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문제 정의
- 마가목, 현지초의 각각 추출물 및 이들의 1:1로 혼합한 시료가 연골세포 분화 촉진에 미치는 영향을 알아보기 위하여 다음과 같은 연구를 수행하였다. 즉, ATDC5 연골전구 세포에 14일 동안 transferrin 및 sodium selenite를 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하면서, 각 시료를 10, 100 및 250 μg/ml의 농도로 처리한 후, alciain blue 염색을 실시하였다.
- 본 연구는 마가목 (SC) 및 현지초 추출물 (GT) 과 그리고 이를 동량의 비율로 섞은 혼합소재 (MIX)를 골질환 조절에 응용하기 위한 기초 연구로서 조골세포, 파골세포 및 연골세포의 분화에 미치는 영향을 확인하고자 수행되었다.
- 본 연구에서는 마가목, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합물 시료가 조골세포, 파골세포 및 연골세포의 분화에 영향을 미치는지 알아보기 위해, 각각의 시료를 조골세포주인 MG-63 세포, 파골세포로의 분화를 유도한 Raw264.7 세포 및 연골세포로의 분화를 유도한 ATDC5세포에 처리하여 분화 조절 정도를 확인하였다. 그림1을 통해 마가목, 현지초 추출물 및 이들의 혼합시료 모두 MG-63 세포에서 ALP 활성에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었으며, 이는 이들 시료가 조골세포의 증식에는 효과를 나타내지 않음을 의미한다.
- 현재까지 뼈관련 건강기능성 소재로는 vitamin-D와 칼슘이 주로 이용되고 있고, 최근 prebiotic fibers와 soy isoflavone, 갈근 등을 활용한 제품 개발이 활발하나 소화흡수의 문제와 효능 미비 등으로 인하여 아직까지는 만족할 만한 치료효과를 내지는 않은 것으로 알려지고 있어 본 연구에서는 다음과 같은 두 가지 소재를 일차검색을 통하여 선발하게 되었다.
제안 방법
- 0.1% Triton X-100을 넣고 1분 후에 제거하고 기질용액 (50 μl Fast Garnet GBC Base solution, 50 μl sodium nitrite solution, 4.5 ml 증류수, 50 μl Naphthol AS-BI Phosphate solution, 200 μl acetate solution, 100 μl tartrate solution)을 이용하여 고정시킨 세포에 분주하고 37℃에서 40분 반응시켜 염색한 후 현미경으로 분화된 파골 세포를 관찰하였다.
- 14일 후, Alcian-blue 염색법을 실시하기 위해 세포의 배지를 제거하고 1×phosphate buffer saline (PBS) 으로 세척한 후, 95% 메탄올로 세포를 고정시키고 1% Alcian-blue 8GS로 16시간 염색하였다.
- 24시간 후, 10 μg/ml transferrin 및 30 nM sodium selenite가 포함된 배지로 14일간 세포분화를 유도하였으며, 그 기간 동안 각각의 시료를 함께 처리하였다.
- 세포가 배양용기에 85±5% 정도 자랐을 때, trypsin 처리하여 세포를 이탈시키고, 96-well 배양용기에 각 well 당 1×103개의 세포가 포함되도록 분주하였다. 24시간 후, Raw264.7 세포의 파골세포로의 분화를 촉진하기 위해 50 ng/ml RANKL을 처리하였으며, 각각의 시료를 6일간 함께 배양하였다. RANKL은 파골세포의 골 파괴 활성을 증대시키고 세포 생존력을 높이는 효과가 있어서 M-CSF와 함께 파골 세포 분화에 필수적인 사이토카인으로 알려져 있다[17].
- 세포 용해액은 4℃에서 14000 rpm으로 20분간 원심분리하였고, 상층액을 취하여 단백질 정량과 ALP 활성을 측정하였다. ALP 활성 측정 실험은 LabAssayTM ALP kit를 이용하여 수행하였으며, 405 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. 또한 세포 내 단백질을 정량하고 ALP/Protein으로 수치화하여 시료의 relative activity를 결정하였다.
