및 체외종양형성능 검사에서도 p53 및 pl6의 복 합투여시 단독 투여보다 강한 억제효과를 보였다.
- 이러한 상승적인 p53 및 pl6의 상호작용은 이 복합 요.법이 새로운 유전자치료법으로 발전할 수 있는 가능성을 보였다.
후속연구
- 체외에서 폐암세포주를 이용한 검사라는 제한점은 있으나 이상의 결과는 두 종류의 종양억제유전자를 이 두 종류의 유전자 기능이 소실된 암세포에 투여함으로 써 세포주기 억제 및 암세포의 성장을 억제하는 상승 또는 부가적인 효과를 보여 우수한 전임상 결과에도 불구하고 임상연구에서 한계를 보이고 있는 p53 단독 종양억제유전자 요법河, ”의 새로운 돌파구가 될 가능성을 보여 주었다. 특히 비소세포폐암에서 p53 및 pl6의 종양억제유전자의 기능이 동시에 소실되어 있는 경우가 많아 이 복합유전자요법의 좋은 대상이 되 리라 생각된다.
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