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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 강원도 태백지역에서 채취한 마가목 잎, 열매와 수피의 물과 에탄올 추출물을 제조하여 이들 추출물에 대한 항돌연변이원성 실험, 항암효과 실험, 세포독성 등의 생리활성을 검색하여 식품으로서의 안정성을 탐색함으로써 약용 및 기능성 식품 자원으로의 활용 가능성을 높이고자 하였다.
제안 방법
- 한편 직접 돌연변이 원성을 나타내는 발암물질인 MNNG에 대한 항돌연변이원성 결과는 Table 3에 나타내었다. DNA 수복능을 함유하고 있는 recXPB1652) 균주와 DNA 수복능을 잃은 rec-(PB1791) 균주를 이용하여 DNA에 돌연변이를 일으키는 유발물질인 MNNG와 마가목 잎, 수피, 열매 추출물을(50㎍, 100㎍) 혼합첨가하여 두 균주의 생육을 비교함으로써 마가목 추출물의 항돌연변이원성을 측정하였다. 형성된 생육저해환(clear zone)을 비교하여 각 추출물이 돌연변이원 물질인 MNNG의 돌연변이원성을 얼마나 억제하는지를 rec+균과 rec-균의 dfference zone (cm)으로 나타내었고, 그 결과 마가목 잎, 수피, 열매 추출물은 변이원 물질인 MNNG 대조구에 비해 낮은 difference zone을 보여 MNNG에 의한 DNA 손상의 억제 활성을 보였다.
- 항돌연변이원성은 직접 변이원성 물질인 MNNG의 돌연변이 유발능의 억제를 측정하여 검색하였다. 건열 멸균된 glass cap tube에 마가목 각 추출물들을 각각 50μl씩 첨가하고 변이원 물질을 plate 당 0.5㎍씩 첨가한 다음 전 배양시킨 균액을 100μl씩 가한 뒤 0.2M sodium phosphate buffer(pH 7. 4)로 전체량이 700μl가 되도록 한 뒤 상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 항돌연변이 활성은 변이원 물질의 활성에 대한 시료의 억제율 (inhibition %)로 나타내어 다음 식으로 산출하였다.
- USA)를 20㎍/disk로 투여하여 생성된 clear zone을 비교하였다. 또한 PB1791 및 PB1652의 포자한천 배지의 thin paper disk(8mm)에 돌연변이 물질인 MNNG(20μl/disk)와 마가목의 각 추출물(50, 100㎍/disk)을 혼합 투여하였다. 마가목의 각 추출물에 의한 MNNG의 작용의 억제를 측정하여 항돌연변이 능을 검색하였다.
- , 1983).마가목 각 추출물들을 건열 멸균된 glass cap tube에 각각 50μl씩과 TA culture에서 하룻밤 전 배양시킨 균액 100μl을 가한 뒤 0.2M sodium phosphate buffer(pH 7.4)로 전체 양이 700μl가 되도록 하고 이것을 37℃에서 30분간 진탕배양한 다음 histidine-biotin이 첨가된 top agar (45℃)를 2m씩 가하여 잘 혼합한 후 minimal glucose agar plate에 도말 평판고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이 수를 측정하여 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다. 항돌연변이원성은 직접 변이원성 물질인 MNNG의 돌연변이 유발능의 억제를 측정하여 검색하였다.
- 또한 PB1791 및 PB1652의 포자한천 배지의 thin paper disk(8mm)에 돌연변이 물질인 MNNG(20μl/disk)와 마가목의 각 추출물(50, 100㎍/disk)을 혼합 투여하였다. 마가목의 각 추출물에 의한 MNNG의 작용의 억제를 측정하여 항돌연변이 능을 검색하였다.
- 마가목의 잎, 줄기, 열매 부위를 추출에 적합하도록 세절, 마쇄한 뒤, 수직환류 냉각기를 부착시킨 플라스크에 시료의 중량에 대하여 각각 10배의 증류수와 에탄올을 가하여 증류수는 100℃, 에탄올은 80℃의 온도에서 12시간씩 3회 반복 추출하였다. 각각의 추출물들은 뜨거운 상태로 감압여과 후농축하여 동결건조한 후 각각의 수율을 계산한 결과 Table 1과 같다.