- Alciain blue 염색 시, 연골세포로 분화가 이루어진 경우 교원질이 염색되면서 푸른색을 띠게 되는데, 이러한 성질을 이용하여 연골세포의 분화 정도를 확인하였다(*p<0.05).
- 골기질이 성숙되는 시기에 ALP가 증가하고 이후 무기질화가 진행되기 때문에 조골세포의 증식을 확인하기 위하여 MG-63 세포주를 이용하였다. MG-63 세포주에 마가목 (SC), 현지초 추출물 (GT) 및 이들의 1:1 혼합시료 (MIX)를 처리하였고, 이후 ALP 활성을 측정하고 더불어 세포생존률도 함께 확인하였다. 직접적으로 조골세포의 분화를 자극시키는 것으로 알려져 있는 물질 17β-estradiol (EST)을 양성 대조군으로 사용하였다.
- TRAP은 파골세포로부터 분비되는 효소로서 골기질의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문에, 시료 처리 6일 후, TRAP 염색법으로 파골세포의 분화 정도를 확인하였다(*p<0.05).
- Transferrin 및 sodium selenite를 처리하여 연골세포로의 분화를 유도한 ATDC5 세포주에 마가목 (SC), 현지초 추출물(GT) 및 이들의 1:1 혼합시료 (MIX)를 처리하여 alcian-blue 염색을 실시하였다. Alciain blue 염색 시, 연골세포로 분화가 이루어진 경우 교원질이 염색되면서 푸른색을 띠게 되는데, 이러한 성질을 이용하여 연골세포의 분화 정도를 확인하였다(*p<0.
- 이후 여과물을 감압농축하여 동결건조 하였다. 각 시료의 수율은 마가목 추출물은 8.10%, 현지초 추출물은 13.15%였으며, 마가목 및 현지초 추출물 시료를 각각 1:1의 비율로 섞어서 혼합시료 (MIX)를 제조하였다.
- ALP 활성 측정 실험은 LabAssayTM ALP kit를 이용하여 수행하였으며, 405 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다. 또한 세포 내 단백질을 정량하고 ALP/Protein으로 수치화하여 시료의 relative activity를 결정하였다. 본 실험에서 ALP 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 17β-estradiol (10 μM)을 양성대조군(positive control)으로 사용되었다[16].
- 마가목, 현지초 및 이들의 1:1 혼합시료가 조골세포의 ALP 활성에 미치는 영향을 알아보기 위해 MG-63 세포주에 각각의 시료를 48시간 동안 처리한 후, ALP가 무색의 p-nitrophenylphosphate를 phosphate와 노란색의 p-nitrophenol로 분해시키는 원리를 이용하여 세포내의 ALP 활성을 측정하였다. 즉 각각 시료를 10, 100 및 250 μg/ml의 농도로 처리하였으나, ALP 활성에는 영향을 미치지 않았으며, 세포생존률에도 영향을 주지 않았다 (그림.
- TRAP은 파골세포가 골 흡수작용을 할 때 분비가 증가되고 ATP, nitrophenyl phosphate가 존재할 때 높은 활성을 가지는 효소로서 파골분화 정도를 측정 할 수 있는 파골세포의 세포 화학적 표지효소이다. 마가목, 현지초 추출물 및 이들의 1:1 혼합시료가 마우스 대식 세포주 유래인 RAW264.7 cell의 TRAP 활성도에 미치는 영향을 알아보기위하여 6일 동안 RANKL을 처리하여 세포를 분화시키면서 각 시료를 함께 처리하여 TRAP의 활성을 측정하였다. 그 결과, 세 시료 모두 농도 의존적으로 TRAP 활성이 감소하는 경향을 보였다.
