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문제 정의
- 이에 본 실험에서는 제주도에 자생하고 있는 손바닥 선인장의 열매 및 줄기 추출물의 생리활성을 확인하여 의약품 내지 건강보조제의 개발을 목적으로 대사성 질환에 대한 치료 및 예방효과 검색의 일환으로 전보7)에 이어 식이성 고지혈증 model에 미치는 영향을 검토하였다.
제안 방법
- Plasma clotting time - Bama와 Triplett저의 방법에 따라 플라스틱 시험관을 37℃의 수욕에 담그고 혈장 100 μl, saline(0.15M NaCl) 100 gZ, 25 mM CaCl2 100μl를 가하고 섞은 후 가만히 흔들어 주면서 CaCl2를 가한 후부터 혈장이 응고하기까지의 시간을 측정하였다.
- 제공받아 사용하였다. 시료의 투여는 식이성 고지혈증을 유도한 후 마지막 주 7일 동안 손바닥선인장 추출물을 소량의 DMSO에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 투여용량을 조정하고 needle zonde를 사용하여 하루에 한 번씩 경구투여 하였다.
- 식이성 고지혈증의 유발 - 식이성 고지혈증 상태는 1%의 cholesterol과 0.5% Na-cholic acid를 함유한 사료(Table Ⅰ)로 4주간 사육함으로써 유도하였다.
- time을 측정하였다. 측정 후 CO2로 가볍게 마취시키고 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였고 간장은 0.9% 생리식염수로 관류시켜 조직 내 혈액을 제거하고 간장, 폐, 뇌, 신장, 비장, 심장을 적출하여 생리식염수에 씻은 후 여지로 가볍게 압박하여 남아 있는 혈액 및 생리식염수를 제거하였다. 채취한 혈액의 일부는 실온에서 30분간 방치한 후 3,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 혈청을 분리하고 지질함량의 측정, lipid peroxide, hydroxyl radical 함량 및 superoxide dismutase 활성의 즉정에 사용하였고 나머지는 3.
- 효소원의 조제 - 시료 투여가 끝난 실험동물에 sodium phenobarbital 200 ㎎/㎏을 복강주사하여 마취 시 킨 후 bleeding time을 측정하였다. 측정 후 CO2로 가볍게 마취시키고 복부 대동맥으로부터 혈액을 채취하였고 간장은 0.
대상 데이터
- 시료 및 투여 - 제주 산 손바닥선인장 줄기 및 열매를 동결건조한 가루를 북제주군농업기술 센터(제주도 북제주군 애월읍)에서 제공받아 사용하였다. 시료의 투여는 식이성 고지혈증을 유도한 후 마지막 주 7일 동안 손바닥선인장 추출물을 소량의 DMSO에 용해한 후 생리식염수로 희석하여 투여용량을 조정하고 needle zonde를 사용하여 하루에 한 번씩 경구투여 하였다.
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실험방법
실험동물 및 시약 - 한국실험동물개발의 Sprague-Dawley 계 흰쥐(체중 150 g 내외)를 일정한 조건(온도: 24±2℃, 습도: 55~60%, 명암: 12시간 주/야)으로 1주일 이상 적응시킨 후 본 실험에 사용하였다. 시약은 chlolesterol(Wako Pure Chemical Ind.
데이터처리
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2.
2Values are expressed as mean±S.D. of six experiments, and values sharing die same superscripts are not significantly different each other(p<0.05) by Duncan's multiple range test
. - 2. Values are expressed as mean±S.D. of six experiments, and values sharing the same superscripts are not significantly different each other(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 2. Values are expressed as mean±S.D. of six experiments, and values sharing the same superscripts are not significantly different each other(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- 2. Values are expressed as mean±S.D. of six experiments, and values sharing the same superscripts are not significantly different each other(p<0.05) by Duncan's multiple range test.
- V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준 편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
이론/모형
- 3-Hydroxyl-3-methylglutaryl(HMG)-CoA reductase 활성 - Kleinsek 등26)의 방법에 준하여 240nm에서 흡광도의 변화를 측정하고 분자흡광계수 6.22 mM-1 · cm-1을 이용하여 활성도를 산정하였다. 효소 활성의 단위는 1분당 1mg 의 protein이 분해하는 NADPH의 양을 pmole로 표시하였다.