- 포자한천배지 thin paper disk(8mm)을 얻은 다음마가목의 각 추출물을 50, l00㎍/disk의 양으로 투여하여 DNA손상으로 세포의 생육이 억제되어져 생성된 clear zone의 지름을 측정하여 돌연변이 유발능을 즉정하였다. 비교 돌연변이 물질로서는 N-methyl-N-nitro- N-nitroso-guanidine(MNNG, Sigma Co. USA)를 20㎍/disk로 투여하여 생성된 clear zone을 비교하였다. 또한 PB1791 및 PB1652의 포자한천 배지의 thin paper disk(8mm)에 돌연변이 물질인 MNNG(20μl/disk)와 마가목의 각 추출물(50, 100㎍/disk)을 혼합 투여하였다.
- , 1988)으로 암세포인 HepG2, MCF7, A549세포와 정상세포인 WRL68의 생육에 미치는 영향을 측정하였다. 실험 대상 세포를 4-5cell/ml의 농도로 조절 후 96 well plate의 각 well에 100μl의 세포를 포함하는 배지를 분주하여 37.5℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양한 후각 추출물들을 100μl씩 첨가하여 최종 농도가 0.2, 0.4, 0.6, 1.0mg/ml로 되도록 한 후 48시간 배양하였다. 배양 후상등액을 제거하고 차가운 TCA(trichloroacetic acid ) 100μl를 가하여 4℃에서 1시간 동안 놓아둔 뒤 증류수로 4-5회 세척하여 TCA를 제거한다.
- 마가목은 잎, 수피, 열매로 나누어 채취한 뒤 깨끗이 손질하여 추출 수율을 향상시키기 위하여 수피부는 세절하고 열매부는 분쇄기로 분쇄하여, 수직으로 환류냉각기를 부착시킨 flask로 증류수 및 에탄올로 추출하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 뜨거운 상태에서 감압여 과장치에서 여과, 농축 후 동결건조하여 각각의 수율을 계산하였다.
- , 1993).포자한천배지 thin paper disk(8mm)을 얻은 다음마가목의 각 추출물을 50, l00㎍/disk의 양으로 투여하여 DNA손상으로 세포의 생육이 억제되어져 생성된 clear zone의 지름을 측정하여 돌연변이 유발능을 즉정하였다. 비교 돌연변이 물질로서는 N-methyl-N-nitro- N-nitroso-guanidine(MNNG, Sigma Co.
- 4)로 전체 양이 700μl가 되도록 하고 이것을 37℃에서 30분간 진탕배양한 다음 histidine-biotin이 첨가된 top agar (45℃)를 2m씩 가하여 잘 혼합한 후 minimal glucose agar plate에 도말 평판고화시켜 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀 돌연변이 수를 측정하여 돌연변이 원성의 유무를 판정하였다. 항돌연변이원성은 직접 변이원성 물질인 MNNG의 돌연변이 유발능의 억제를 측정하여 검색하였다. 건열 멸균된 glass cap tube에 마가목 각 추출물들을 각각 50μl씩 첨가하고 변이원 물질을 plate 당 0.
대상 데이터
- 마가목 열매와 수피는 강원도 농업기술원 특화작목시험장, 고원농업시험소로부터 제공받아 실험에 이용하였다.
- 실험에 이용한 세포주는 정상간 세포로 WRL68을 사용하였으며, 세포독성 실험을 위한 인간 유래 암세포로는 HepG2(hepatocellular carcinoma human), MCF7(breast adenocarcinoma, pleural effusion, human), A549(lung carcinoma, human)를 사용하였으며 DMEM배지에서 10% fetal bovin serum으로 적응시켜 실험 에 사용하였다. 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 SRB(sulforhodamine B)방법 (Dool et al.
- 암세포 생욱 억제 활성 측정을 위한 세포주로는 인간 폐암 세포(A549), 인간유방암 세포(MCF7), 인간간암 세포(HepG2), 세포독성을 위해서 인간 정상 간세포(WRL68)을 사용하였다. 세포 중 간암세포와 유방암 세포는 DMEM배지에서 나머지 세포들은 RPMI 1640배지에서 각각 10% fetal bovine serum으로 적응시켜 배양하였다.
이론/모형
- 마가목의 각 추출물들에 대한 돌연변이원성 실험은 S typhimurium의, 변이주인 TA100을 이용하여 개량된 Ames test인 preincubation 법으로 실시하였다(Maron et al., 1983).마가목 각 추출물들을 건열 멸균된 glass cap tube에 각각 50μl씩과 TA culture에서 하룻밤 전 배양시킨 균액 100μl을 가한 뒤 0.
