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문제 정의
- 그러나 우리나라의 수질 기준은 50mC에서 불검출로 규정하고 있다.2°) 따라서 본 연구에서는 우리나라 시료에의 적용 가능성을 살펴보고 자 시료의 양을 50mC로 하였다. 대장균군을 검출하기 위해 Bej22) 등이 고안한 JacZ primer를 사용하였다.
- 본 연구는 옹달샘의 대장균과 대장균군을 검출하는데 일반적으로 이용되고 있는 배양법과 최근 활용범위가 넓어지고 있는 PCR 법의 통계적 유의성을 조사하여 대장균과 대장균군의 신 속한 검출 및 신뢰성 있는 동정을 위한 방법을 찾고자 하였다. 이로서 옹달샘 물의 미생물학적 안전성을 확보함으로써 국민 보건 향상에 이바지하고자 한다.
- 본 연구에서는 대장균군을 검출하기 위한 PCR 법의 민감도 (sensitivity) 가 100%, 특이도 (specificity)?]- 80.7%로 비교적 높게 나타났다.
- 본 연구는 옹달샘의 대장균과 대장균군을 검출하는데 일반적으로 이용되고 있는 배양법과 최근 활용범위가 넓어지고 있는 PCR 법의 통계적 유의성을 조사하여 대장균과 대장균군의 신 속한 검출 및 신뢰성 있는 동정을 위한 방법을 찾고자 하였다. 이로서 옹달샘 물의 미생물학적 안전성을 확보함으로써 국민 보건 향상에 이바지하고자 한다.
제안 방법
- 대장균군과 대장균 검출을 위한 DNA의 PCR 증폭은 다음과 같이 실시하였다. Template DNA 2队 각각 50pmol primer 0.25 以, Premix Taq(TaKaRa, R004A) 25必를 포함하는 50以 반응액을 Thermal Cycler(GeneAmp PCR system 9700; Applied Biosystem)로 증폭하였으며 증폭 조건은 다음과 같았다.
- 추정시험 결과 양성인 경우 BGLB(Difco)에 이식하여 36℃에서 48시간 배양하여 가스가 생성되면 확정시험 양성으로 하였다. 가스 발생을 보인 BGLB 배지로부터 EMB(Difco)배지에 1 백금 루프량을 도말 접종하고 36℃에서 24±2시간 배양하여 그 성싱을 관찰하고 그람염색과 lactose 분해 가스생성 여부를 다시 확인하여 최종 판정하였다.如
- 대장균의 증폭 조건은 대장균의 경우 초기 denaturation 과정으로 95℃에서 3분간 수행하였고, denaturation 과정을 94C에서 1분, primer annealing과 extension 과정을 50笆에서 1분간씩 25회 실시하였고, 최종적으로 72C에서 7분간 extension 시켰다.23) 음성대조 실험으로는 각각의 반응물에 template DNA> 넣지 않은 것을 사용하였다.
- 서울시에 산재에 있는 109곳의 옹달샘 물을 대상으로 배양법 및 PCR 법을 이용하여 대장 큐 군 및 대장균 검출 시험을 하였다.
- 8% agarose g인에서 50V로 2시간 동안 전기영동을 실시하였으며 molecular size marker는 lOObp DNA ladder(Gibco/BRL)를 사용하였다. 전기영동한 Gele 0.5/zg/me 농도의 ethidium bromide(Sigma) 용액에 30분간 염색한 후, 다시 증류수에 30분 이상 세척하여 탈 염색을 한 후 UV transilluminator(Vilber Lumart)로 밴드를 분석하였다.
- 5><TBE b 나 ffer 에 Nusieve 3:1 agarose gel(FMC Bioproducts ; Rockland)을 녹여 만들었다. 증폭된 PCR products 5以와 6배로 농축된 sample loading dye(TaKaRa) 1丿以를 섞어 1.8% agarose g인에서 50V로 2시간 동안 전기영동을 실시하였으며 molecular size marker는 lOObp DNA ladder(Gibco/BRL)를 사용하였다. 전기영동한 Gele 0.
