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문제 정의
- 본 연구에서는 버섯재배 시 빈번하게 발생되는 유해 균류의 문제점을 해결하고, 과학적이며 안청적인 느타리버섯의 재배를 확립하기 위하여 버섯 푸른곰팡이병의 원인균인 Trichoderma속 균주에 대해 길항력이 우수한 세균(KATB 99121, KMB 99122 및 KATB 99123)을 분리하였으며, 분리된 세균의 푸른곰팡이병균에 대한 항균활성과 세포외 분비효소의 활성을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- hamatum(KACC 40508) 등 9균주와 느타리버섯 재배용 배지의 제조단계 중 후 발효과정의 배지시료에서 분리한 Trichoderma spp. 2균주 (G 및 Y주) 등 총 11 균주를 대상으로 항균활성을 측정하였다. 또한 동물 병원 균인 CaMidQ albicans(K\CC 3006)을 대상으로 한 항균 활성을 측정하였다.
- Carboxymethylcelluose(CMC) 배지 (CMC 5 g, peptone 5 g, CaCl2 0.5 g. MgSO4 2 g, KC1 1 g, FeSO4 0.001 g, agar 18 g, 증류수 1 ℓ)에 분리세균을 접종하고 42℃에서 2일간 정치배양한 후, 배지상에 0.5 % Congo-red 용액을 첨가하여 5분간 반응시키고 반응액을 제거한 후 균체주 위에 투명대를 형성하면 섬유소 분해능이 있는 것으로 판정하였다.
- Gelatin이 첨가된 배지 (gelatin 5 g, beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 18 g, 증류수 1 ℓ)에 분리세균을 접종하 고 42℃에서 2일간 정치배양한 후, 배지상에 1% tannic acid 용액을 첨가하여 5분간 반응시키고 반응액을 제거한 후 균체 주위에 불투명한 결정체를 형성하면 단백질 분해능이 있는 것으로 판정하였다.
- Soluble stamh가 함유된 배지 (starch 5 g, peptone 10 g, CaCl2 0.5 g, MgCI2 5 g, MgSO4 2 g, KCI 1 g, FeSO4 0.001 g, agar 18 g, 증류수 1 ℓ)에 분리세균을 접종하고 42℃에서 2일간 정치배양한 후, 배양된 배지상에 Gram's iodine 용액을 첨가하여 5분간 반응시키고 iodine을 제거한 후 균체 주위에 투명대를 형성하면 전분 분해능이 있는 것으로 판정하였다.
- 느타리버섯 재배용 배지의 제조단계 중 후 발효과정의 배지시료 60 g을 채취하여 준비된 멸균 증류수에 현탁시킨 후 10배 희석법에 따라 nutrient agar plate(NA, Difco Co.)에 도말하여 42℃항온 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 푸른곰팡이병 원인균을 potato dextrose agar(PDA, Difco Co.
- albicans 균주를 6 mm agar plug 형태로 접종한 후, nutrient broth 배지에서 전 배양된 분리세균 의 배양액과 배양 상등액을 6 mm paper disk(Advantecf Toyo)에 접종하여 disk의 외측연으로부터 형성된 투명한 억제대의 크기를 비교함으로서 분리균주의 항균활성을 측정하였다. 또한 느타리버섯 균주에 대한 영향을 평가하기 위하여 P. ostreatus 3균주에 대한 항균활성은 동일한 방법으로 실시하였다.
- 2균주 (G 및 Y주) 등 총 11 균주를 대상으로 항균활성을 측정하였다. 또한 동물 병원 균인 CaMidQ albicans(K\CC 3006)을 대상으로 한 항균 활성을 측정하였다.
- 분리세균의 푸른곰팡이병 항균활성 측정은 PDA와 NA 가 동량으로 혼합된 배지의 중앙에 8개의 Trichoderma속 균주와 1개의 C. albicans 균주를 6 mm agar plug 형태로 접종한 후, nutrient broth 배지에서 전 배양된 분리세균 의 배양액과 배양 상등액을 6 mm paper disk(Advantecf Toyo)에 접종하여 disk의 외측연으로부터 형성된 투명한 억제대의 크기를 비교함으로서 분리균주의 항균활성을 측정하였다. 또한 느타리버섯 균주에 대한 영향을 평가하기 위하여 P.