- 실험에 이용한 세포주는 정상간 세포로 WRL68을 사용하였으며, 세포독성 실험을 위한 인간 유래 암세포로는 HepG2(hepatocellular carcinoma human), MCF7(breast adenocarcinoma, pleural effusion, human), A549(lung carcinoma, human)를 사용하였으며 DMEM배지에서 10% fetal bovin serum으로 적응시켜 실험 에 사용하였다. 세포 단백질을 염색하여 세포의 증식이나 독성을 측정하는 SRB(sulforhodamine B)방법 (Dool et al., 1981 : Micae et al., 1988)으로 암세포인 HepG2, MCF7, A549세포와 정상세포인 WRL68의 생육에 미치는 영향을 측정하였다. 실험 대상 세포를 4-5cell/ml의 농도로 조절 후 96 well plate의 각 well에 100μl의 세포를 포함하는 배지를 분주하여 37.
성능/효과
- 8과 6. 1%이었으며 잎 추출물의 수율은 각각 10.4, 8.2%로 나타났다.
- Fig. 4는 인간 정상 간 세포(WRL68) 에 마가목의 물과 에탄올 주 줄물을 0.2~l.0mg 첨가하여 세포생육을 즉정한 결과로 서 잎의 에탄올 추출물을 lmg/ml 첨가시 19~21%, 수피와 열매의 추출물은 각각 26~29, 25~29%의 저해율을 보여 세포독성이 그리 높지 않음을 알 수 있었다.
- 먼저 항돌연변이원성을 실험하고자하는 추출물에 대하여 돌연변이원성을 실험하여 Table 4에 나타내었다. Histidine 요구성 변이주인 S. thyphimunium TA 100균주를 이용한 Ames test 결과 His+ revertant colony수가 자연 복귀 돌연변의 수 132/plate와 큰 차이를 보이지 않아 마가목 잎, 줄기, 열매 추출물의 돌연변이원성은 없는 것으로 나타났다. 또한 마가목 추출물의 Ames test를 이용한 항돌연변이원성을 실험하여 Table 5에 나타내었다.
- 또한 마가목 추출물의 Ames test를 이용한 항돌연변이원성을 실험하여 Table 5에 나타내었다. 그 결과 마가목 잎의 에탄올 추출물 (100㎍)의 항돌연변이 능은 최대 65%, 수피의 에탄올 추출물(100㎍)은 68%, 열매의 에탄올 추출물(100㎍)은 73%를 보여 항돌연변이원성이 있음을 알 수 있었다. 한편 국내 자원으로서 컴프리가열즙에서 돌연변이 물질인 Trp-P-l에 대하여 TA100 균주에 대하여 76%의 항돌연변이 활성을 나타내었고 (박 et al.
- subtilis를 이용한 spore rec assay는 야생균 주인 PB1652(rec+)와 변이주인 PB1791(rec+)의 포자를 이용하여 변이원 물질인 MNNG(N-methyl~N '-nitro- N- nitroso guanidine)에 민감한 반응을 이용하여 항돌연변이원성을 탐색하고자 하는 시료에 대하여, 먼저 돌연변이 원성을 측정하여 Table 2에 나타내였다. 마가목의 잎, 수피, 열매의 물과 에탄올 추출물(50, 100㎍)의 돌연변 이원성 측정 결과 DNA-damaging activity(rec-/rec+)가 을 나타내 돌연변이 원성이 없는 것으로 나타났으며 양성물질로 사용한 발암물질인 MNNG의 저해율은 2.57을 나타내었다.
- 마가목잎, 수피, 열매 추출물의 Spore-rec assay와 Ames test에 의한 항돌연변이 활성탐색 결과, 추출물 모두 돌연변이원성을 나타내지 않았으며 열매와 수피의 에탄올 추출물에서 MNNG에 대하여 높은 항돌연변이원성을 나타내었다.
- 잎의 경우 1mg/ml첨가 시 물 추출물과 에탄올 추출물이 63%, 75%를 보여줄기나 열매에 비해 다소 낮은 항암 활성을 보였다. 열매의 경우 에탄올 주줄물을 lmg/ml 첨가 시 최고 91% 생육 억제율을 보여 수피나 잎에 비해 높은 항암 활성을 보였다.