- 2% TritonX-100을 각각 50 μl 씩 넣고 4℃에서 3분간 초음파 추출기를 이용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해액은 4℃에서 14000 rpm으로 20분간 원심분리하였고, 상층액을 취하여 단백질 정량과 ALP 활성을 측정하였다. ALP 활성 측정 실험은 LabAssayTM ALP kit를 이용하여 수행하였으며, 405 nm에서의 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 세포가 배양용기에 75±5%정도 채워지면 trypsin을 처리하여 세포를 이탈시키고, 24-well 배양용기에 각 well 당 2×104 개의 세포가 포함되도록 분주하였다.
- 세포가 배양용기에 85±5% 정도 자랐을 때, trypsin을 처리하여 세포를 이탈시키고, 6-well 배양용기에 각 well 당 1.5×105개의 세포가 포함되도록 분주하였다.
- 14일 후, Alcian-blue 염색법을 실시하기 위해 세포의 배지를 제거하고 1×phosphate buffer saline (PBS) 으로 세척한 후, 95% 메탄올로 세포를 고정시키고 1% Alcian-blue 8GS로 16시간 염색하였다. 염색용액 제거 후 3% acetic acid로 30초 동안 세 번 세척하고 염색 정도를 확인하기 위하여 현미경 관찰 및 사진을 찍고, 10% acetic acid로 염색을 녹여 낸 후 650 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 추출물을 얻기 위하여 각 시료를 세척 후, 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 2시간 동안 환류 추출 후, 여과과정을 세 번 반복하였다. 이후 여과물을 감압농축하여 동결건조 하였다. 각 시료의 수율은 마가목 추출물은 8.
- 즉, ATDC5 연골전구 세포에 14일 동안 transferrin 및 sodium selenite를 처리하여 연골세포로의 분화를 유도하면서, 각 시료를 10, 100 및 250 μg/ml의 농도로 처리한 후, alciain blue 염색을 실시하였다.
- 마가목 (Sorbus commixta, SC)은 옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서, 현지초 (Geranium thunbergii, GT)는 대람약업사 (Seoul, Korea)에서 각각 구입하였다. 추출물을 얻기 위하여 각 시료를 세척 후, 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 2시간 동안 환류 추출 후, 여과과정을 세 번 반복하였다. 이후 여과물을 감압농축하여 동결건조 하였다.
대상 데이터
- 17β-estradiol (EST)을 양성 대조군으로 사용하였다.
- DMEM, α-MEM 및 F-12 medium, fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin (PS)는 Gibco (NY, USA)에서 구입하였으며, LabAssayTM ALP kit는 Wako (Osaka, Japan)에서, receptor activator of NF-κB ligand (RANKL)은 PeproTech (NJ, USA)에서 각각 구입하였다.
- Human osteoblast-like MG-63 세포주는 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 포함된 DMEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- MG-63 세포가 배양용기에 85±5% 정도 자랐을 때, trypsin을 처리하여 세포를 이탈시키고, 96-well 배양용기에 각 well 당 7.5×103개의 세포가 포함되도록 분주하였다.
- Mouse monocyte/macrophage인 Raw 264.7 세포주는 10% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 포함된 α-MEM 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 골기질이 성숙되는 시기에 ALP가 증가하고 이후 무기질화가 진행되기 때문에 조골세포의 증식을 확인하기 위하여 MG-63 세포주를 이용하였다. MG-63 세포주에 마가목 (SC), 현지초 추출물 (GT) 및 이들의 1:1 혼합시료 (MIX)를 처리하였고, 이후 ALP 활성을 측정하고 더불어 세포생존률도 함께 확인하였다.
- 그 밖에 17β-estradiol, transferrin, sodium selenite, bovine insulin, sodium nitrite 및 alcian-blue 8GS와 같은 물질은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 마가목 (Sorbus commixta, SC)은 옴니허브 (Yeongcheon, Korea)에서, 현지초 (Geranium thunbergii, GT)는 대람약업사 (Seoul, Korea)에서 각각 구입하였다. 추출물을 얻기 위하여 각 시료를 세척 후, 10배의 증류수를 가하고 100℃에서 2시간 동안 환류 추출 후, 여과과정을 세 번 반복하였다.
