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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 전보(5)에 따라 제조한 양파김치에 대한 항암 및 면역활성에 대하여 조사하였다.
제안 방법
- 1 % N-1 -naphthyl-ethylendiamine in H2O : 1% sulfanilamide in 5% H3PO4=1:1)을 동량 첨가하여 10분간 반응시킨 후, microplate reader(Titertek Multiscan Plus, Finland)로 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite의 농도는 sodium nitrite에 의한 표준 곡선과 비교하여 계산하였다.
- 분비하는 물질은 여러가지가 알려져 있지만, 그 중 하나가 일산화질소(nitric oxide)이다(23, 24). 따라서 양파김치의 대식 세포 활성화여부를 탐색하기 위하여 대식 세포주인 RAW 264.7에 양파 및 양파김 치 추출물을 농도별로 처리하여 48시간 배양한 후, 배양액 중 대식세포가 생산한 NO로부터 산화된 NO2-농도를 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 양파 추출물을 10, 100 및 1,000μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서는 NO의 생성량이 각각 0.
- 따른 증식정도를 측정하였다. 비장세포 증식측정은 배양 72시간 후, Cell titer 96®Aqueous One Solution Cell proliferation Assay(16)를 사용하여 각각 배양된 배양액 100μL에 Cell titer 15μL씩 첨가하여 4~8시간 동안 배양한 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 생후 8주된 생쥐(BALB/c, female) 암컷에서 분리한 비장세포에서 spleenocyte를 분리하여 96 well plate(NUNC™, DEN)에 넣고 여기에 시료를 농도별로 넣어 배양한 다음 각 조건에 따른 증식정도를 측정하였다. 비장세포 증식측정은 배양 72시간 후, Cell titer 96®Aqueous One Solution Cell proliferation Assay(16)를 사용하여 각각 배양된 배양액 100μL에 Cell titer 15μL씩 첨가하여 4~8시간 동안 배양한 다음 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 양파 1 kg을 15% 소금물 1 L에 2시간 절인 후 1회 수세하여 사용하였으며 , 기본 양념으로는 파 20 g, 마늘 20 g, 생강 10 g, 고춧가루 25 g, 액젖 35 g을 넣어 제조하였다.
- 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 Ames mutagenity test로 항돌연변이성을 확인하기 위해 aflatoxin Bi(2.0 Ug/plate)로 돌연변이를 유도한 Salmonella typhimurium TA 98 및 TA 100 균주에 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 revertant/plate수를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 양파 메탄올 추출물을 50, 100 및 150 ppm으로 처리시 돌연변이 억제율이 TA 98 균주에서는 각각 35.
- 양파 및 양파김치 메탄올 추출물은 A549 및 MCF-7 암세포주에 처리한 결과 추출물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 1,000 μg/mL 농도에서 모두 20% 이상 그 성장을 억제하였다. 양파김치 메탄올 추출물은 농도에 비례하여 비장세포의 증식을 유도하였고, 양파 추출물보다 더 높은 증식을 유도하였다. 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 처리한 대식세포주에서 NO의 생성이 농도 의존적으로 증가하였으며, 역시 양파김치 추출물이 양파 추출물보다 더 많은 NO을 생성량을 유도하였다.
- 위와 같이 제조한 양파김치를 동결건조 시켜 잘게 부순 다음 메탄올을 첨가하여 상온에서 12시간 동안 침지시킨 후 여과하여 rotary vacuum evaporator로 40℃에서 감압 농축한 후 DMSO에 용해시켜 0.45μm membrane filter로 여과한 후 각종 생리활성측정을 위한 시료로 사용하였다.
- 즉, ice bath상에서 S-9 mixture 0.5 mL(직접 돌연변이원의 경우 phosphate buffer 0.5 mL), 하룻밤 배양한 균주(1~2 X 109 cell/mL) 0.1 mL, 시료와 돌연변이 원을 각각 0.1 mL를 cap tube에 넣고 가볍 게 교반하여 37℃에서 30분간 예비 배양한 후 45℃의 top agar를 첨가하여 3초간 교반하여 minimal glucose agar plate에 도말하고 37℃에서 48시간 배양한 후 severtant 숫자를 헤아려 돌연변이 및 항돌연변이 유무를 판정하였다.
대상 데이터
- RPMI 1640 배지는 Gibco BRL(Grand Island, NY, USA) 제품 FBS(fetal calf serum)은 PAA제품, 2-ME(2-mercap-toethanol), sodium bicarbonateCNaHCOa), N-l-naphthyl-ethylen-diamine 및 SRB(Sulforhodamine B)는 Sigma제품(USA)을 사용하였으며, Cell titer96®Aqueous One Solution은 Promega(Madison, USA) 제품을 사용하였다.
- 생쥐(BALB/c, female)로부터 분리 한 spleen을 single 세포로 만들어 세척한 다음 10% FBS RPMI 1640 배지로 희석하여 실험에 사용하였다(15).