- Bleeding time - 한 등8)의 방법에 의하여 마취된 실험동물을 꼬리 끝에서 0.3 cm 자른 후 곧 37.5℃ saline 용액에 꼬리를 5 cm 담그고 지혈될 때까지의 시간을 측정하였다.
- Lipase 활성 - Tietz와 Fiereck18)의 방법에 준하여 시판 kit 사용하여 측정하고 활성은 다음 식에 의하여 산출하였다.
- TF 활성 - Quick 등9)과 Surprenant 등25)의 방법에 준하여 standard cuwve를 얻고 이 graph에서 50% TF activity가 되는 TF의 양을 1 unit로 정하여 tissue factor 활성을 표시하였다.
- 간조직 성분 - 간장 일정 량에 3배 량의 0.9% NaCl 용액을 첨가하여 마쇄한 후 Folch 등22)의 방법에 따라 총 지질을 추출하였다. 총 지질 및 triglyceride의 함량은 시판 효소측정용 kit를 사용하였고, 총 콜레스테롤 함량은 Ichida23)의 방법에 따라 측정하였다.
- 인지질 함량은 Chen 등11)의 방법에 따라, 총지질 함량은 Frings와 Dunn12) 의 방법에 따라, 총콜레스테롤 함량은 Richmond13), 의 효소법에 의하여 시판 kit를 사용하여 흡광도법(500nm)으로 측정하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 고밀도 지질 콜레스테롤(HDL-cholesterol) 함량은 Noma 등14,15) 의 효소법에 따라 시판 kit를 사용하여 측정 (500 nm)하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 저밀도 지질 콜레스테롤(LDL-cholesterol) 함량 Fridewald 등16)의 방법에 따라 측정하였고 동맥경화지수(AI)는 Haglund 등17)의 방법에 따라 다음의 식으로 계산하였다.
- 이후 간 조직은 mitochondria 분획과 microsome 분획을 얻어 효소원으로 사용하였다. 뇌와 폐 조직은 Quick 등9)의 방법에 따라 제조하여 tissue factor(TF) crude solution으로 사용하였다.
- 단백질정량 및 통계처리 - 단백질의 함량은 Lowiy 등27)의 방법에 준하여 bovine serum albumin(Sigma, Fr. V)을 표준품으로 하여 측정하였다. 본 실험에서 얻어진 결과는 평균치±표준 편차로 표시하였고, 통계적 유의성 검증은 Duncan's multiple range test를 이용하였다.
- 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 인지질 함량은 Chen 등11)의 방법에 따라, 총지질 함량은 Frings와 Dunn12) 의 방법에 따라, 총콜레스테롤 함량은 Richmond13), 의 효소법에 의하여 시판 kit를 사용하여 흡광도법(500nm)으로 측정하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 고밀도 지질 콜레스테롤(HDL-cholesterol) 함량은 Noma 등14,15) 의 효소법에 따라 시판 kit를 사용하여 측정 (500 nm)하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다.
- 고밀도 지질 콜레스테롤(HDL-cholesterol) 함량은 Noma 등14,15) 의 효소법에 따라 시판 kit를 사용하여 측정 (500 nm)하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 저밀도 지질 콜레스테롤(LDL-cholesterol) 함량 Fridewald 등16)의 방법에 따라 측정하였고 동맥경화지수(AI)는 Haglund 등17)의 방법에 따라 다음의 식으로 계산하였다.
- 9% NaCl 용액을 첨가하여 마쇄한 후 Folch 등22)의 방법에 따라 총 지질을 추출하였다. 총 지질 및 triglyceride의 함량은 시판 효소측정용 kit를 사용하였고, 총 콜레스테롤 함량은 Ichida23)의 방법에 따라 측정하였다.