- 본 실험에서 ALP 활성을 증가시키는 것으로 알려져 있는 17β-estradiol (10 μM)을 양성대조군(positive control)으로 사용되었다[16].
- 세포가 배양용기에 85±5% 정도 자랐을 때, trypsin 처리하여 세포를 이탈시키고, 96-well 배양용기에 각 well 당 1×103개의 세포가 포함되도록 분주하였다.
- 양성대조군으로는 10 μg/ml bovine insulin을 사용하였다.
- 연골세포의 전구체인 ATDC5 cell을 DMEM과 F-12가 1:1로 섞여 있는 배지에 5% FBS, 100 U/ml penicillin 및 100 μg/ml streptomycin이 혼합된 배지를 사용하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 직접적으로 조골세포의 분화를 자극시키는 것으로 알려져 있는 물질 17β-estradiol (EST)을 양성 대조군으로 사용하였다.
데이터처리
- 대조군과의 차이에 대한 분석은 ANOVA 분석방법을 이용하였으며, 통계학적 유의성은 Student’s t test를 이용하여 검증하였고, 통계적 유의 수준은 p-values < 0.05로 정하였다.
- 위와 같은 실험을 3회에 걸쳐서 반복하여 결과를 얻었으며, 모든 자료는 대조군에 대한 백분율로 계산하고 평균±표준편차로 표시하였다.
성능/효과
- EST 10 μM을 MG-63 세포주에 처리한 결과, 세포생존률의 변화 없이 ALP 활성을 138.3±5.8% 증가시켰다.
- 7 cell의 TRAP 활성도에 미치는 영향을 알아보기위하여 6일 동안 RANKL을 처리하여 세포를 분화시키면서 각 시료를 함께 처리하여 TRAP의 활성을 측정하였다. 그 결과, 세 시료 모두 농도 의존적으로 TRAP 활성이 감소하는 경향을 보였다. 마가목은 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 TRAP 활성을 43.
- 7 세포 및 연골세포로의 분화를 유도한 ATDC5세포에 처리하여 분화 조절 정도를 확인하였다. 그림1을 통해 마가목, 현지초 추출물 및 이들의 혼합시료 모두 MG-63 세포에서 ALP 활성에 영향을 미치지 않음을 확인할 수 있었으며, 이는 이들 시료가 조골세포의 증식에는 효과를 나타내지 않음을 의미한다. 그러나 마가목 및 현지초, 그리고 각각의 추출물을 1:1로 혼합한 시료가 농도의존적으로 파골세포의 분화를 억제하는 결과를 그림 2에서 확인할 수 있었다.
- 마가목은 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 TRAP 활성을 43.0±19.9 %억제하였으며, 특히, 마가목과 현지초의 1:1 혼합시료는 100 및 250 μg/ml의 농도에서 23.0±2.9 % 및 95.0±3.8 %를 감소시키는 것으로 보아 그 효과가 매우 뛰어난 것을 확인할 수 있었다 (그림.2).
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때, 본 연구는 마가목과 현지초가 파골세포 분화 억제 및 연골세포 분화 촉진 효능을 나타냄으로써 골관절염으로 인하여 유발되는 골손실과 연골손상으로부터 보호할 수 있는 중요한 천연물 소재임을 확인할 수 있었다는 측면에서 큰 의의를 둘 수 있겠다.
- 즉 각각 시료를 10, 100 및 250 μg/ml의 농도로 처리하였으나, ALP 활성에는 영향을 미치지 않았으며, 세포생존률에도 영향을 주지 않았다 (그림.1).