- 암세포는 인체 폐암세포주인 A549 및 인체 유방암 세포주인 MCF-7을 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 계대배양하면서 실험에 사용하였다. Monolayer로 자란 암세포주를 0.
- 양파(Allium cepa L.)는 전남 무안에서 생산된 것을 구입하였으며, 기타 김치제조를 위한 재료는 순천시내의 재래시장 및 마트에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- Significant differences were compared with control at **p<0.01 by Student t-test.
- Significant differences were compared with control at *p<0.05 and **p<0.01 by Student t-test.
- 실험 결과는 평균(mean) + 표준편차(SD)로 나타내었고 Student t-test를 이용하여 통계처리한 후 p <0.05, p<0.01 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 안정 된 NO 산화물인 NCfelnitrite)는 Griess 반응을 이용하여 측정하였다(17). 세포배양 상층액을 96 well plate '(NUNC™, DEN)에 100μL씩 넣고, 여기에 Griess 시약(0.
- 25% trypsin-EDTA용액으로 처리하여 single cell로 만든 후 최종 세포 농도가 2x lV cells/mL 되도록 희석하여 24 well plate(NUNC™, DEN) 에 각 well 당 900 μL씩 seeding한 다음 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 preincubation하였다. 여기에 양파김치 추출물 희석액을 100μL씩 농도별로 첨가하고 48시간 배양한 후 세포증식 정도를 SRB 방법(14)에 의하여 측정하였다.
- 항돌연변이 실험은 Salmonella typhymurium TA98 및 100 균주를 이용하여 Maron과 Ames의 방법(13)으로 실험하였으며, 이때 돌연변이원으로는 aflatoxin Bi을 사용하였다. 즉, ice bath상에서 S-9 mixture 0.
성능/효과
- 따라서 본 실험의 결과도 양파 및 양파김치 추출물이 비장세포의 증식을 촉진하여 면역능을 증진시키는 것으로 생각된다. 또한 상기의 실험결과에서 비록 양파 및 양파김치 추출물이 암세포에 대한 세포독성을 나타내었으나, 이들은 옛부터 우리들이 식품으로 이용하여 왔으므로 인체의 독성에 대한 문제점이 없으리라 생각되며, 본 실험에서 비장세포에 대하여는 1,000 Pg/mL 농도에서도 독성을 나타내기보다는 오히려 세포를 증식을 시키는 효과를 나타내어 정상세포에 대한 독성에는 문제가 없으리라 생각된다.
- 따라서 이전의 연구결과와 본 실험의 결과를 종합하여 볼 때 양파 김치 추출물의 암세포주 성장억제 효과는 양파에 함유되어 있는 allicin을 비롯한 함황화합물과 양파김치 숙성 중 생성되는 여러가지 성분들에 의해 시너지 효과를 발생하여 양파보다 양파김치 에서 높은 암세포주 성장억제효과를 나타낸다고 생각된다.
- 1). 또한 MCF-7 세포주에 대하여 양파 추출물은 같은 농도로 첨가시 각각 5.1, 12.7 및 18.6%의 억제율을 나타내었으며, 양파김치 추출물을 각각 5.9, 10.2 및 23.7%의 억 제율을 나타내어 (Fig. 2), 양파 및 양파김치 추출물을 1,000μg/mL 농도로 첨가시 대조구에 비하여 모두 20% 이상의 암세포 성장을 억제하였으며, 특히, 양파 김치 추출물 첨가시 그 효과가 더욱 높게 나타났다.
- 또한 상기의 실험결과에서 비록 양파 및 양파김치 추출물이 암세포에 대한 세포독성을 나타내었으나, 이들은 옛부터 우리들이 식품으로 이용하여 왔으므로 인체의 독성에 대한 문제점이 없으리라 생각되며, 본 실험에서 비장세포에 대하여는 1,000 Pg/mL 농도에서도 독성을 나타내기보다는 오히려 세포를 증식을 시키는 효과를 나타내어 정상세포에 대한 독성에는 문제가 없으리라 생각된다.
- 279로 대조구와 비교하여 매우 높은 증식 효과를 나타내었다. 또한 양파김 치 추출물은 10 Ug/mL 의 농도로 첨가하였을 때도 그 값이 1.205로 대조구와 비교하여 매우 높은 비장세포의 증식효과를 나타내었으며, 양파추출물보다 양파김치 추출물의 처리구에서 더 높은 비장세포의 증식효과를 나타내었다(Fig. 3).
- 0%로써 대조구에 비하여 높게 나타났다. 또한 양파김치 추출물의 처리시 TA 98 균주에서 돌연변이 억제율은 각각 51.6, 67.1 및 72.2%를 나타내 었고, TA 100 균주에서는 각각 38.2, 49.8 및 69.8%를 나타내어 농도에 의존적으로 돌연변이가 감소됨을 알 수 있었고, 양파김치 추출물 처리구의 감소율이 양파 추출물 처리구의 감소율보다 높게 나타났다.