- 주정시험은 lactose broth(Difco)를 사용해 36 ℃ 에서 48±2시간 배양하여 가스를 생성한 경우를 양성으로 판정하였다. 추정시험 결과 양성인 경우 BGLB(Difco)에 이식하여 36℃에서 48시간 배양하여 가스가 생성되면 확정시험 양성으로 하였다. 가스 발생을 보인 BGLB 배지로부터 EMB(Difco)배지에 1 백금 루프량을 도말 접종하고 36℃에서 24±2시간 배양하여 그 성싱을 관찰하고 그람염색과 lactose 분해 가스생성 여부를 다시 확인하여 최종 판정하였다.
대상 데이터
- 대장균군을 검출하기 위한 primer는 0- galactosidase와 관련한 lacZ 유전자의 염기서 열 1675번째에서 1698번째에 위치하는 ZL- 1675 (5, - ATGAAAGCTGGCTACAGGAAGGCC -3')와, 염기서열 2001번째에서 2025번째에 흐H 당하는 ZR-2025(5'-GGTTTATGCAGCAACGA GACGTCA-3')를 사용하였고, 이들은 총 264bp 크기의 유전자를 생성하였다.拟
- 대장균을 검출하기 위한 primer 쌍은 uidA 유전자의 염기서열 754번째에서 773번째에 해당하는 UAL-754 (5'-AAAACGGCAAGAAAAA GCAG-3')와, 염기서열 880번째에서 900번째에 해당흐卜는 UAR -900(5'-ACGCGTGGTTACAG TCTTGCG-3')을 사용하였고, 이들은 총 147bp 크기의 유전자를 생성하였다 R 각 primer는 (주) Bioneer에 의뢰 제작한 것을 사용하였다.
데이터처리
- 배양법과 PCR 법의 판정의 일치도를 살펴보기 위해 통계 분석을 실시하였다. 통계 분석의 결과는 Table 4와 같았다.
이론/모형
- 대장균군은 5관 법을 이용한 최 확 수법 (most probable number)에 의해 즉정하였다. 주정시험은 lactose broth(Difco)를 사용해 36 ℃ 에서 48±2시간 배양하여 가스를 생성한 경우를 양성으로 판정하였다.
- 2°) 따라서 본 연구에서는 우리나라 시료에의 적용 가능성을 살펴보고 자 시료의 양을 50mC로 하였다. 대장균군을 검출하기 위해 Bej22) 등이 고안한 JacZ primer를 사용하였다. 이는 전통적인 대장균군 측정이 대장균군에 의해 생산된 丿 acZ 의 유전 산물(。- galactosidase)의 activity# 검출하는데 의존하기 때문이다观>
성능/효과
- 따라서 생세포와 죽은 세포를 구별하기 위한 어떤 기작이 사용되어야 한다.2。)본 연구에서도 배양법으로 검사했을 때 대장균군 음성으로 나타난 시료들 중 여러 건이 PCR 검사 결과 양성으로 나타났다. 이를 보완하기 위한 연구들이 계속 진행되어야 할 것으로 생각된다.
- 007MPN/100m« , 불암산 0.005MPN/100m<!, 관악산 및 구룡산 각 0.004MPN/100m«, 수락산 및 우면산 각 0.002MPN/100m« 순이었으며, 대모산과 청계산 모두 검출되지 않았다. 10MPN/100m£ 이상인 곳이 도봉산과 북한산 각 2개소, 관악산과 구룡산 각 1개소 총 6개소이었으며, 10MPN/100m£ 이하로 검출된 곳이 총 15개소로 남산 4개소, 북한산 3개소, 불암산과 관악산 각 2개소, 도봉산, 모락산, 수락산 그리고 우면산 각 1개소이었다.