- 혈중 Hydroxyl radical 생성량 - Kobatake 등20)의 방법에 따라 흡광도(532 nm)를 측정하고 표준검량선에 의하여 hydroxyl radical(nmole/mg protein)의 함량을 정량하였다. 혈중 Superoxide dismutase(SOD) 활성 - Oyanagui21)의 방법에 따라 흡광도(550 nm)를 측정하고 표준검량선에 준하여 혈청 중의 SOD 활성을 측정하였다.
- 혈중 Lipid peroxide 함량 - Yagi 등19)의 방법에 따라 spectrofluorometer# 사용하여(Ex: 515 nm, Em: 553 nm) 흡광도를 측정하고 표준곡선에서 그 함량을 혈청 1 ml당 malondialdehyde의 nmole로 표시하였다.
- 량하였다. 혈중 Superoxide dismutase(SOD) 활성 - Oyanagui21)의 방법에 따라 흡광도(550 nm)를 측정하고 표준검량선에 준하여 혈청 중의 SOD 활성을 측정하였다.
- 혈청 중 지질함량 - Triglyceride 함량은 McGowan 등10) 의 방법에 준하여 시판 kit를 사용하여 측정(550 nm)하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다. 인지질 함량은 Chen 등11)의 방법에 따라, 총지질 함량은 Frings와 Dunn12) 의 방법에 따라, 총콜레스테롤 함량은 Richmond13), 의 효소법에 의하여 시판 kit를 사용하여 흡광도법(500nm)으로 측정하고 검량선에 준해 그 함량을 mg/dl로 표시하였다.
성능/효과
- 간장 중 지질 함량에 미치는 영향 - 고지혈증을 유발시킨 흰쥐에 시료를 투여하고 간장 중 총지질, 총콜레스테롤, 중성지방의 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 성적은 Table Ⅵ에 나타난 바와 같다. 간장 중 총지질 및 총 cholesterol의 함량은 정상군에 비해 고지혈증의 유도로 각각 약 2.5배 및 3.5배정도 증가되던 것이 시료의 투여로서 감소되었다. 한편 간조직 중 중성지질의 함량은 고지방식이의 투여로 증가되던 것이 증가되었으나 시료의 투여로 인한 효과는 나타나지 않았다.
- 성적이 Table Ⅴ이다. 고지혈증 유도군이 106.7±31.90 초로 정상군의 237.3± 30.20 초에 비해 약 45%정도 감소하던 것이 시료의 투여로서 clotting time이 증가되었다.
- 결과는 Figure 1에 나타난 바와 같다. 그림에서 보는 바와 같이 고지방식이의 투여로서 정상동물보다 체중이 급속히 증가하던 것이 시료를 7일간 100, 250, 500㎎/㎏의 처리로 체중의 급속한 증가가 둔화되었다.
- 식이성고지혈증의 유발로 대조군에 비해 현저히 감소된 bleeding timee 고지혈증으로 유도된 TF의 활성에 기인한 것으로 생각되며 손바닥선인장 추출물의 처리로 다소 연장된 bleeding timee tissue factor의 활성 조절과 관련된 것으로 생각된다. 따라서 손바닥 선인장의 투여가 실험실적으로 고지혈증을 유도시 과산화지질의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다는 사실은 지질 과산화의 생성 및 제거효소를 조절함으로써 나타나는 결과 및 혈중의 지질 성분의 변동에 의하여 나타나는 것이 아닌가 생각된다.
- 있다. 본 연구에서 식이성 고지혈증을 유발시킨 후 손바닥선인장을 처리한 흰쥐의 혈중 hydroxy radical의 생성과 superoxide dismutase (SOD)의 활성을 즉정하였던 바 고지혈증의 유발로서 hydroxy radical의 생성은 증가되던 것이 손바닥선인장 추출물의 투여로 감소되었으며 생체 이물질로 인하여 생성된 superoxide anion을 H2O2로 전환시키는 효소로서 생체 내 해독 체계중의 하나인 SOD의 활성은 오히려 감소하던 것이 증가되었다. 한편, 간장 및 혈중 과산화지질의 함량도 고지혈증 유도로서 증가되던 것이 손바닥 선인장 추출물의 투여로서 감소되었다.
