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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 버섯을 이용하여 비교적 가격이 저렴하고 부작용이 없으면서 경구투여시 소화관내에서 소화효소에 대하여 보다 안정하게 약리효능을 발휘할 수 있는 우수한 고혈압 예방 제품을 개발하고자 농업과학 기술원에서 수집하여 보존된 버섯을 대상으로 이들의 일반성분과 주줄수율을 즉정하고 이들 주줄물에 대하여 항고혈압성 안지오텐신 전환효소(ACE) 저해활성을 측정하여 우수버섯을 선정한 다음, 이들로부터 ACE 저해제 추출 최적조건을 검토하였다.
제안 방법
- Cushman과 Cheung의 방법 (Cushman et al., 1997)을 일부 변형하여 다음과 같이 ACE 저해 활성을 측정하였다. 즉, 시료 50 M에 ACE 용액 150 ㎕(2.
- 즉, 물 추출물에 20 mM phosphate buffer를 5배씩 가한 후 단백질 분해효소들을 1%씩 각각 첨가하여 앞에서 기술되어 있는 각각의 작용 최적조건에서 12시간 가수분해시켰다. 가수분해후 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 다음이 가수분해물을 Whatman No. 2로 여과하여 ACE 저해활성을 측정하였다.
- 김 등(Kim et al., 1996)의 방법을 변형하여 Trypsin 등 3종류의 단백질 분해효소들을 다음과 같이 반응시켜 ACE 저해 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 즉, 물 추출물에 20 mM phosphate buffer를 5배씩 가한 후 단백질 분해효소들을 1%씩 각각 첨가하여 앞에서 기술되어 있는 각각의 작용 최적조건에서 12시간 가수분해시켰다.
- 8 ml를 취하였다. 이 상층액을 speed vac concentrator(EYELA Co., Japan)을이용하여 완전히 건조시킨 뒤 동일조건의 sodium borate buffer 1 ml를 가하여 용해시켜 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해 활성을 계산하였다. 또한 이 ACE 저해활성의 50%를 나타내는데 필요한 시료 추출물 (고형분)함량을 IC50 값으로 표시하였다.
- , 1996)의 방법을 변형하여 Trypsin 등 3종류의 단백질 분해효소들을 다음과 같이 반응시켜 ACE 저해 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 즉, 물 추출물에 20 mM phosphate buffer를 5배씩 가한 후 단백질 분해효소들을 1%씩 각각 첨가하여 앞에서 기술되어 있는 각각의 작용 최적조건에서 12시간 가수분해시켰다. 가수분해후 100℃에서 10분간 열처리해서 반응을 정지시킨 다음이 가수분해물을 Whatman No.
- 추출 수율은 추출액 일정량을 취하여 동결 건조시켜서 건물 중량을 구한 다음 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 계산하였다.
- 항고혈압 효능이 우수하며 부작용이 없는 고혈압 예방제품을 개발하고자 농업과학기술원에서 분양 받은 52종의 버섯을 대상으로 일반성분, 추출 수율, 그리고 ACE 저해활성을 조사하여 활성이 우수한 버섯을 선정한 다음 ACE 저해물질의 추출 최적조건을 검토하였다. 시료 버섯은 7.
대상 데이터
- ACE 저해 활성 측정을 위한 안지오텐신전환효소(ACE)는 ACE rabbit lung acetone powder(Sigma Co., USA)를 완충용액으로 12시간 추출하여 사용하였고 기질로는 hippuryl-L-histidyl-L-leucine(Hip-His-Leu, Sigma Co., USA)을 사용하였다. 단백질 가수분해 효소로 pepsin(돼지 위점막 기원, 최적 작용조건; 37℃, pH 2.