- 생쥐 비장세포의 증식에 미치는 양파 및 양파김치의 영향을 측정 하기 위하여 비장세포에 양파와 양파김치 추출물을 10, 100 및 1,000 μg/mL 농도로 처리하여 세포의 증식정도를 흡광도로 측정한 결과 농도 의존적으로 비장세포의 증식을 확인할 수 있었는데, 양파 추출물을 10 Ug/mL 농도로 첨가시 대조구 흡광도 값 1.089와 비교하여 큰 차이를 나타내지 않았지만 100 및 1,000μg/mL의 농도로 첨가하였을 때는 각각 흡광도 값이 1.241과 1.279로 대조구와 비교하여 매우 높은 증식 효과를 나타내었다. 또한 양파김 치 추출물은 10 Ug/mL 의 농도로 첨가하였을 때도 그 값이 1.
- 0 Ug/plate)로 돌연변이를 유도한 Salmonella typhimurium TA 98 및 TA 100 균주에 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 농도별로 처리한 후 revertant/plate수를 측정한 결과는 Table 1과 같다. 양파 메탄올 추출물을 50, 100 및 150 ppm으로 처리시 돌연변이 억제율이 TA 98 균주에서는 각각 35.1, 49.6 및 68.6%이 었고, TA 100 균주에서는 각각 32.4, 45.5 및 66.0%로써 대조구에 비하여 높게 나타났다. 또한 양파김치 추출물의 처리시 TA 98 균주에서 돌연변이 억제율은 각각 51.
- 양파 및 양파김치 메탄올 추출물은 aflatoxin B1로 돌연변이를 유도한 Salmonella typhimurium에 대하여 농도 의존적으로 항돌연변이 효과가 큰 것으로 나타났으며, 양파김치 첨가군이 양파의 첨가군보다 그 효과가 더욱 크게 나타났다. 양파 및 양파김치 메탄올 추출물은 A549 및 MCF-7 암세포주에 처리한 결과 추출물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 1,000 μg/mL 농도에서 모두 20% 이상 그 성장을 억제하였다. 양파김치 메탄올 추출물은 농도에 비례하여 비장세포의 증식을 유도하였고, 양파 추출물보다 더 높은 증식을 유도하였다.
- 다음과 같다. 양파 및 양파김치 메탄올 추출물은 aflatoxin B1로 돌연변이를 유도한 Salmonella typhimurium에 대하여 농도 의존적으로 항돌연변이 효과가 큰 것으로 나타났으며, 양파김치 첨가군이 양파의 첨가군보다 그 효과가 더욱 크게 나타났다. 양파 및 양파김치 메탄올 추출물은 A549 및 MCF-7 암세포주에 처리한 결과 추출물을 처리하지 않은 대조구에 비하여 1,000 μg/mL 농도에서 모두 20% 이상 그 성장을 억제하였다.
- 양파김치 메탄올 추출물은 농도에 비례하여 비장세포의 증식을 유도하였고, 양파 추출물보다 더 높은 증식을 유도하였다. 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 처리한 대식세포주에서 NO의 생성이 농도 의존적으로 증가하였으며, 역시 양파김치 추출물이 양파 추출물보다 더 많은 NO을 생성량을 유도하였다.
- 양파 및 양파김치의 암세포 성장 억제 효과를 측정하기 위하여 양파 및 양파김치 메탄올 추출물을 폐암 세포주(A549)와 유방암 세포주(MCF-7)에 농도별로 첨가한 후 세포의 성장 억제율을 측정한 결과 양파 추출물을 10,100 및 1,000 ng/mL 농도로 첨가시 A549 세포주의 증식 억제율은 각각 5.6, 11.2 및 23.7%으로 나타났으며, 양파 김치 추출물을 같은 농도로 첨가시 각각 8.4, 15.0 및 30.0%로 나타났다(Fig. 1). 또한 MCF-7 세포주에 대하여 양파 추출물은 같은 농도로 첨가시 각각 5.
- 4와 같다. 양파 추출물을 10, 100 및 1,000μg/mL의 농도로 처리한 실험구에서는 NO의 생성량이 각각 0.738, 1.012 및 1.09411M로 나타났고, 양파김치 추출물 첨가구에서는 각각 0.706, 1.284 및 1.406 μM로 나타나 무처리 대조구 0.727 μM에 비해 양파 및 양파김치 추출물의 처리구에서 NO의 생성량이 더 높게 나타났고, 양파 추출물보다는 양파김치 추출물에서 NO 생성량이 더 많은 것으로 나타났으며, 그 생성량은 추출물의 농도에 의존적으로 높게 나타났다.
후속연구
- 따라서 본 실험 에서도 양파김치 메탄올 추출물 투여군에서 더 많은 NO 생성량을 나타내었는데, 이러한 요인 중의 하나로 유산균의 영향을 추측할 수 있으나, 보다 구체적인 것은 추후 이것에 관한 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
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