- )에 도말하여 42℃항온 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 푸른곰팡이병 원인균을 potato dextrose agar(PDA, Difco Co.)와 NA가 동량으로 혼합된 배지의 중망에 접종한 후, NA 배지에서 전 배양된 분리세균의 배양액을 paper disk(Advantec, Tbyo) 접종방법으로 길항실험을 실시하여 균체 주변에 투명한 항균활성대를 형성하는 3균주를 분리하였다. 분리한 세균의 생화학적 특성을 Biolog system을 이용하여 분석한 결과 Bacillus spp로 동정되었다(Lee and Hyun, 2000).
- Trichoderma속 균주는 느타리버섯 재배 시 발생되는 버섯 푸른곰팡이병의 주요 원인균이다. 후발효된 버섯 배지로부터 버섯 푸른곰팡이병균에 항균활성을 나타내는 길항 세균(KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123)을 분리하였다. 분리세균 중 KATB 99121은 T.
성능/효과
- Esculin(6, 7-dihydroxycoumarin 6-glucoside)이 첨가된 배지 (esculin 3 g, NaNO3 2 g, MgSO4·7H2O 10 mg, KC1 0.5 g, ferric citrate 0.2 g, 2% K2HPO4 50 ml, 1% ZnSO4·7H2O 1 ml, 0.5% CuSO4·7H2O 1 ml, agar 18 gt 증류수 1 ℓ)에 분리세균을 접종하고 42℃에서 3일간 정치배양한 후, 균체 주위에 검은색 띠가 형성되면 분해능이 있는 것으로 판정하였다.
- 느타리버섯의 푸른곰팡이병균인 Trichloderma속 균주에 대한 항균활성을 나타낸 길항세균은 각각 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123으로 명명하였으며, 느타리버섯(2209, Chunchu 2 및 Wenhyung)의 성장에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Table 1). 길항세균 KATB 99121은 T. harzianum(ATCC 6043, ATCC 6385, ATCC 6426 및 ATCC 6504), T. viride(KACC 40519), T. hamatum (KACC 40508)과 본 연구실에서 분리한 Trichoderma 속 균주 (G 및 Y주)에 대하여 탁월한 향균활성을 나타내 었다(Table 1과 Fig. 1). 분리균주 KATB 99122는 T.
- 느타리버섯의 푸른곰팡이병균인 Trichloderma속 균주에 대한 항균활성을 나타낸 길항세균은 각각 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123으로 명명하였으며, 느타리버섯(2209, Chunchu 2 및 Wenhyung)의 성장에는 영향을 미치지 않는 것으로 확인되었다(Table 1). 길항세균 KATB 99121은 T.
- 1 및 Table 1), 동물 병원성균에 대한 항진균 활성측정으로 앞으로 분리된 길항세균은 식물 및 동물병원성 진균류의 항균활성 균주로 서 연구를 계속해야 할 것이다. 또한, 길항세균은 대상 작물인 Pleurotus ostreatus(2209, Chunchu 2 및 Wonhyung) 에 대해서는 균체 및 배양상등액 모두 억제활성이 관찰되지 않았다. 따라서 본 연구자들에 의해 분리된 3개의 길항세균은 2차 오염원으로 작용할 수 있는 균체를 직접 사 용하지 않고 그 대사산물을 이용한 항진균 뭍질개발이 가능할 것으로 판단된다, 또한 후발효 버섯배지에서 분리된 이들 길항 세균들은 다양한 유기물 분해능력, 즉 지질, 전분, 섬유소, 단백질 등을 분해하는 능력을 소유하고 있으므로 이러한 유기물 분해능이 뛰어난 미생물의 개발은 농작물 재배 시 발생되는 진균성 질병발생을 억제함은 물론 퇴비의 개량 나아가 토양 및 수질환경 개선에도 크게 기여할 것으로 판단된다.
- 배지에 첨가된 Tween 80의 분해능력 실험에서 길항세균 KATB 99122와 KATB 99123은 균체 주변에 불투명한 결정체를 형성하여 분해능력이 있는 것으로 관찰되었으나, KATB 99121은 지방분해 효소를 분비히지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 2). 전분 분해능력 실험에서는 길항세균 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123의 균체 주변에 요오드반응이 일어나지 않는 뚜렷한 투명대를 형성하여 3균주 모두 전분 분해능력이 높은 것으로 확인되었다.