- , USA)을 사용하였다. 단백질 가수분해 효소로 pepsin(돼지 위점막 기원, 최적 작용조건; 37℃, pH 2.0)과 trypsin(돼지 췌장 기원, 25℃, pH 7.6)은 Sigma사 제품(USA)을 사용하였고 protease ^(Bacillus subtilis 기원, 55℃, pH 7.0)은 Aman사 제품(Japan)을 사용하였다. 기타 일반 시약과 유기 용매는 일급 또는 특급품을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 버섯은 비늘 버섯(Pholiota spp.) 18시료, 차가버섯(Inonotus obliquus) 2시료, 망태 버섯 (Dictyophora echinovolvata) 2시료, 잎새 버섯(Grifola frondosd) 9시료, 장수 버섯 fraxined) 9시료의 자실체와 꽃송이 버섯(Sparassfs crispd) 4시료, 차가버섯 (ASI 74006부터 74013까지) 7시료, 신령버섯(Agaricus blazei) 1시료 등의 균사체를 농업과학기술원으로부터 분양 받아 즉시 동결 건조하여 분쇄 후 분말로 하여 사용하였다.
이론/모형
- 동결 건조 시킨 시료의 일반 성분은 AOAC법(Kenneth, 1995)에 따라, 조회분은 직접 회화법으로 측정하였고 조단백질은 Kjeldahl법 , 조지방은 Soxhlet 추출법으로 정량하였으며 탄수화물을 함량은 고형분의 총량에서 조회분, 조단백질 그리고 조지방의 함량을 뺀 값으로 나타내었다 (이 등, 2000).
성능/효과
- 가장 ACE 저해 활성이 강하였던 비늘 버섯 ASI 24012 자실체로 부터 ACE 저해물질을 대량으로 얻기 위해 추출 최적조건을 검토한 결과 추출온도는 30℃가 제일 좋았고 1시간 추출시 제일 높은 ACE 저해 활성을 보였으며 추출 시간이 길어짐에 따라 거의 변화가 없었다(Fig. 1). 따라서 ACE 저해제 추출 최적 조건은 비늘 버섯 자실체의 동결건조 분말을 물에 1 : 40으로 현탁 시킨 후 30℃에서 1 시간 추출하는것이며 이때 ACE 저해활성이 67.
- 6%의 탄수화물을 각각 함유하고 있었으며 비늘버섯 ASI 24027 자실체의 물 추출물 수율이 68%로 제일 높았다. 그러나 ACE 저해활성은 비늘 버섯 ASI 24012 균주의 자실체를 물 추출로부터 얻은 추출물(IC50 0.45 mg)에서 가장 높았다. 그리고 이 버섯의 ACE 저해물질 최적추출 조건은 자실체 분말을 물로 30℃에서 1시간 추출했을 때 가장 많이 용출 되었으며 이때 ACE 저해활성도도 67.
- 따라서 ACE 저해 활성을 가진 peptideS 대량생산하기 위해 시료 버섯의 물 추출물에 대한 단백질분해효소처리 효과를 조사한 결과(Table 2), 비늘 버섯의 경우 단백질분해효소를 처리한 시료의 ACE 저해활성이 단백질 분해효소를 처리하지 않은 물 추출물보다 오히려 낮았다. 그러나 꽃송이 버섯 ASI 150010, ASI 150011 균사체의 pepsin 가수분해물에서 각각 57%와 61%의 비교적 높은 ACE 저해 활성을 보였고, 꽃송이 버섯 ASI 150016 균사체의 경우는 trypsin 가수분해물에서 53%의 ACE 저해활성을 보였다. 잎새버섯은 pepsin을 처리한 모든 시료에서 ACE 저해활성이 무처리에 비하여 약간 높아졌고 trypsin을 처리한 시료에서는 비슷하거나 약간 감소하였다.
- 45 mg)에서 가장 높았다. 그리고 이 버섯의 ACE 저해물질 최적추출 조건은 자실체 분말을 물로 30℃에서 1시간 추출했을 때 가장 많이 용출 되었으며 이때 ACE 저해활성도도 67.6%(IC50: 0.20 mg)로 가장 높았다.
- 4%로 비교적 적게 함유되어 있었다. 그리고 탄수화물 함량은 30.3~86.6%로 일반 성분의 대부분을 차지하였으며 특히 비늘 버섯 ASI 24002 자실체가 86.6%로 가장 많이 함유하고 있었다.