- 002MPN/100m« 순이었으며, 대모산과 청계산 모두 검출되지 않았다. 10MPN/100m£ 이상인 곳이 도봉산과 북한산 각 2개소, 관악산과 구룡산 각 1개소 총 6개소이었으며, 10MPN/100m£ 이하로 검출된 곳이 총 15개소로 남산 4개소, 북한산 3개소, 불암산과 관악산 각 2개소, 도봉산, 모락산, 수락산 그리고 우면산 각 1개소이었다.
- Bej 등新)의 연구에서는 대장균군을 검출하는 방법으로 Standard Method21) primer를 이용한 PCR과 비교하고 있다. 그 결과 Plate count 법은 90건 중 13건이, Colilert 0NPG법은 90건 중 7건만이 PCR 결과와 일치하지 않는 것으로 보고하고 있어, 본 실험과 유사한 결과를 나타내었다.
- 옹달샘물의 대장균군을 PCR법으로 조사한 결과, 배양법의 양성건수 21건보다 17건이 많은 38건에서 양성으로 검출되었다. 대장균군 른 대장균군과 대장균의 민감도 100% 특이도 80.7%를 나타내었으며, kappa=0.62, McNemar 二 17.00으로 높은 일치도를 나타내었다.
- 대장균군 및 대장균에 대한 배양법 및 PCR법 을 통하여 두 시험 간의 민감도 및 특이도를 조사한 결과 서울 시내 109개 옹달샘물 대장균군의 기하 평균은 0.005 MPN/100ml이었으며, 대장균군이 검출된 곳은 21개소(19.3%)이었다. 양성에 대한 대장균 검사는 배양법과 PCR 법에서 7건 모두 일치하였다.
- 배양법 결과 기타 다른 대장균군 양성으로 나타난 시료나, 배양법 결과 음성이면서 PCR 결과 양성인 시료는 uidA를 이용한 PCR에 증폭 band가 나타나 지 않았다. 따라서 대장균을 검출하기 위해 uidA를 이용한 PCR 결과는 배양법을 통해 대장균을 검출한 결과와 완전히 일치하였다.
- ure 1은 배양법 검사 결과 대장균군 양성으로 나타난 21건의 시료를 lacZ primer를 이용하여 PCR을 실시한 결과이다. 배양법 검사 결과 대장균군 양성으로 나타난 21건 모두 lacZ primer# 이용한 PCR 결과 대장균군 양성으로 판정되었다. Fig.
- 배양법으로 검사하여 대장균으로 검출된 7건의 시료는 모두 uidA를 이용한 PCR 결과 대장균 양성으로 나타났다. 배양법 결과 기타 다른 대장균군 양성으로 나타난 시료나, 배양법 결과 음성이면서 PCR 결과 양성인 시료는 uidA를 이용한 PCR에 증폭 band가 나타나 지 않았다. 따라서 대장균을 검출하기 위해 uidA를 이용한 PCR 결과는 배양법을 통해 대장균을 검출한 결과와 완전히 일치하였다.
- ure 3과 같았다. 배양법으로 검사하여 대장균으로 검출된 7건의 시료는 모두 uidA를 이용한 PCR 결과 대장균 양성으로 나타났다. 배양법 결과 기타 다른 대장균군 양성으로 나타난 시료나, 배양법 결과 음성이면서 PCR 결과 양성인 시료는 uidA를 이용한 PCR에 증폭 band가 나타나 지 않았다.
- 배양법으로 확인한 옹달샘의 대장균군은 기하평균 0.005MPN/100mQ으로 박 등 第>의 290±]1.4 MPN/lOOnM보다 상당히 수질이 우수한 것으로 나타났다. 또한 본 실험에서 대장균군 검출 율도 19.
- 본 연구에서는 배양법으로 검사한 109건 중 17건이 PCR 결과와 일치하지 않았으며 92건은 일치하는 결과를 보였다. Bej 등新)의 연구에서는 대장균군을 검출하는 방법으로 Standard Method21) primer를 이용한 PCR과 비교하고 있다.