- 또한 그림3의 결과로 볼 때, 이들 시료는 연골세포의 분화를 촉진하는 효과를 나타냈다. 즉, 마가목 및 현지초 추출물이 조골세포의 분화에는 영향을 미치지 않으면서, 과도하게 활성화된 파골세포의 분화를 억제하고 연골세포의 분화를 동시에 증가시킴으로써, 결과적으로 골 흡수 및 연골 손상을 효과적으로 억제할 수 있을 것이라는 가능성을 보여주고 있다. 특히 마가목은 파골세포 및 연골세포의 분화를 모두 조절하는 효과를 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 마가목이 전통적으로 류마티스 관절염 등과 같은 골 관련 질환에 사용되어 왔다는 사실을 과학적으로 증명되었다는 측면에서 그 의미가 있다.
- 즉, 마가목 및 현지초 추출물이 조골세포의 분화에는 영향을 미치지 않으면서, 과도하게 활성화된 파골세포의 분화를 억제하고 연골세포의 분화를 동시에 증가시킴으로써, 결과적으로 골 흡수 및 연골 손상을 효과적으로 억제할 수 있을 것이라는 가능성을 보여주고 있다. 특히 마가목은 파골세포 및 연골세포의 분화를 모두 조절하는 효과를 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 마가목이 전통적으로 류마티스 관절염 등과 같은 골 관련 질환에 사용되어 왔다는 사실을 과학적으로 증명되었다는 측면에서 그 의미가 있다. 특히 현지초는 단독 처리시에는 골관절 대사에 영향을 미치지 않았으나, 마가목과 함께 처리 시에 상승효과를 나타냈다.
- 특히 마가목은 파골세포 및 연골세포의 분화를 모두 조절하는 효과를 가지고 있는 것으로 나타났으며, 이는 마가목이 전통적으로 류마티스 관절염 등과 같은 골 관련 질환에 사용되어 왔다는 사실을 과학적으로 증명되었다는 측면에서 그 의미가 있다. 특히 현지초는 단독 처리시에는 골관절 대사에 영향을 미치지 않았으나, 마가목과 함께 처리 시에 상승효과를 나타냈다. 그러므로 이러한 효능을 나타내는 작용기전 및 지표성분, 나아가 생리활성 물질의 구명에 대한 연구는 추후 진행되어야 할 것이다.
- 특히, 마가목은 250 μg/ml의 농도에서 대조군과 비교하여 연골세포 분화를 83.7±2.5% 증가시켰으며, 이는 bovine insulin을 처리한 양성 대조군 보다도 높은 증가율 (31.2±2.0%)을 가지는 것이다.
- 그러나 마가목 및 현지초, 그리고 각각의 추출물을 1:1로 혼합한 시료가 농도의존적으로 파골세포의 분화를 억제하는 결과를 그림 2에서 확인할 수 있었다. 특히, 현지초 추출물이 TRAP 활성에 대하여 높은 감소율을 보였다. 단, 100 μg/ml의 고농도에서는 거의 TRAP 활성을 완벽하게 감소시켰는데, 이는 Raw264.
- 현지초 추출물은 10 μg/ml의 저농도에서 TRAP 활성에 대하여 높은 감소율을 보였고, 100 μg/ml의 농도에서는 거의 TRAP 활성을 완벽히 감소시켰다.
후속연구
- 특히 현지초는 단독 처리시에는 골관절 대사에 영향을 미치지 않았으나, 마가목과 함께 처리 시에 상승효과를 나타냈다. 그러므로 이러한 효능을 나타내는 작용기전 및 지표성분, 나아가 생리활성 물질의 구명에 대한 연구는 추후 진행되어야 할 것이다.
- 골관절염은 골흡수 작용과 관련된 각종 사이토카인 및 효소의 발현을 증가시켜 조골세포와 파골세포 분화의 상호 조절을 방해함으로써 결과적으로 골손실과 연골손상을 유발하는 질환으로 알려져 있다. 그러므로 조골세포, 파골세포 및 연골세포의 분화를 효과적으로 조절할 수 있다면 골관절염에 의한 골손실을 억제 할 수 있을것이다. 최근 골손실 억제 효과를 가지는 천연물을 찾고자 하는 시도가 활발히 진행되고 있으며, 포도[18], 파극천[19]및 선모[20] 등에 대한 연구가 대표적이다.
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