- 각각의 추출물들은 뜨거운 상태로 감압여과 후농축하여 동결건조한 후 각각의 수율을 계산한 결과 Table 1과 같다. 열매의 에탄올, 물 추출물은 수율이 각각 46.8%와 36%로 가장 높았고, 줄기 부위의 에탄올과 물 추출물의 수율은 각각 1.8과 6. 1%이었으며 잎 추출물의 수율은 각각 10.
- 75mg/ ml 이상의 농도에서 65% 이상의 생육 억제 활성을 나타내었다. 유방암 세포주인 MCF7에 대하여서는 0.75mg/ml 이상의 농도에서 58% 이상의 생육 억제능을 나타내었으며, 열매의 에탄올 추출물이 L0mg/ml의 농도에서 91%의 생육을 억제하였다. 간암 세포주인 HepG2에 대하여서는 수피와 열매의 추줄물들이 0.
- 인간 암세포주를 이용한 항암효과 실험은 먼저 정상 간 세포인 WRL68에 대한 세포독성 효과를 검토한 결과, 0.75mg/ml이하의 농도에서 수피의 물 추출물을 제외하고는 모두 20% 이하의 낮은 세포독성을 나타내어 추출물 자체의 세포독성은 낮은 것으로 확인되었다. 인간 폐암 세포(A549), 유방암 세포(MCF7), 간암세포(HepG2)에 대한 세포독성 결과, 수피의 에탄올 주 줄물이 폐암세 포주인 A549에 대하여 1.
- 75mg/ml이하의 농도에서 수피의 물 추출물을 제외하고는 모두 20% 이하의 낮은 세포독성을 나타내어 추출물 자체의 세포독성은 낮은 것으로 확인되었다. 인간 폐암 세포(A549), 유방암 세포(MCF7), 간암세포(HepG2)에 대한 세포독성 결과, 수피의 에탄올 주 줄물이 폐암세 포주인 A549에 대하여 1.0 m&/ml의 농도에서 94%의 가장 높은 암세포 생육 억제능을 나타내었으며, 0.75mg/ ml 이상의 농도에서 65% 이상의 생육 억제 활성을 나타내었다. 유방암 세포주인 MCF7에 대하여서는 0.
- 1과 같다. 추출물 농도가 증가함에 따라 유방암 세포의 생육이 억제되었으며 잎의 경우 에탄올 주줄물을 lmg/ml 첨가시 85%, 물추줄물은 1mg/ ml 첨가 시 78% 생육의 억제되었고, 열매의 경우 에탄올 추출물은 첨가시 최고 91%까지 암세포 생육을 억제하여 높은 항암 활성이 있음이 관찰되었다. 한편 인간 폐암 세포(A549)에 대한 마가목 잎, 줄기, 열매의 물과 에탄올 추출물의 농도에 따른 암세포 생육 억제율을 측정한 결과 Fig.
- DNA 수복능을 함유하고 있는 recXPB1652) 균주와 DNA 수복능을 잃은 rec-(PB1791) 균주를 이용하여 DNA에 돌연변이를 일으키는 유발물질인 MNNG와 마가목 잎, 수피, 열매 추출물을(50㎍, 100㎍) 혼합첨가하여 두 균주의 생육을 비교함으로써 마가목 추출물의 항돌연변이원성을 측정하였다. 형성된 생육저해환(clear zone)을 비교하여 각 추출물이 돌연변이원 물질인 MNNG의 돌연변이원성을 얼마나 억제하는지를 rec+균과 rec-균의 dfference zone (cm)으로 나타내었고, 그 결과 마가목 잎, 수피, 열매 추출물은 변이원 물질인 MNNG 대조구에 비해 낮은 difference zone을 보여 MNNG에 의한 DNA 손상의 억제 활성을 보였다. 이러한 활성은 마가목에 다량 존재하는 sorbic acid 등(김, 1972)의 항산화성 물질들이 DNA 손상에 대하여 방어 작용을 나타낸 것으로 사료되어 진다.
후속연구
- 이와 같은 결과로부터 마가목잎, 열매, 수피 주줄물 들은 시료 자체의 독성은 낮은 반면 항돌연변이 원성 및 암세포주에 대한 생육억제 활성이 높아 앞으로 이들 추출물을 이용한 기능성 식품 소재로의 이용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
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