- 본 연구에서의 K값은 0.62로 비교적 일치도가 높았으며, 또한 McNemar test 결과 통계량이 17.00, P<0.0001로 일치도가 높았다.
- 본 연구의 결과는 Fricker 등妾’이 대장균 117주를 물에 접종하여 uidA primer를 이용한 PCR을 실시한 결과 117주 모두 양성으로 나타나 100%의 sensitivity# 나타낸 것과 일치하는 결 과이었다. uidX primer를 이용한 PCR 법은 물에서 배양법에 의해 대장균을 동정한 결과와 일치 하므로, 대장균을 신속.
- 도봉산은 배양법에서 2개소 PCR 법으로 5개소가 검출되었다. 북한산은 배양법에서 5개소에서 검출되었으나 PCR 법으로 8개 소가 검출되었고 수락산은 배양법에서 1개소 PCR 법으로 5개소가 검출되었다. 우면산 및 모락산은 배양법 및 PCR 법 모두 1개소씩 검출되었고, 불암산은 모두 2개소씩 검출되어 배양법과 PCR 법이 일치하였다.
- coli 7주(33%), Klebsiella 5주(24%), Enterobacter 4주(19%), Citrobacter 3주(14%) 및 Serratia 2주(10%) 순이었다. 옹달샘물의 대장균군을 PCR법으로 조사한 결과, 배양법의 양성건수 21건보다 17건이 많은 38건에서 양성으로 검출되었다. 대장균군 른 대장균군과 대장균의 민감도 100% 특이도 80.
- 북한산은 배양법에서 5개소에서 검출되었으나 PCR 법으로 8개 소가 검출되었고 수락산은 배양법에서 1개소 PCR 법으로 5개소가 검출되었다. 우면산 및 모락산은 배양법 및 PCR 법 모두 1개소씩 검출되었고, 불암산은 모두 2개소씩 검출되어 배양법과 PCR 법이 일치하였다.
- 배양법 검사 결과 대장균군 양성으로 나타난 21건은 모두 PCR 법에서 양성으로 나타났다. 음성으로 나타난 88건 중 17건이 PCR 검 사결과 대장균군 양성으로 나타났으며, 71건은 PCR 결과도 대장균군 음성이었다.
- 일반적으로 k 그 0.75일 때 일치도가 excellent, 0.4MKC0.75일 때 fair or good, k<0.4일 때 일치도 poor로 해석하므로, 먹는 물에서의 대장균군 검출에 lacZ primer를 이용한 PCR 법을 사용할 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
- 배양법으로는 총 21건의 대장균군이 검출되었으나, PCR 법에 의해서는 38건이 검출되었다. 지역별로는 관악산은 배양법에서 3개소이나 PCR 법으로 5개소에서 검출되었으며, 구룡산은 배양법 1개소, PCR 법 2개소, 남산은 배양법 5개소, PCR 법 7개소, 대모산은 배양법에서 검출되지 않았으나 PCR 법으로 2개 소가 검출되었다. 도봉산은 배양법에서 2개소 PCR 법으로 5개소가 검출되었다.
- 옹달샘에서 분리한 대장균군의 균종별 분포는 다음과 같았다. 총 21개소의 대장균군 양성 옹달샘에서 분리한 대장균군 중 가장 많은 비율을 차지하는 것은 E.coli 7주로 전체 대장균 군중 33%를 차지하였으며, Klebsiella 5주(24%), Entero ba c ter 4주(19%), Citrobacter 3주(14%), Serratia가. 2 주(10%) 순으로 나타났다.
- 7%로 비교적 높게 나타났다. 특히 배양법 검사 결과 대장균군 양성인 21건의 시료 모두가 lacZ primer를 이용한 PCR 결과 대장균군 양성으로 나타나 PCR 법이 수질 모니터링에 이용될 수 있는 가능성을 보여주고 있다. 이상적인 검사법은 실제 양성을 양성으로 검출하는 민감도와 실제 음성을 음성으로 검출하는 특이도를 모두 갖추고 있어야 한다.
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