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문제 정의
- 그러나 아직까지 강황의 생리활성 물질인 curcumin에 대한 산업적 응용을 위한 초임계 추출의 최적조건이 확립되지 않았으며, 강황의 초임계 추출물과 다른 추출 방법으로 추출된 강황 추출물의 생리적 특성을 비교한 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구는 예비실험을 통해 최적 초임계 추출조건으로 추출한 curcumin과 열수 및 에탄올로 추출한 curcumin의 생리활성 효과를 조사·비교하여 초임계 유체 추출한 curcumin의 활용가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 실험하였다. 1mM NaNO2 용액 1 mL에 시료용액 0.6 mL을가하고 여기에 0.1 N HCl 및 0.2M 구연산 완충용액을 사용하여 반응용액의 pH를 각각 1.2, 4.2 및 6.0으로 조정한 후 반응용액을 10mL로 제조하였다. 이 용액을 37℃에서 1시간동안 반응시 킨 후 1 mL를 취하고 여기에 2% acetic acid 5mL과 Griess 시약 0.
- Maron과 Ames(6)의 방법에 따라 실험하였는데, 미리 멸균한 cap tube에 시료농도의 증가에 따른 돌연변이성을 확인하기 위해 분석시료제조 방법에 따라 제조한 sample 용액을 농도별로 preincubation 시킨 후 이것을 top agar 2mL와 혼합한 후 최소 평판배지 (minimal glucose agar plate)에 도말하여 37℃에서 48 시간 배양 후 배지상의 revertant colony 숫자를 계수하였다. 이때 spontaneous colony의 개수보다 2배 이상이면 돌연변이성이 있는 것으로 판단한다.
- 전처리를 거친 시료를 HPLC(Agilent, 1100 Series, Hewlett Packard, USA)로 curcumin의 함량을 분석하였다. Columne Zorbax Eclipse C18(4.
- 보관하면서 공시재료로 사용하였다. 초임계 추출물은 예비실험을 통해 curcumin 추출 수율이 높았던 압력 250 bar, 온도 40℃, 보조용매(에탄올) 유속 3mL/min 조건에서 3시간 추출하고 보조용매 에탄올을 가하여 200 mL로 정용하였고, 에탄올 추출물은 에탄올 100 mL에 강황분 5 g을 첨가하여 70℃ 온도에서 2시간 동안 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 200 mL에 강황분 10 g을 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 추출하였다. 모든 추출물은 12,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후 membrane filter(0.
- 반응조에 시료인 우지를 3 g 취한 후 120℃로 조절된 aluminium heating block상에서 시간당 20L의 여과된 공기를 주입하여 산화시켰다. 항산화력은 추출물을 첨가하지 않은 유지시료를 대조구로 하여 유도기간(hour)을 계산하였다.
대상 데이터
- Columne Zorbax Eclipse C18(4.6mm×150mm×5 ㎛)을 사용하였고, Mobile phase는 Methanol 100%, 유속은 0.8 mL/min 으로 하였다. DAD(UV 424 nm)로 검출하였고, Injection volumee 10 μL 였다.
- Ames(6)의 방법에 따라 조제하였다. S9 mixture는 S9fraction(10%)을 MgCl-KCl 염(2%), 1 M glucose-6-phosphate (0.5%), 1M NADP(4%), 0.2 M phosphate buffer(pH 7.4)와 멸균수와 혼합하여 실험에 사용하였다.
- Maron과 Ames(6)의 방법에 따라 실험하였다. Salmonella typhimurium TA98(KCTC2053), Salmonella typhimurium TA 100(KCTC2054)는 유전형질 등을 확인한 후 실험에 사용하였다.
- DAD(UV 424 nm)로 검출하였고, Injection volumee 10 μL 였다. Standard curcumine Sigma사의 curcumin을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 강황은 2001년 인도에서 재배된 Madras 산 finger형을 분쇄하여 알미늄 파우치에 밀봉한 상태로 4℃ 냉장 보관하면서 공시재료로 사용하였다. 초임계 추출물은 예비실험을 통해 curcumin 추출 수율이 높았던 압력 250 bar, 온도 40℃, 보조용매(에탄올) 유속 3mL/min 조건에서 3시간 추출하고 보조용매 에탄올을 가하여 200 mL로 정용하였고, 에탄올 추출물은 에탄올 100 mL에 강황분 5 g을 첨가하여 70℃ 온도에서 2시간 동안 추출하였고, 열수 추출물은 증류수 200 mL에 강황분 10 g을 첨가하여 100℃에서 2시간 동안 추출하였다.