- , 1996). 따라서 ACE 저해 활성을 가진 peptideS 대량생산하기 위해 시료 버섯의 물 추출물에 대한 단백질분해효소처리 효과를 조사한 결과(Table 2), 비늘 버섯의 경우 단백질분해효소를 처리한 시료의 ACE 저해활성이 단백질 분해효소를 처리하지 않은 물 추출물보다 오히려 낮았다. 그러나 꽃송이 버섯 ASI 150010, ASI 150011 균사체의 pepsin 가수분해물에서 각각 57%와 61%의 비교적 높은 ACE 저해 활성을 보였고, 꽃송이 버섯 ASI 150016 균사체의 경우는 trypsin 가수분해물에서 53%의 ACE 저해활성을 보였다.
- 다른 두 유기용매 추출보다 수율이 높았다. 물 추출 시 추출수율은 비늘 버섯 중 AS1 24027 균주의 자실체가 68%로 가장 높았고 그 다음은 차가버섯 (ASI 74012)의 자실체에서 57%, 잎새버섯(ASI 9006과 9012)의 자실체에서 각각 45%이었다, 그리고 메탄올 추출시는 장수버섯 중 ASI 17001 균주의 자실체가 41%의 최고 수율을 보였다 (Table 1).
- 저해물질의 추출 최적조건을 검토하였다. 시료 버섯은 7.1~56.5%의 조단백질과 0.2~4.4%의 조지방 및 30.3~86.6%의 탄수화물을 각각 함유하고 있었으며 비늘버섯 ASI 24027 자실체의 물 추출물 수율이 68%로 제일 높았다. 그러나 ACE 저해활성은 비늘 버섯 ASI 24012 균주의 자실체를 물 추출로부터 얻은 추출물(IC50 0.
- 시료버섯 52종에 대하여 물과 70%의 에탄올 및 메탄올을 용매로 사용하여 주줄 수율을 조사한 결과 대체로 물 추출물이 다른 두 유기용매 추출보다 수율이 높았다. 물 추출 시 추출수율은 비늘 버섯 중 AS1 24027 균주의 자실체가 68%로 가장 높았고 그 다음은 차가버섯 (ASI 74012)의 자실체에서 57%, 잎새버섯(ASI 9006과 9012)의 자실체에서 각각 45%이었다, 그리고 메탄올 추출시는 장수버섯 중 ASI 17001 균주의 자실체가 41%의 최고 수율을 보였다 (Table 1).
- 시료버섯에 대한 각각의 추출물들의 ACE 저해활성을 측정 한 결과 Table 2와 같이 물 추출물시 비늘버섯 중 ASI 24012 균주의 자실체가 66%(IC50 : 0.25 mg)로 가장 우수하였고 그 다음은 잎새 버섯(ASI 9021)의 자실체가 61%(IC30 : 0.28 mg)이었다. 한편 에탄올 및 메탄올 추출물에서는 신령버섯(ASI 1174)의 균사체가 각각 58.
- 같다. 조단백질 함량은 7.1~56.5%로 버섯마다 다양하였으며 특히 잎새 버섯 중 ASI 9006 균주의 자실체는 단백질 함량이 56.5%로 가장 높았다. 조지방 함량은 모든 시료 버섯에서 0.
- 5%로 가장 높았다. 조지방 함량은 모든 시료 버섯에서 0.2~4.4%로 비교적 적게 함유되어 있었다. 그리고 탄수화물 함량은 30.
- 한편, 버섯 중의 ACE 저해물질의 추출용매로는 대체적으로 물이 적합한 것으로 추정되었으나 신령 버섯 ASI 1174 균주의 균사체 경우 에탄올 추출이 더 좋았다. 이와 같이 물 추출물에서 다른 용매 추출물보다 ACE 저해활성이 높은 것은 지금까지 ACE 저해활성을 나타내는 물질로 알려진 것은 대부분이 peptide나 단백질 가수분해물이고(Rhyu et al.
후속연구
- 추출수율을 70% 이상으로 높이기 위하여 앞으로 추가연구가 필요할 것으로 생각되며 또한 일반적으로 식용에는 물 추출물이 유리하고 가공 제품 개발시는 유효성분의 추출과 농축이 유리한 에탄올 추출물이 더 적합할 것으로 판단되었다.
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