- Table Ⅲ이다. 식이성 고지혈증 유도시 총콜레스테롤의 함량에서 정상군에 비하여 현저히 증가되던 것이 시료의 처리로 정상군의 수준에는 미치지 못하지만 고지혈증 유도 군에 비해 감소하였다. 혈청 HDL-cholsterol 함량에서는 고지혈증의 유도로 정상군보다 약 37% 정도 감소되던 것이 시료 처리군에서는 고지혈증 유도군과 비교할 때 증가하는 경향을 나타내었으며, LDL-cholesterol의 함량은 고지혈증의 유도로 현저히 증가되던 것이 시료의 투여로 감소되었다.
- 결과를 Figure 2에 나타내었다. 식이성 고지혈증의 유도로서 정상군의 뇌 및 폐에서의 tissue factor의 활성이 약 2배정도 증가되었으나 시료의 투여로서 용량별로 식이성 고지혈증의 상태의 활성은 다소 감소되는 경향을 보였다. 간장 중 지질 함량에 미치는 영향 - 고지혈증을 유발시킨 흰쥐에 시료를 투여하고 간장 중 총지질, 총콜레스테롤, 중성지방의 함량 변화에 미치는 영향을 관찰한 성적은 Table Ⅵ에 나타난 바와 같다.
- 이상의 실험결과를 종합하여 볼 때 손바닥선인장 추출물의 실험실적 고지혈증의 개선 효과는 체내 지질의 합성 및 분해에 관여하는 것이 아니라 지질의 생체 내 흡수 및 배설에 관여하여 나타나는 결과인 것으로 사료된다.
- dismutase(SOD)의 활성을 관찰한 성적이 Table Ⅳ이다. 정상군에 비하여 식이성 고지혈증을 유도하므로서 혈중 지질과산화 및 hydroxy radical의 생성은 현저히 증가되었으나 SOD의 활성은 감소되던 것이 시료를 1주일간 투여하므로서 혈중의 지질과산화의 함량 및 hydroxy radical의 활성이 감소되었으며, SOD의 활성은 증가되었다.
- 한편 bleeding time에 미치는 영향에서 식이성 고지혈증 군의 bleeding timee 113.2초로 정상군의 268.4초에 비해 약 2배정도 감소되었으며, 손바닥선인장 열매 및 줄기 투여군에서는 유의적으로 bleeding time이 용량의존적으로 연장되었다.
- 혈청 HDL-cholsterol 함량에서는 고지혈증의 유도로 정상군보다 약 37% 정도 감소되던 것이 시료 처리군에서는 고지혈증 유도군과 비교할 때 증가하는 경향을 나타내었으며, LDL-cholesterol의 함량은 고지혈증의 유도로 현저히 증가되던 것이 시료의 투여로 감소되었다. 한편 동맥경화지수도 식이성고지혈증의 유도로 정상군에 비해 약 10배정도 현저히 증가되던 것이 시료의 처리로 감소하였다.
- 식이성 고지혈증 유도시 총콜레스테롤의 함량에서 정상군에 비하여 현저히 증가되던 것이 시료의 처리로 정상군의 수준에는 미치지 못하지만 고지혈증 유도 군에 비해 감소하였다. 혈청 HDL-cholsterol 함량에서는 고지혈증의 유도로 정상군보다 약 37% 정도 감소되던 것이 시료 처리군에서는 고지혈증 유도군과 비교할 때 증가하는 경향을 나타내었으며, LDL-cholesterol의 함량은 고지혈증의 유도로 현저히 증가되던 것이 시료의 투여로 감소되었다. 한편 동맥경화지수도 식이성고지혈증의 유도로 정상군에 비해 약 10배정도 현저히 증가되던 것이 시료의 처리로 감소하였다.
- 같다. 혈청 중 중성지방의 함량 및 총지질의 함량이 정상군에 비하여 현저히 증가되었으나 시료의 투여로서 감소되는 경향을 보였으며, 한편 인지질의 함량은 함량의 차이는 보였으나 통계적으로 유의성은 없었으며 lipase의 활성에도 별다른 영향이 없었다.
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