- 전분 분해능력 실험에서는 길항세균 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123의 균체 주변에 요오드반응이 일어나지 않는 뚜렷한 투명대를 형성하여 3균주 모두 전분 분해능력이 높은 것으로 확인되었다. 섬유소원인 CMC의 분해능력 실험에서는 길항세균 KATB 99121과 KATB 99122의 균체 주변에 Congo-red에 약하게 반응하는 연분홍색의 불투명대를 형성하여 섬유소 분해효소를 세포외로 분비하는 것으로 확인되었으나, KATB 99123은 미약한 활성대를 나타내었다. 세포외로 분비하는 단백질 분해효소의 활성실험에서 분리세균 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123에서는 균체 주변에 tannic acid에 반응하지 않는 투명대를 형성하여 3 균주 모두 활성이 있는 것으로 관찰되었다.
- 세포외로 분비하는 단백질 분해효소의 활성실험에서 분리세균 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123에서는 균체 주변에 tannic acid에 반응하지 않는 투명대를 형성하여 3 균주 모두 활성이 있는 것으로 관찰되었다. 세포외로 분비되는 β-glucosidase 활성은 길항세균 KATB 99123에서 가장 높은 활성을 나타내었고, KATB 99122, KATB 99121의 순서로 약한 활성이 관찰되었다.
- 2). 전분 분해능력 실험에서는 길항세균 KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123의 균체 주변에 요오드반응이 일어나지 않는 뚜렷한 투명대를 형성하여 3균주 모두 전분 분해능력이 높은 것으로 확인되었다. 섬유소원인 CMC의 분해능력 실험에서는 길항세균 KATB 99121과 KATB 99122의 균체 주변에 Congo-red에 약하게 반응하는 연분홍색의 불투명대를 형성하여 섬유소 분해효소를 세포외로 분비하는 것으로 확인되었으나, KATB 99123은 미약한 활성대를 나타내었다.
후속연구
- 또한, 길항세균은 대상 작물인 Pleurotus ostreatus(2209, Chunchu 2 및 Wonhyung) 에 대해서는 균체 및 배양상등액 모두 억제활성이 관찰되지 않았다. 따라서 본 연구자들에 의해 분리된 3개의 길항세균은 2차 오염원으로 작용할 수 있는 균체를 직접 사 용하지 않고 그 대사산물을 이용한 항진균 뭍질개발이 가능할 것으로 판단된다, 또한 후발효 버섯배지에서 분리된 이들 길항 세균들은 다양한 유기물 분해능력, 즉 지질, 전분, 섬유소, 단백질 등을 분해하는 능력을 소유하고 있으므로 이러한 유기물 분해능이 뛰어난 미생물의 개발은 농작물 재배 시 발생되는 진균성 질병발생을 억제함은 물론 퇴비의 개량 나아가 토양 및 수질환경 개선에도 크게 기여할 것으로 판단된다.
- 본 연구실에서 분리한 세균(KAIB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123)은 균체뿐 아니라 배양상등액 처리군에서도 Altemaria altemata, A. pom, Phytophthora capsici, R cryptogea 및 Sclerotinia sclerotiorum 등의 병원성 곰팡이에 우수한 억제효과가 관찰되었으며 (Lee and Hyun, 2000) 본 실험에서도 Trichoderma속 8균주와 동물병원성 균주 C. albicans에 균체 및 배양상등액 접종지역에서 탁월한 항진균 홀성이 관찰되었고(Fig. 1 및 Table 1), 동물 병원성균에 대한 항진균 활성측정으로 앞으로 분리된 길항세균은 식물 및 동물병원성 진균류의 항균활성 균주로 서 연구를 계속해야 할 것이다. 또한, 길항세균은 대상 작물인 Pleurotus ostreatus(2209, Chunchu 2 및 Wonhyung) 에 대해서는 균체 및 배양상등액 모두 억제활성이 관찰되지 않았다.
- 후발효된 버섯 배지로부터 버섯 푸른곰팡이병균에 항균활성을 나타내는 길항 세균(KATB 99121, KATB 99122 및 KATB 99123)을 분리하였다. 분리세균 중 KATB 99121은 T. harzianum(4균 주), T. viride 및 T. hamatum과 동물병원성 곰팡이 Candida albicans에 대하여 우수한 억제 활성이 관찰되었고, 특히 세균의 배양상등액 접종실험에서 강한 항균활성을 보였다, 또한, KATB 99121은 전문, 단백질 및 섬유소를 분해하는 효소를 세포외로 분비하는 것으로 관찰되었고, KATB 99122와 KATB 99123은 전분, 단백질, 섬유소 분해효소는 물론 지질 분해효소도 분비하고 있었으며 β- glucosidase 활성도 높은 것으로 확인되었다, 앞으로 이들 길항세균들을 이용하여 느타리버섯 푸른곰팡이병 방제를 위한 미생물 살균제의 개발에 대한 연구를 수행할 예 정이다.
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