- 사용한 변이원은 직접변이원으로 2-nitrofluorene(3 ㎍/plate; Aldrich Co.; 2-NF)을 사용하였고 간접변이원으로는 2-acetamido fluorene(10 ㎍/plate; Sigma Co.; 2-AF)을 사용하였다. 돌연변이 억제 효과(inhibition rate)는 다음의 식을 이용하여 계산하였다.
이론/모형
- Maron과 Ames(6)의 방법에 따라 실험하였다. Salmonella typhimurium TA98(KCTC2053), Salmonella typhimurium TA 100(KCTC2054)는 유전형질 등을 확인한 후 실험에 사용하였다.
- Maron과 Ames(6)의 방법을 이용하여 preincubation mutagenicity test로 검토하였다.
- Rancimat(Model743, metrohm, Switzerland)를 이용한 conductometric determination method(CDM)(5)으로 평가하였다. 반응조에 시료인 우지를 3 g 취한 후 120℃로 조절된 aluminium heating block상에서 시간당 20L의 여과된 공기를 주입하여 산화시켰다.
- nitrite 분해능은 Kato(7)의 방법으로 실험하였다. 1mM NaNO2 용액 1 mL에 시료용액 0.
- 간접 돌연변이원을 활성화시키기 위해서 Maron과 Ames(6)의 방법에 따라 조제하였다. S9 mixture는 S9fraction(10%)을 MgCl-KCl 염(2%), 1 M glucose-6-phosphate (0.
성능/효과
- Table 4에 간접변이원 2-AF에 유도된 TA98의 항돌연변이율을 나타내었다. 2-AF로 유도된 TA98은 SFE extract를 0.1mL/plate로 처리시 12.2%의 항 돌연변이율을 보였으며, 또한 알코올 추출물과 수용성 추출물은 간접변이원 2-AF에 유도된 TA98에 0.1mL/plate로 처리시 항돌연변이 효과가 나타나지 않았다. Soni 등(11)은 tumeric의 알코올 및 수용성 추출물에서 S9대사 aflatoxin에 의해 유도된 Salmonella typhimurium TA98, TA100에서 80%의 돌연변이 억제효과가 있음을 보고하였고, Nagabhushan 등(12)은 tumeric을 알코올로 추출한 추출물의 농도가 125 ㎍/plate에서는 benzo(a) pyrene, dimetyl benzanthracene 변이원에서는 50%의 돌연변이 억제효과가 있었으며 , 500 ㎍/plate 농도는 benzo(a)pyrene의 경우 75%, dimethylbenzanthracene는 80%의 돌연변이 억제효과가 있었음을 보고하였다.
- 세포내의 DNA에 직접적으로 손상을 주어 돌연변이를 유발하는 물질로 알려진 변이원 2-nitrofuorene(3 |iL/plate; 2-NF)으로 유도된 Salmonella typhimurium TA98에 대한 강황 추출물의 항돌연변이율은 Table 4와 같다. 3종의 추출물 중 초임계추출물의 저해율이 20.1%로 가장 높은 항돌연변이율을 나타냈으며, 에탄올과 열수추출물은 각각 9.3%, 15.2%의 항돌연변이율을 나타내었다. 이(10)는 직접변이원 2-NF로 유도된 Salmonella typhimurium TA98에서 강황의 열수 추출물을 0.
- 71%의 분해율을 나타냈다. Nitrite 분해율은 pH가 1.2일 때 가장 우수하였고, pH가 높아질수록 분해율이 낮았다. 이 결과는 김 등(13)이 강황 추출물과 카레 원료인 여러 향신료 추출물의 nitrite 분해율이 pH 1.
- 본 실험의 pH 1.2, 4.2, 6.0 조건 모두에서 초임계 추출물이 에탄올 추출물, 열수 추출물 보다 nitrite 분해율이 우수하였다.
- 에탄올 추출물, 열수 추출물, 초임계 추출물의 돌연변이성 유무를 확인한 결과 Table 2, 3와 같이 강황 추출물들은 his+ revertant colony수의 증감이 대조구, TA98, TA100의 자연돌연변이 수 59, 57보다 2배 이상 증가시킨 추출물은 없는 것으로 확인되었다. 따라서 강황추출물이 원인이 되어 돌연변이를 유발하지 않는 것으로 판단되었다.
- 초임계 추출, 에탄올 추출, 열수 추출에 의한 각 추출물의 curcumin 함량을 HPLC로 분석한 결과, 초임계 추출물은 1.89%, 에탄올 추출물은 2.55%, 열수 추출물은 0.004%로 열수 추출물의 함량이 가장 낮게 나타났다. 이는 curcumin이 소수성의 물에 녹지 않는 물질이므로 일반적인 열수 추출 조건에서는 추출되지 않는 것으로 생각된다.
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